離子對(duì)雙水相萃取分離吡咯喹啉醌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種離子對(duì)雙水相萃取分離化咯哇嘟釀的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 化咯哇嘟釀（Pyrroloquinolinequinine,PQ曲是一種水溶性釀?lì)惢衔?，是葡?糖脫氨酶和乙醇脫氨酶的輔酶，被認(rèn)為是新的B族維生素（化化re2003 ;422:832)。PQQ分 子量為330,最早是在微生物中發(fā)現(xiàn)，隨后研究表明其也存在于動(dòng)植物體內(nèi)，結(jié)構(gòu)式如下式 所示：
[0003]
[0004] 目前已證明PQQ具有重要的生理功能，比如維持皮膚健康、刺激神經(jīng)生長因子、增 強(qiáng)免疫功能、促進(jìn)細(xì)胞生長、抗氧化、清除自由基、增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)極端環(huán)境條件的耐受性W及 參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等。在醫(yī)藥領(lǐng)域，PQQ具有防治肝損傷、保護(hù)神經(jīng)組織、刺激能量生成、強(qiáng) 化免疫等生理功能。因此，可W用于治療帕金森綜合癥、老年癡呆、屯、臟病、肝硬化等。在畜 禽養(yǎng)殖業(yè)中，PQQ作為一種新型類維生素物質(zhì)，可促進(jìn)機(jī)體生長、提高繁殖、抗氧化、抗應(yīng)激 和增強(qiáng)免疫，比如在飼料中添加適量PQQ可W在一定程度上提高蛋雞產(chǎn)蛋率和雞蛋品質(zhì)， 并能顯著提高蛋雞的抗氧化能力。由于其獨(dú)特的理化性質(zhì)和多樣的生理功能，可用于食品、 醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域，具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景。 陽0化]在PQQ生產(chǎn)中，從混合物中分離純化PQQ，獲得高純度產(chǎn)品是至關(guān)重要的步驟。但 是，PQQ水溶性強(qiáng)、反應(yīng)液中濃度低，普通萃取方法萃取效率低、選擇性差，嚴(yán)重制約著PQQ 的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。因此，尋找一種簡便高效的分離純化方法迫在眉睫。
[0006] 雙水相萃取體系是一種性質(zhì)溫和的分離體系，可適用于生物化工、金屬及絡(luò)合物 的分離、中草藥中有效成分的提取及有機(jī)物的分離等領(lǐng)域。該體系具有體系簡單、原料價(jià) 廉、低毒、無乳化現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)，是一種具有潛在工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值的分離體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種離子對(duì)雙水相萃取分離化咯哇嘟釀的方 法，該方法能夠簡單、高效分離得到化咯哇嘟釀。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：離子對(duì)雙水相萃取分離化咯哇 嘟釀的方法，包括W下步驟：
[0009] (1)制備：利用化咯哇嘟釀生產(chǎn)菌制備含有化咯哇嘟釀的混合液；
[0010] (2)萃取：采用離子對(duì)雙水相萃取體系對(duì)含有化咯哇嘟釀的混合液進(jìn)行萃取，分 離上層，對(duì)下層進(jìn)行重復(fù)萃取，合并分離的上層，得到富含化咯哇嘟釀的有機(jī)層；其中，萃取 體系由離子對(duì)試劑和憐酸氨鋼緩沖液（PB)組成，離子對(duì)試劑和憐酸氨鋼緩沖液的體積比 為 3_5:1_2 ;
[0011] (3)分離：將富含化咯哇嘟釀的有機(jī)層上陰離子交換樹脂，依次用雙蒸水、稀酸沖 洗，收集稀酸部位，冷凍干燥，得到化咯哇嘟釀粗品；
[0012] (4)純化：將化咯哇嘟釀粗品用超純水溶解，抑調(diào)至3~4,加入乙醇，攬拌后靜 置，得到化咯哇嘟釀。
[0013] 所述含有化咯哇嘟釀的混合液為化咯哇嘟釀生產(chǎn)菌發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液。
[0014] 步驟（2)萃取時(shí)萃取體系和含有化咯哇嘟釀的混合液的體積比為4-7:2-4。
[0015] 所述離子對(duì)試劑為四下基氨氧化錠溶液，濃度為0.5-1. 5mol/L。
[0016] 所述憐酸氨鋼緩沖液濃度為0. 1-0. 9mol/L，抑值為4. 5-6. 5。
[0017] 所述陰離子交換樹脂為WA30型弱陰離子交換樹脂。
[0018] 所述稀酸為體積分?jǐn)?shù)0.5-1 %的稀鹽酸。
[0019] 步驟（4)中化咯哇嘟釀粗品用超純水溶解至終濃度為9-12邑/1，超純水與乙醇的 體積比為3-5:1。
[0020] 步驟（4)中調(diào)節(jié)抑所用試劑為鹽酸。
[0021]步驟（4)中攬拌溫度為20-25°C，攬拌時(shí)間為5-化，靜置時(shí)間為12-2地。
[0022] 本發(fā)明離子對(duì)雙水相萃取分離化咯哇嘟釀的方法的原理如下所示：
[0024] 本發(fā)明有益效果：
[00巧]1、雙水相體系是一類新型萃取分離體系，它是由水溶性有機(jī)小分子和一種鹽的水 溶液在一定濃度下混合自發(fā)形成的兩相體系。本發(fā)明根據(jù)PQQ結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，即PQQ的結(jié)構(gòu) 中包含3個(gè)簇基，顯示酸性，利用離子對(duì)雙水相體系對(duì)其進(jìn)行分離純化。
[00%] 2、本發(fā)明采用四下基氨氧化錠作為離子對(duì)試劑，與PQQ結(jié)合在一起，使PQQ選擇性 的分配在有機(jī)相中，而其他水溶性雜質(zhì)分配到水相中，從而達(dá)到高效性、高選擇性地分離純 化PQQ。
[0027] 3、本發(fā)明通過優(yōu)化萃取體系與含有化咯哇嘟釀的混合液的比例，和離子對(duì)試劑與 憐酸氨鋼緩沖液的比例，最大程度上提高了分離純化得到的化咯哇嘟釀的純度和化咯哇 嘟釀的回收率。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明分離得到的化咯哇嘟釀純度可達(dá)99%W上，回收率可達(dá) 85%W上。
[0028] 4、本發(fā)明的方法工藝操作簡單、成本低廉、便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)促進(jìn)PQQ的 產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。
【附圖說明】
[0029] W下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0030] 圖1為紫外光譜分析結(jié)果，其中，A為PQQ樣品，B為本發(fā)明結(jié)晶產(chǎn)物；
[0031] 圖2為本發(fā)明結(jié)晶產(chǎn)物的質(zhì)譜分析結(jié)果；
[0032] 圖3為本發(fā)明萃取液中PQQ的HPLC分析結(jié)果；
[0033] 圖4為本發(fā)明結(jié)晶產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0034] W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0035] 本發(fā)明所用的培養(yǎng)基配制方法如下：
[0036] 發(fā)酵培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含有40g山梨醇、20g酵母提取物、5g(NH4)2S〇4、2g 皿2口〇4、5邑M拆〇4 ? &0。
[0037] 富集培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含有SOg山梨醇、40g酵母提取物、10g(NH4)2S〇4、4g 皿2口〇4、1〇邑M拆〇4 ? &0。 陽0測實(shí)施例1
[0039] 本實(shí)施例離子對(duì)雙水相萃取分離化咯哇嘟釀的方法，包括W下步驟：
[0040] (1)制備：將氧化葡萄糖酸桿菌按照5%的接種量，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C 條件下震蕩培養(yǎng)3d，得到種子液；然后將種子液按照10%的接種量，接種于富集培養(yǎng)基，在 28°C條件下震蕩培養(yǎng)5山培養(yǎng)液5°C、90(K)r/min離屯、15min，收集上清液，得到含有化咯哇 嘟釀的發(fā)酵液；
[0041] (2)萃?。翰捎秒x子對(duì)雙水相萃取體系對(duì)含有化咯哇嘟釀的發(fā)酵液進(jìn)行萃取，萃 取體系和含有化咯哇嘟釀的發(fā)酵液的體積比為4:2,分離上層，對(duì)下層進(jìn)行重復(fù)萃取3次， 合并分離的上層，得到富含化咯哇嘟釀的有機(jī)層；其中，萃取體系由0. 5mol/L的四下基氨 氧化錠溶液和0.Imol/L、抑值4. 5的憐酸氨鋼緩沖液按照體積比3:1的比例混合而成；
[0042] (3)分離：將富含化咯哇嘟釀的有機(jī)層上WA30型弱陰離子交換樹脂，依次用雙蒸 水、體積分?jǐn)?shù)I%稀鹽酸沖洗，收集稀鹽酸部位，冷凍干燥，得到化咯哇嘟釀粗品；
[0043] (4)純化：將化咯哇嘟釀粗品用超純水溶解，至終濃度為llg/L，用鹽酸調(diào)節(jié)抑至 3, 加入乙醇，在20°C條件下攬拌化后，靜置12h，得到化咯哇嘟釀的晶體；其中，超純水與乙 醇的體積比為5:1。 W44] 實(shí)施例2
[0045] 本實(shí)施例離子對(duì)雙水相萃取分離化咯哇嘟釀的方法，包括W下步驟：
[0046] (1)制備：將氧化葡萄糖酸桿菌按照5%的接種量，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C 條件下震蕩培養(yǎng)3d，得到種子液；然后將種子液按照10%的接種量，接種于富集培養(yǎng)基，在 28°C條件下震蕩培養(yǎng)5山培養(yǎng)液5°C、90(K)r/min離屯、15min，收集上清液，得到含有化咯哇 嘟釀的發(fā)酵液；
[0047] (2)萃?。翰捎秒x子對(duì)雙水相萃取體系對(duì)含有化咯哇嘟釀的發(fā)酵液進(jìn)行萃取，萃 取體系和含有化咯哇嘟釀的發(fā)酵液的體積比為5: