專利名稱：有缺陷的流感病毒顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及流感病毒和針對(duì)流感的疫苗接種的領(lǐng)域。
流感病毒(正粘病毒科)是有包膜的具有分段的基因組的負(fù)鏈RNA病毒(Taubenberger和Layne，Molecular Diagnosis Vol.6 No.4 2001)。根據(jù)它們的核蛋白和基質(zhì)蛋白之間的顯著的抗原差異，可以將它們分成2類一類包含流感A和B，另一類包含流感C。這3個(gè)病毒類型也存在致病性和基因組組織的差異。發(fā)現(xiàn)類型A廣泛存在于恒溫動(dòng)物中，但是類型B和C主要是人病原體。通過(guò)從病毒粒子表面伸出的血細(xì)胞凝集素(HA)和NA表面糖蛋白的抗原特征，進(jìn)一步細(xì)分流感A病毒。目前，有15種HA和9種NA亞型。流感A病毒能感染廣泛種類的動(dòng)物，包括鳥(niǎo)、豬、馬、人和其它哺乳動(dòng)物。水鳥(niǎo)是所有已知亞型的流感A的自然宿主，且可能是人流行流感株的遺傳物質(zhì)源。
不同于相關(guān)的副粘病毒，流感病毒具有分段的RNA基因組。流感A和B病毒具有類似的結(jié)構(gòu)，而流感C是更離散的。A和B類病毒都含有8個(gè)離散的分別編碼至少一種蛋白的基因片段，C類型含有7個(gè)離散的片段，它組合了A和B類型的片段4和6。流感A和B病毒覆蓋著3種蛋白的突出部分HA，NA，和基質(zhì)2(M2)。流感C病毒僅僅具有一種表面糖蛋白。每種流感RNA片段由核蛋白(NP)包裹成殼，形成核糖核苷酸核蛋白(RNP)復(fù)合物。這3種聚合酶蛋白與RNP復(fù)合物的一端相連。RNP被膜圍繞，所述的膜含有作為組成部分的基質(zhì)蛋白(基質(zhì)1)。包膜的磷脂部分源自宿主細(xì)胞膜。在病毒顆粒內(nèi)，還發(fā)現(xiàn)了非結(jié)構(gòu)性蛋白2(NS2)。
世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于流感病毒命名法的規(guī)則如下。首先，指定病毒的類型(A，B，或C)，然后為宿主(如果非人)，分離地，分離數(shù)目，和分離的年(以斜線分隔)。對(duì)于流感A，在括號(hào)中注明了HA和NA亞型。例如，包含在近期的2000至2001季的三價(jià)疫苗中的株是A/巴拿馬/2007/99(H3N2)，A/新喀里多尼亞/20/99(H1N1)，和B/Yamanashi/16/98。自1977年以來(lái)，已經(jīng)有2種流感A亞型共存于人類H1N1和H3N2。
流感病毒能積累復(fù)制過(guò)程中的點(diǎn)突變，因?yàn)樗鼈兊腞NA聚合酶復(fù)合物不具有校對(duì)活性。能改變表面糖蛋白的抗原部分中的氨基酸的突變能通過(guò)逃避預(yù)先存在的免疫而為病毒株提供選擇優(yōu)勢(shì)。通過(guò)結(jié)合某些宿主細(xì)胞上的受體，HA分子能啟動(dòng)感染。針對(duì)HA蛋白的抗體可以阻止受體結(jié)合，能非常有效地預(yù)防相同株的再次感染。通過(guò)抗原性漂移(其中目前循環(huán)的HA基因的突變會(huì)破壞抗體結(jié)合)或抗原性轉(zhuǎn)變(其中病毒獲得新亞型的HA)，HA可以逃避以前獲得的免疫?？乖云茐毫υ贖A分子中是不均等的，陽(yáng)性選擇變化主要發(fā)生在HA蛋白的球形頭上。這些變化在HA中的積累程度也大于在NA中的。在其它流感蛋白中更慢產(chǎn)生變化。同樣地，抗原性漂移壓力在人-適應(yīng)的流感株中最大，在豬-和馬-適應(yīng)的株中中等，在鳥(niǎo)-適應(yīng)的株中最小。
因?yàn)榱鞲胁《揪哂蟹侄蔚幕蚪M，2種不同株在同一宿主中的共感染可以導(dǎo)致生成新的重新組合的流感株，其含有親本基因片段的不同組合。已知15種HA亞型存在于野鳥(niǎo)中，并提供了HA的來(lái)源，所述HA對(duì)于人類而言是新的。含有新的亞型(通過(guò)抗原性轉(zhuǎn)變)的流感株在人循環(huán)中的出現(xiàn)，已經(jīng)成為1957和1968年的最近2次流感大流行的原因，且極有可能是1918年流感大流行的原因。為了與已知的關(guān)于流行性流感病毒的出現(xiàn)相一致，流行株必須具有在抗原性上不同于目前流行的HA；該HA不得已經(jīng)在人類中循環(huán)了60至70年；且該病毒必須是可以在人間傳播的。在1957和1968年，HA的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致了大流行，且在2種情況下，流行株的HA與鳥(niǎo)毒株密切相關(guān)。盡管大流行的一個(gè)絕對(duì)條件是HA必須變化，尚不清楚病毒的其它部分可以或必須變化的程度。僅僅可以得到1957和1968年的流行性病毒用于直接研究，使用分子考古學(xué)，表征了1918年的流行性流感病毒。在1957年，3個(gè)基因被替換為鳥(niǎo)類基因HA，NA，和聚合酶復(fù)合物的亞基(PB1)。在1968年，僅僅替換了HA和PB1。
通過(guò)病毒分離、血凝抑制(HI)實(shí)驗(yàn)、免疫測(cè)定法檢測(cè)抗原、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)、驗(yàn)證分泌物中的NA活性或基于分子的實(shí)驗(yàn)，可以特異性地診斷流感感染?？梢詫⒃嚇邮占癁橥僖?、鼻咽拭子或通過(guò)口漱緩沖鹽水溶液得到的鼻咽洗液。流感診斷的標(biāo)準(zhǔn)是培養(yǎng)后進(jìn)行免疫學(xué)表征。血清學(xué)分析能提供精確的、但是可追溯的流感感染方法，因?yàn)樗枰占毙云诤蜐u愈期的血清。
流感病毒可以在含胚的雞蛋或許多組織培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)。加入胰蛋白酶(用于HA的切割活化)，會(huì)使流感病毒在Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞和其它系中繁殖。疫苗生產(chǎn)的主要方法仍然是在蛋中培養(yǎng)流感病毒。細(xì)胞系的培養(yǎng)物通常用于人流感病毒(類型A和B)的初步分離?？梢灾苯釉诤叩牡暗哪蚰仪恢信囵B(yǎng)許多人流感病毒。有些流感A和B病毒需要首先在羊膜腔中培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到尿囊腔中。培養(yǎng)物分離后，使用免疫測(cè)定法或免疫熒光法，確定地鑒別出了大多數(shù)流感分離物。流感病毒的HA分子能結(jié)合呼吸細(xì)胞表面上的唾液酸殘基，以利于病毒的進(jìn)入。
利用流感病毒體外使紅細(xì)胞凝集的能力，可以在抗原方面表征流感株?？?HA抗體可以抑制凝集。因而，血凝反應(yīng)抑制(HI)實(shí)驗(yàn)是用于表征流感株的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。HI實(shí)驗(yàn)可以用于確定樣品株是否在免疫學(xué)上與近來(lái)的疫苗株相關(guān)(即交叉反應(yīng)性的)。以一系列的2倍稀釋，向孔中加入分型血清，后者一般在雪貂中生產(chǎn)，實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)觀察懸浮的和凝集的紅細(xì)胞，對(duì)實(shí)驗(yàn)孔打分。在大多數(shù)情況下，一組血清用于匹配針對(duì)疫苗的樣品株和參照株，且在任何給定的流感季的過(guò)程中，通過(guò)HI實(shí)驗(yàn)成功地匹配了大多數(shù)樣品株。
關(guān)于鑒別各病毒株的抗原特征，WHO提供了準(zhǔn)則，WHO協(xié)作中心提供了指南。根據(jù)免疫學(xué)系譜，例如A/莫斯科/10/99(H3N2)-樣，A/新喀里多尼亞/20/99(H1N1)-樣，和B/北京/184/93-樣病毒，對(duì)樣品株進(jìn)行分類。對(duì)于不能在HI實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行表征的樣品株，實(shí)驗(yàn)室工作人員必須將它們接種進(jìn)雪貂中，以生成株特異性的抗血清。當(dāng)新的抗血清準(zhǔn)備好后，再如所述進(jìn)行HI實(shí)驗(yàn)。如果新血清在交叉反應(yīng)性中表現(xiàn)出顯著差異(通常定義為樣品和疫苗株之間的4倍差異)，則將它整合進(jìn)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室組中，并用于尋找新的流行性株。因而，HI實(shí)驗(yàn)在疫苗株選擇的流感病毒監(jiān)視工作中非常重要，且是最常用的估計(jì)抗原性漂移的方法。
通過(guò)各基因片段的序列對(duì)比，可以遺傳地表征流感株，WHO準(zhǔn)則和WHO協(xié)作中心又提供了關(guān)于識(shí)別包含下述片段的個(gè)體性質(zhì)的指南包含流感基因組的RNA片段；能編碼核蛋白(NP)、堿性聚合酶1(PB1)、堿性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)、血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)的流感A和B病毒核酸片段，和能編碼核蛋白(NP)、堿性聚合酶1(PB1)、堿性聚合酶2(PB2)、血細(xì)胞凝集素-神經(jīng)氨酸酶樣糖蛋白(HN)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)的流感C病毒核酸片段。關(guān)于抗原分析、核酸序列對(duì)比和鑒別疫苗病毒的參照株的請(qǐng)求，可以致送WHO流感參考和研究協(xié)作中心，45 Poplar Road，Parkville，Victoria 3052，Australia(fax+61 3 9389 1881，web sitehttp//www.influenzacentre.org)；WHO流感參考和研究協(xié)作中心，National Institute of Infectious Diseases，Gakuen 4-7-1，Musashi-Murayama，Tokyo 208-0011，Japan(fax+81 42 5610812或+81 42 5652498)；WHO流感監(jiān)視、流行病學(xué)和控制協(xié)作中心，Centersfor Disease Control and Prevention，1600 Clifton Road，Mail stop G16，Atlanta，GA 30333，United States of America(fax+1 404 639 23 34)；或WHO流感參考和研究協(xié)作中心，National Institute for MedicalResearch，The Ridgeway，Mill Hill，London NW7 1AA，England(fax+44 208 906 4477)。在WHO的網(wǎng)站http://www.who.int/influenza上，可以得到最新的流行病學(xué)信息，在http://www.who.int/flunet上，可以得到地理信息系統(tǒng)，F(xiàn)luNet。
人們對(duì)于流感的影響和預(yù)防它的健康和經(jīng)濟(jì)益處的認(rèn)識(shí)正在逐步提高，過(guò)去十多年已經(jīng)觀察到了疫苗接種的應(yīng)用和益處，且顯著地出現(xiàn)了許多抗流感藥物。作為在許多國(guó)家更長(zhǎng)的壽命預(yù)期的結(jié)果，更多的人處于并發(fā)癥的危險(xiǎn)中，在流感流行病過(guò)程中的保健系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)被更廣泛地承認(rèn)，更頻繁的國(guó)際旅行已經(jīng)為病毒的傳播創(chuàng)造了機(jī)會(huì)，盡管新產(chǎn)品的出現(xiàn)已經(jīng)增加了預(yù)防和治療疾病的選擇。約50個(gè)國(guó)家具有政府資助的國(guó)家流感免疫計(jì)劃，且在許多其它國(guó)家可以得到疫苗。關(guān)于使用疫苗的具體推薦是不同的，但是通常包含年老個(gè)體和由于以前存在的慢性醫(yī)學(xué)病而處于嚴(yán)重疾病的高危險(xiǎn)中的大于6個(gè)月齡的個(gè)體的年度免疫。在有些國(guó)家中，疫苗用于減少流感向高危人群中的傳播。在它們的總體公共健康優(yōu)先權(quán)的范圍內(nèi)，成員國(guó)需要考慮流感預(yù)防活動(dòng)的益處。
根據(jù)它們是否含有全病毒顆粒，部分打破的病毒顆粒(分裂的疫苗)或純化的包膜抗原(亞單位疫苗)，可以將失活的疫苗分成幾種類型。已經(jīng)將有些亞單位疫苗與佐劑或輸送系統(tǒng)相組合。
少數(shù)國(guó)家已經(jīng)許可了用于某些目標(biāo)群體的活的減毒的流感疫苗。在俄羅斯聯(lián)邦，已經(jīng)將一種疫苗的2種不同的制劑用于健康的成年人和兒童，已經(jīng)廣泛測(cè)試了另一種活疫苗。但是，在可以更廣泛地得到活的減毒疫苗之前，一般仍不推薦將它們用于流感預(yù)防。
為了預(yù)防和治療流感，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了2類抗病毒藥。M2抑制劑即金剛烷胺和金剛乙胺限于治療流感A病毒，且已經(jīng)報(bào)道它們能有效地預(yù)防感染。盡管二種產(chǎn)品都會(huì)造成一些副作用，金剛烷胺更常見(jiàn)明顯的神經(jīng)副作用。最近，許多國(guó)家已經(jīng)許可神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如扎那米韋和奧賽米韋)用于治療類型A和B流感，且已經(jīng)報(bào)道它們對(duì)于預(yù)防也是有效的。已經(jīng)在接受2類抗病毒藥的患者中檢測(cè)到了抗性突變株。盡管目前尚未將其視為重要的公共健康問(wèn)題，但是如果非常大規(guī)模地使用這些藥物，情況可能會(huì)發(fā)生變化。
WHO維持著全球國(guó)際監(jiān)視計(jì)劃，它在位于82個(gè)國(guó)家的110個(gè)國(guó)家流感中心和位于亞特蘭大(美國(guó))、倫敦(英國(guó))、墨爾本(澳大利亞)和東京(日本)的4個(gè)WHO流感參考和研究協(xié)作中心的合作下運(yùn)行。這些中心提供關(guān)于出現(xiàn)具有流行病潛能的株的早期警告系統(tǒng)。該系統(tǒng)很重要，因?yàn)槿绻鞲幸呙绮缓心壳把h(huán)的株，則其功效會(huì)降低。WHO會(huì)發(fā)布關(guān)于疫苗組成的推薦，如可以在由世界衛(wèi)生組織出版的WeeklyEpidemiological Record(例如見(jiàn)，issue 9，2004，79，第88頁(yè)或http://www.who.int/wer)中所見(jiàn)的，2月發(fā)布在北半球使用的疫苗，9月發(fā)布在南半球使用的疫苗。由于流感在赤道區(qū)具有不太確定的季節(jié)特征，流行病學(xué)的考慮會(huì)影響這些推薦中的哪一種(2月或9月)適用于在赤道國(guó)家使用的疫苗。
協(xié)作中心對(duì)國(guó)家中心提交的流感分離株進(jìn)行抗原和遺傳分析。當(dāng)觀察到抗原變化的證據(jù)時(shí)，將其與流行病學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，以估計(jì)該變體的流行病學(xué)顯著性。使用在疫苗接種之前和之后收集的人血清組，將代表性的分離株與目前的疫苗株進(jìn)行對(duì)比，以確定能否認(rèn)為現(xiàn)在的疫苗會(huì)保護(hù)免受這些病毒。在出版WHO的年度疫苗推薦后，開(kāi)發(fā)了高生長(zhǎng)株，并提供給生產(chǎn)商作為參照病毒，以輔助生成用于疫苗生產(chǎn)的種子病毒。對(duì)流感疫苗的安全性和效力的測(cè)試，包括病毒失活、微生物滅菌、用于破壞病毒的化學(xué)試劑的測(cè)量和確認(rèn)推薦的抗原濃度。推薦疫苗能符合WHO的要求，但是，國(guó)家控制機(jī)關(guān)應(yīng)當(dāng)批準(zhǔn)在每個(gè)國(guó)家使用的特定疫苗病毒。國(guó)家公共衛(wèi)生機(jī)關(guān)負(fù)責(zé)推薦疫苗的使用。另外，WHO已經(jīng)出版了關(guān)于預(yù)防流感的推薦(見(jiàn)WER No.35，2002，pp.281-288)。
已經(jīng)證實(shí)，現(xiàn)在的流感疫苗不能保護(hù)未免疫(naive)個(gè)體，當(dāng)從未遇到流感感染的許多個(gè)體處于危險(xiǎn)中并出現(xiàn)流感大流行爆發(fā)時(shí)，該事實(shí)會(huì)變得非常重要。病毒一般通過(guò)下述方法開(kāi)始它們的壽命周期結(jié)合到宿主細(xì)胞表面受體上，進(jìn)入細(xì)胞，使它們的病毒核酸脫殼，隨后復(fù)制病毒基因組。在合成了新拷貝的病毒蛋白和基因后，將這些組分包裝進(jìn)后代病毒粒子中，它們?nèi)缓笸顺黾?xì)胞。在裝配步驟的過(guò)程中，后代病毒必須從存在于細(xì)胞質(zhì)中的大量病毒和細(xì)胞核酸中有效地選擇它的基因組核酸。將病毒基因組包裝進(jìn)病毒粒子中，典型地包含被病毒核酸中的順式作用序列的病毒組分所識(shí)別，所謂的“包裝信號(hào)”。定義這樣的信號(hào)對(duì)于理解病毒生命周期是重要的，且為我們提供了可以用于構(gòu)建表達(dá)外來(lái)蛋白的病毒載體的信息。實(shí)際上，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為表達(dá)外來(lái)蛋白的基因輸送載體的運(yùn)輸工具，可以在很大程度上歸因于非常確實(shí)地理解將它們的vRNA包裝進(jìn)后代病毒粒子的過(guò)程。
不太理解其它RNA病毒的基因組包裝信號(hào)，阻礙了它們作為表達(dá)和輸送外來(lái)基因的載體的應(yīng)用進(jìn)程。例如，流感A病毒是有包膜的負(fù)鏈RNA病毒，它的分段的基因組具有核蛋白(NP)、堿性聚合酶1(PB1)、堿性聚合酶2(PB2)、酸性聚合酶(PA)、血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)的編碼能力。
該病毒在包膜上具有2種跨膜糖蛋白，血細(xì)胞凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)。HA蛋白能結(jié)合到宿主細(xì)胞表面上的含有唾液酸的受體上，并在受體介導(dǎo)的胞吞作用后，介導(dǎo)病毒包膜與內(nèi)體膜的融合。相反地，NA蛋白提供下述機(jī)理在感染晚期起關(guān)鍵作用從唾液酸寡糖去除唾液酸，從而從細(xì)胞表面釋放出新裝配的病毒粒子，并阻止病毒粒子的自聚集。在包膜內(nèi)，包含8個(gè)不同病毒RNA(vRNA)片段的病毒基因組緊密連接到核蛋白(NP)和聚合酶蛋白(PA，PB1，和PB2)上，形成核糖核蛋白復(fù)合物。為了生成感染性病毒，需要全部8個(gè)(或者在C類型病毒的情況下全部7個(gè))功能性基因片段。已經(jīng)描述了聚合酶基因中的多個(gè)突變(WO2004/094466，WO2003/091401，US 5578473，F(xiàn)odor等，J.Virol.77，5017-5020，2003)，其會(huì)改變聚合酶活性，或者以另一種方式改變聚合酶，但不會(huì)使它減弱在合成病毒RNA中的功能性，以使含有這種突變的聚合酶的病毒不能復(fù)制。在WO2004/094466中，生成了具有突變的PA基因的感染性病毒，由此證實(shí)了允許生產(chǎn)和回收具有突變的基因的感染性病毒的選擇系統(tǒng)的益處。在WO2003/091401中，證實(shí)了如何生產(chǎn)具有聚合酶基因突變的感染性病毒，以便生產(chǎn)和回收具有與活的減毒的疫苗病毒生產(chǎn)有關(guān)的理想性能(例如溫度敏感性或其它類型的減毒)的流感病毒。在US55788473中，提出了可以改變多種聚合酶的特異性和降低其活性的聚合酶基因片段。但是，它們沒(méi)有用于重構(gòu)病毒，更不用說(shuō)重構(gòu)已經(jīng)完全喪失了它的聚合酶活性的病毒了。另外，在上述的申請(qǐng)中，都沒(méi)有生產(chǎn)出有缺陷的已經(jīng)喪失了它們的復(fù)制能力的顆粒。眾所周知，當(dāng)流感A病毒以高感染復(fù)數(shù)傳代時(shí)，會(huì)生成有缺陷的病毒顆粒，其缺少一個(gè)或多個(gè)功能性基因片段。在這樣的病毒顆粒中，由于流感病毒聚合酶造成的錯(cuò)誤，一個(gè)或多個(gè)功能基因被替換為有缺陷的干擾(DI)基因片段。由于高感染復(fù)數(shù)，和因此細(xì)胞感染了超過(guò)一個(gè)病毒顆粒，含有DI RNA的病毒的缺陷被含有完整拷貝的丟失的功能基因的病毒所補(bǔ)償。近來(lái)證實(shí)，酸性聚合酶基因中的某些突變會(huì)提高生成具有缺陷基因的病毒顆粒的效率(Fodor 2003)。重要的是注意到，在這些實(shí)驗(yàn)中的有缺陷的病毒顆粒的生成和互補(bǔ)都在這些實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)地發(fā)生。該隨機(jī)的過(guò)程會(huì)限制DI RNA和條件性缺陷的病毒顆粒在實(shí)際應(yīng)用中的使用。而且，當(dāng)使用這些公開(kāi)的方法生產(chǎn)有缺陷的病毒顆粒時(shí)，除了需要的條件性缺陷的病毒外，還生成了野生型能復(fù)制的病毒。這種能復(fù)制的病毒可以是完全野生型(輔助病毒)或由輔助病毒和缺陷病毒的遺傳混合形成的重排株(reassortant)。流感病毒的基因片段的包裝過(guò)程，無(wú)論是通過(guò)隨機(jī)的還是特異性的機(jī)理，都已經(jīng)爭(zhēng)論了許多年。已經(jīng)描述了這2種選擇的一些證據(jù)。隨機(jī)包裝的證據(jù)是，聚集的病毒顆粒具有比未聚集的病毒顆粒更高的感染性，且當(dāng)以低傳染方式(moi)感染細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，一些感染的細(xì)胞不能表達(dá)一個(gè)片段，這二者表明存在不含有完整流感病毒基因組的病毒粒子。隨機(jī)包裝的其它證據(jù)是，已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)中生產(chǎn)了含有9個(gè)片段的流感病毒。
一個(gè)支持特異性包裝過(guò)程的理由是，盡管所有基因片段都等量地存在于病毒原液中，它們以不同的量存在于生產(chǎn)細(xì)胞中。另外，當(dāng)生成了有缺陷的干擾(DI)顆粒時(shí)，DI vRNA會(huì)替換其所源自的片段(有缺陷的干擾顆粒是其中一個(gè)基因片段具有較大的內(nèi)部缺失的病毒顆粒。當(dāng)病毒以高moi傳代時(shí)，會(huì)出現(xiàn)這些顆粒)。最后，病毒粒子形成的效率隨著基因片段數(shù)目的增加而增加。
發(fā)明概述有缺陷的流感病毒顆粒(例如Mena I.等.，J.Virol.705016-24(1996)；Neumann G.等.，J.Virol.74547-51(2000).)可以用作疫苗候選品，因?yàn)樗鼈儠?huì)誘導(dǎo)針對(duì)除了HA和NA以外的其它病毒蛋白的抗體，如果它們能進(jìn)入宿主細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兂梭w液反應(yīng)之外還可以誘導(dǎo)針對(duì)病毒的細(xì)胞免疫反應(yīng)(例如輔助T細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞)。迄今為止，已經(jīng)通過(guò)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)了有缺陷的流感病毒顆粒(Mena I.等.，J.Virol.705016-24(1996)；Neumann G.等.，J.Virol.74547-51(2000).)，減少了生產(chǎn)大量這種顆粒的可能性。該方法的一個(gè)替代方案是，生產(chǎn)條件性缺陷的病毒顆粒，使它們能在某些生產(chǎn)系統(tǒng)中復(fù)制，但是不能在正常細(xì)胞或生產(chǎn)系統(tǒng)中復(fù)制。為此，修飾了生產(chǎn)系統(tǒng)的細(xì)胞，使其能生產(chǎn)一個(gè)或多個(gè)流感病毒基因或基因產(chǎn)物，能反式互補(bǔ)有缺陷的流感病毒顆粒。本發(fā)明首次公開(kāi)了有缺陷的流感病毒顆粒的確定的反式互補(bǔ)。在實(shí)驗(yàn)室中，當(dāng)攜帶野生型的有缺陷的干擾基因片段的病毒補(bǔ)償了同一細(xì)胞中的有缺陷的干擾流感病毒時(shí)，已經(jīng)觀察到了流感病毒顆粒的反式互補(bǔ)。該反式互補(bǔ)的“自然系統(tǒng)”不能用于生產(chǎn)確定的條件性缺陷的流感病毒顆粒。首先，該系統(tǒng)要求，一種(部分地)有缺陷的病毒被至少一種(部分地)能復(fù)制的病毒所補(bǔ)償，這會(huì)導(dǎo)致意外地生成全感染性的病毒。其次，因?yàn)椴煌幕蚱我噪S機(jī)方式生產(chǎn)有缺陷的干擾顆粒，不能生產(chǎn)確定的條件性缺陷的病毒顆粒。
條件性缺陷的流感病毒顆粒理論上可以基于完整基因片段或其部分的缺失。如果流感病毒基因組的包裝依賴于所有8個(gè)片段的存在(這是許多爭(zhēng)論中的一種版本(見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)中的其它地方))，通過(guò)刪除完整基因片段(和反式生產(chǎn)編碼的基因產(chǎn)物)來(lái)生產(chǎn)確定的條件性缺陷的病毒顆粒的能力會(huì)受到限制。如果包裝過(guò)程要求所有8個(gè)基因片段的存在，不知道是否需要所有的基因片段都以全長(zhǎng)形式存在，這使得條件性缺陷的病毒顆粒的生產(chǎn)進(jìn)一步復(fù)雜化。本發(fā)明已經(jīng)解決了這些問(wèn)題。
本發(fā)明提供了得到條件性缺陷的流感病毒顆粒的方法，其包括第一步，用下述物質(zhì)轉(zhuǎn)染合適的第一種細(xì)胞，例如293T細(xì)胞具有內(nèi)部缺失的基因構(gòu)建體，例如本文提供的通過(guò)內(nèi)部刪除編碼流感聚合酶的核酸衍生的pΔPB2，pΔPB1，pΔPA或pDIPA，由此使所述的基因構(gòu)建體不能生產(chǎn)能拷貝或合成病毒RNA的功能聚合酶；和編碼流感病毒的互補(bǔ)流感病毒核酸片段，例如7個(gè)能編碼A/WSN/33的互補(bǔ)構(gòu)建體(HW181-188，Hoffmann等.，2000)；和能在所述細(xì)胞中表達(dá)所述聚合酶的表達(dá)質(zhì)粒，例如本文提供的HMG-PB2，HMG-PB1，HMG-PA中的一個(gè)；在轉(zhuǎn)染后合適的時(shí)間點(diǎn)，例如10-50小時(shí)內(nèi)、優(yōu)選地在約20-30小時(shí)，從所述的第一種細(xì)胞的上清液中收獲至少一個(gè)病毒顆粒；第二步，用能在所述細(xì)胞中表達(dá)所述聚合酶的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染合適的第二種細(xì)胞，例如MDCK細(xì)胞；第三步，用包含從所述的第一種細(xì)胞得到的至少一個(gè)病毒顆粒的上清液轉(zhuǎn)染所述的第二種細(xì)胞；第四步，包括在轉(zhuǎn)染后合適的時(shí)間點(diǎn)，例如24-96小時(shí)、優(yōu)選48-72小時(shí)，從所述的第一種細(xì)胞的上清液中收獲至少一個(gè)(現(xiàn)在為條件性缺陷的，因?yàn)樯傻牟《救鄙倌鼙磉_(dá)拷貝或合成病毒RNA的功能聚合酶的基因片段，因?yàn)樗鼈儼b了具有內(nèi)部缺失的基因片段)病毒顆粒。
優(yōu)選的是能使基因片段不能生產(chǎn)功能蛋白的內(nèi)部缺失，但是它不得阻止將病毒的基因片段包裝進(jìn)病毒顆粒中。優(yōu)選地，這些缺失分別從5’和3’非編碼區(qū)計(jì)算。對(duì)于流感A，對(duì)于PA蛋白，這些優(yōu)選的缺失從例如位于核苷酸58至75之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸27至50之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；對(duì)于PB1蛋白，從位于核苷酸43至75之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸24至50之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；對(duì)于PB2蛋白，從位于核苷酸34至50之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸27至50之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束。更優(yōu)選地，這些缺失對(duì)于PA蛋白，從位于核苷酸58至100之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸27至100之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；對(duì)于PB1蛋白，從位于核苷酸43至100之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸24至100之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；對(duì)于PB2蛋白，從位于核苷酸34至100之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸27至100之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束。甚至更優(yōu)選地，這些缺失對(duì)于PA蛋白，從位于核苷酸58至150之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸27至150之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；對(duì)于PB1蛋白，從位于核苷酸43至150之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸24至150之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；對(duì)于PB2蛋白，從位于核苷酸34至150之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸27至150之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束。更優(yōu)選地，這些缺失對(duì)于PA蛋白，從位于核苷酸58至175之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸27至175之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；對(duì)于PB1蛋白，從位于核苷酸43至175之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸24至175之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；對(duì)于PB2蛋白，從位于核苷酸34至175之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸27至175之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束。最優(yōu)選地，這些缺失對(duì)于PA蛋白，從位于核苷酸58至207之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸27至194之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；對(duì)于PB1蛋白，從位于核苷酸43至246之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸24至197之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；對(duì)于PB2蛋白，從位于核苷酸34至234之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于核苷酸27至209之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束。
在本文中，將互補(bǔ)片段定義為能導(dǎo)致一整套8個(gè)基因片段(例如流感A病毒的)的片段。因而，如果片段1已經(jīng)用于生產(chǎn)有缺陷的片段，則互補(bǔ)(無(wú)缺陷的)片段是片段2，3，4，5，6，7和8。如果片段2是有缺陷的，則互補(bǔ)片段是片段1，3，4，5，6，7和8。依此類推。
有利地，本發(fā)明提供了一種方法，由此不需要或不存在輔助病毒。
本發(fā)明提供了分離的和條件性缺陷的流感病毒顆粒，其缺少編碼選自酸性聚合酶(PA)、堿性聚合酶1(PB1)和堿性聚合酶2(PB2)的聚合酶的功能性流感病毒核酸片段(在本文中也稱作條件性缺陷的流感病毒顆粒)，所述的顆粒不能生成聚合酶或不能用作聚合酶的來(lái)源，以拷貝或合成病毒RNA，由此僅僅且有條件地允許在用功能聚合酶反式補(bǔ)償?shù)募?xì)胞中生成可復(fù)制的病毒顆粒。另外，本發(fā)明提供了得到條件性缺陷的流感病毒顆粒的方法，包括通過(guò)用功能性流感病毒聚合酶反式補(bǔ)償，來(lái)提供細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的顆粒能在用該顆粒自身缺少的類似核酸片段補(bǔ)償?shù)募?xì)胞中復(fù)制，例如缺少功能性流感病毒核酸PA片段的顆?？梢栽谥辽僖呀?jīng)提供或補(bǔ)償了功能性流感病毒核酸PA片段的細(xì)胞中復(fù)制，缺少功能性流感病毒核酸PB1片段的顆?？梢栽谥辽僖呀?jīng)提供了功能性流感病毒核酸PB1片段的細(xì)胞中復(fù)制，缺少功能性流感病毒核酸PB2片段的顆?？梢栽谥辽僖呀?jīng)提供了功能性流感病毒核酸PB片段的細(xì)胞中復(fù)制。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的顆粒，其具有能編碼病毒糖蛋白的流感病毒核酸片段，更優(yōu)選地具有能編碼核蛋白(NP)、血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的顆粒，其具有源自流感A病毒的流感病毒核酸片段。另外，提供了根據(jù)本發(fā)明的顆粒，其含有不能編碼流感肽的核酸。另外，本發(fā)明提供了分離的細(xì)胞，其包含根據(jù)本發(fā)明的顆粒，所述細(xì)胞不含有野生型流感病毒或輔助病毒，但是優(yōu)選地已經(jīng)被提供了或補(bǔ)償了流感病毒聚合酶或編碼它的基因片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞是反式補(bǔ)償?shù)?93T或MDCK細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的細(xì)胞，其包含缺少功能性流感病毒核酸PA片段的顆粒，所述細(xì)胞不含有野生型流感病毒或輔助病毒，但是至少已經(jīng)被提供或補(bǔ)償了功能性流感病毒核酸PA片段或功能性PA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的細(xì)胞，其包含缺少功能性流感病毒核酸PB1片段的顆粒，所述細(xì)胞不含有野生型流感病毒或輔助病毒，但是至少已經(jīng)被提供了功能性流感病毒核酸PB1片段或功能性PB1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的細(xì)胞，其包含缺少功能性流感病毒核酸PB2片段的顆粒，所述細(xì)胞不含有野生型流感病毒或輔助病毒，但是至少已經(jīng)被提供了或補(bǔ)償了功能性流感病毒核酸PB2片段或功能性PB2。另外，本發(fā)明提供了組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的顆?；蚣?xì)胞或源自根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的物質(zhì)，和這樣的組合物在生產(chǎn)藥物組合物中的應(yīng)用，所述的藥物組合物能產(chǎn)生使對(duì)象免受流感病毒感染的免疫保護(hù)。因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生使對(duì)象免受流感病毒感染的免疫保護(hù)的方法，包括給需要的對(duì)象提供根據(jù)本發(fā)明的組合物。另外，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的流感病毒顆粒在生產(chǎn)組合物中的應(yīng)用，所述的組合物用于將不編碼流感肽的核酸輸送進(jìn)細(xì)胞中。另外，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的顆粒在生產(chǎn)藥物組合物中的應(yīng)用，所述的組合物用于將不編碼流感肽的核酸輸送進(jìn)對(duì)象的細(xì)胞中，和將不編碼流感肽的核酸輸送進(jìn)細(xì)胞或?qū)ο笾械姆椒ǎńo所述的細(xì)胞或?qū)ο筇峁└鶕?jù)本發(fā)明的顆粒。
本發(fā)明提供了條件性缺陷的流感病毒顆粒，當(dāng)與它的自然基因組相比較時(shí)，其缺少一個(gè)功能性流感病毒片段，它是與野生型或輔助A或B類型病毒相比時(shí)，具有7個(gè)(而不是8個(gè))不同的功能性流感病毒核酸片段，或與野生型或輔助C類型病毒相比時(shí)，具有6個(gè)(而不是7個(gè))不同的功能性流感病毒核酸片段。當(dāng)在本文中使用術(shù)語(yǔ)“條件性缺陷的”時(shí)，它包括但不限于，病毒顆粒，其中一個(gè)病毒基因片段具有較大的內(nèi)部缺失，這導(dǎo)致從它表達(dá)無(wú)功能的蛋白。感染性病毒的生產(chǎn)，需要所有8個(gè)基因片段(例如流感A病毒的)和它們編碼的所有蛋白。因而，含有缺陷基因片段的病毒自身是有缺陷的它可以感染細(xì)胞，且可以經(jīng)過(guò)一個(gè)復(fù)制周期，因?yàn)樗胁《镜鞍锥即嬖谟谠摬《玖Ｗ?例如，當(dāng)生產(chǎn)病毒時(shí)，通過(guò)表達(dá)質(zhì)粒生產(chǎn)該蛋白)中，但是在感染的細(xì)胞中沒(méi)有生成感染性病毒顆粒，因?yàn)樵摬《静荒苌a(chǎn)一種病毒蛋白。但是，當(dāng)感染的細(xì)胞能表達(dá)一般由有缺陷的基因片段表達(dá)的蛋白時(shí)，有缺陷的病毒可以在這些細(xì)胞中復(fù)制，因?yàn)樗械牟《镜鞍锥即嬖?。因而，這些病毒是條件性缺陷的直到提供具有正確條件的細(xì)胞，它們才可以復(fù)制(在該情況下，細(xì)胞會(huì)表達(dá)因?yàn)椴《救鄙倩蚱味痪幋a的病毒蛋白)。
另外，本發(fā)明提供了條件性缺陷的流感病毒顆粒，其缺少能編碼聚合酶的功能性流感病毒核酸片段。在本文中，功能性流感病毒核酸片段包含能編碼功能性流感蛋白的核酸，其允許生成可復(fù)制的病毒，且是必需的。例如，流感A病毒是負(fù)鏈RNA病毒，其具有8-段的基因組。8個(gè)基因片段能編碼11種蛋白；基因片段1-8能分別編碼堿性聚合酶2(PB2)、堿性聚合酶1(PB1)和PB1-ORF2(F2)，酸性聚合酶(PA)，血細(xì)胞凝集素(HA)，核蛋白(NP)，神經(jīng)氨酸酶(NA)，基質(zhì)蛋白1和2(M1，M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白1和2(NS1，NS2)。8個(gè)基因片段的編碼區(qū)的側(cè)翼為病毒RNA合成必需的非編碼區(qū)(NCR)。分別在病毒基因組RNA的5’和3’-端的末端13和12個(gè)核苷酸在所有流感A病毒片段中是保守的，且是部分地互補(bǔ)的，以形成能被病毒聚合酶復(fù)合物識(shí)別的二級(jí)結(jié)構(gòu)。NCR可以含有至多60個(gè)其它核苷酸，它們?cè)?個(gè)基因片段之間是不保守的，但是在不同的流感病毒之間是相對(duì)保守的。有效的病毒基因組包裝需要NCR和編碼區(qū)中的側(cè)翼序列。因而，功能性流感病毒核酸片段由具有編碼功能性流感蛋白的潛力、允許生成可復(fù)制的病毒的序列(1或2個(gè)開(kāi)放讀碼框/片段)、mRNA、病毒RNA(vRNA)和與病毒RNA互補(bǔ)的RNA(cRNA)轉(zhuǎn)錄所需的NCR和存在于NCR和側(cè)翼編碼序列中的包裝信號(hào)組成。
優(yōu)選地，所述的條件性缺陷的缺少一個(gè)流感病毒核酸的流感病毒顆粒缺少能編碼功能聚合酶PA、PB1或PB2的片段。另外，對(duì)于疫苗目的，所述的顆粒優(yōu)選地具有能編碼病毒糖蛋白的流感病毒核酸片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了流感A病毒顆粒，其具有7個(gè)不同的流感A核酸片段。根據(jù)本發(fā)明的有缺陷的流感病毒顆粒能夠復(fù)制，雖然在合適的、未補(bǔ)償?shù)乃拗鲃?dòng)物或細(xì)胞中僅僅一次。
在合適的補(bǔ)償?shù)募?xì)胞中，根據(jù)本發(fā)明的顆?？梢詮?fù)制多個(gè)循環(huán)。對(duì)于疫苗和基因輸送目的，有缺陷的顆粒不能在正常的、未反式補(bǔ)償?shù)募?xì)胞中無(wú)限復(fù)制是一個(gè)很大的優(yōu)點(diǎn)，由此減少了疫苗病毒在宿主間擴(kuò)散的危險(xiǎn)，并減少了回復(fù)到野生型病毒的危險(xiǎn)。
這是首次使用反向遺傳學(xué)生產(chǎn)有缺陷的流感A病毒，其僅僅含有7個(gè)功能性基因片段，且可以經(jīng)歷1個(gè)周期的復(fù)制，或者當(dāng)反式補(bǔ)償了有缺陷的基因片段時(shí)，可以經(jīng)歷多個(gè)周期的復(fù)制。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了條件性缺陷的流感病毒顆粒，其缺少基本編碼酸性聚合酶(PA)的流感核酸片段。與PA的反式互補(bǔ)類似，可以預(yù)見(jiàn)其它流感病毒基因的反式互補(bǔ)。但是，由于已經(jīng)證實(shí)PA表達(dá)水平不如其它流感病毒蛋白的表達(dá)水平關(guān)鍵，PA是缺失的聚合酶組的優(yōu)選基因片段，也可以生產(chǎn)缺失了PB2和PB1的病毒，不能反式補(bǔ)償缺失了NP的病毒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了條件性缺陷的流感A病毒顆粒，其具有7個(gè)不同的流感A核酸片段，且缺少基本編碼酸性聚合酶的流感A核酸片段。對(duì)于疫苗目的，優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的條件性缺陷的流感A病毒顆粒具有基本編碼血細(xì)胞凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白的流感A核酸片段，這些蛋白對(duì)于賦予保護(hù)是免疫學(xué)上最相關(guān)的。為了選擇合適的包含在疫苗中的基因片段，基因片段優(yōu)選地選自WHO推薦的用于疫苗用途的病毒。當(dāng)然，根據(jù)要接種預(yù)防的流感變體的HA和NA亞型，HA和NA亞型可以變化。最優(yōu)選地，生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的條件性缺陷的流感病毒顆粒，其具有基本編碼核蛋白(NP)、堿性聚合酶1(PB1)、堿性聚合酶2(PB2)、血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)的流感A核酸片段，“基本編碼”在本文中具體指功能性蛋白由各自的基因片段表達(dá)。特別地，在具有功能性PA或能編碼PA的功能性基因片段的分離的細(xì)胞中提供了這樣的顆粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本文中提供了根據(jù)本發(fā)明的條件性缺陷的流感病毒顆粒，其具有基本編碼核蛋白(NP)、酸性聚合酶(PA)、堿性聚合酶2(PB2)、血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)的流感A核酸片段，“基本編碼”在本文中具體指功能性蛋白由各自的基因片段表達(dá)。特別地，在具有功能性PB1或能編碼PB1的功能性基因片段的分離的細(xì)胞中提供了這樣的顆粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本文中提供了根據(jù)本發(fā)明的條件性缺陷的流感病毒顆粒，其具有基本編碼核蛋白(NP)、酸性聚合酶(PA)、堿性聚合酶1(PB1)、血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)的流感A核酸片段，“基本編碼”在本文中具體指功能性蛋白由各自的基因片段表達(dá)。特別地，在具有功能性PB2或能編碼PB2的功能性基因片段的分離的細(xì)胞中提供了這樣的顆粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的顆粒，其另外含有不能編碼流感肽的核酸，例如，編碼用于引發(fā)免疫反應(yīng)的外來(lái)蛋白或肽，或其含有能干擾細(xì)胞或病原體在細(xì)胞中的功能的核酸。
另外，本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的流感病毒顆粒的細(xì)胞。當(dāng)沒(méi)有為顆粒提供基本編碼所需的聚合酶的基因片段時(shí)，有用的是考慮已經(jīng)被提供了合適的功能性流感病毒聚合酶的細(xì)胞，允許有缺陷的流感病毒顆粒在這樣補(bǔ)償?shù)募?xì)胞中復(fù)制多個(gè)周期。
另外，本發(fā)明提供了組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的有缺陷的流感病毒顆?；蚣?xì)胞或源自根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的物質(zhì)；這樣的組合物可以例如用于生產(chǎn)旨在生成使對(duì)象免受流感病毒感染的免疫保護(hù)的藥物組合物。另外，本發(fā)明提供了產(chǎn)生使對(duì)象免受流感病毒感染的免疫保護(hù)的方法，包括給需要的對(duì)象提供這樣的組合物。除了根據(jù)本發(fā)明的顆粒作為疫苗或免疫組合物的應(yīng)用外，優(yōu)選地將這樣的組合物配制成疫苗，即通過(guò)混合病毒顆粒或源自這樣的顆粒的病毒蛋白(分裂-疫苗)與適當(dāng)?shù)乃幬镙d體，例如鹽溶液或佐劑(例如常用的鋁鹽或其它賦形劑(見(jiàn)例如http://www.cdc.gov/nip/publications/pink/Appendices/A/Excipient.pdf.)。根據(jù)本發(fā)明的條件性缺陷的流感病毒顆粒也是用于外來(lái)基因輸送和表達(dá)外來(lái)蛋白的備選載體，因?yàn)榭梢詫⒐δ苄曰蚶绮迦朐?’和3’PA序列之間?？紤]到本發(fā)明提供了得到條件性缺陷的、可能含有外來(lái)或宿主核酸片段或其片段的流感病毒顆粒的方法，其包括第一步，用下述物質(zhì)轉(zhuǎn)染合適的第一種細(xì)胞通過(guò)內(nèi)部刪除能編碼流感蛋白的核酸而衍生的一個(gè)或多個(gè)基因構(gòu)建體，由此使所述的基因構(gòu)建體不能生產(chǎn)功能蛋白，且不能阻止將病毒的基因片段包裝進(jìn)病毒顆粒；和能編碼流感病毒的互補(bǔ)流感病毒核酸片段；和能在所述細(xì)胞中表達(dá)所述蛋白的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)質(zhì)粒；在轉(zhuǎn)染后合適的時(shí)間點(diǎn)，從所述的第一種細(xì)胞的上清液中收獲至少一個(gè)病毒顆粒；第二步，用能在所述細(xì)胞中表達(dá)所述蛋白的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染合適的第二種細(xì)胞；第三步，用包含從所述的第一種細(xì)胞得到的至少一個(gè)病毒顆粒的上清液感染所述的第二種細(xì)胞；第四步，包括在感染后合適的時(shí)間點(diǎn)，從所述的第二種細(xì)胞的上清液中收獲至少一個(gè)病毒顆粒。因此，本發(fā)明提供了得到條件性缺陷的流感病毒顆粒的方法，其包括用下述物質(zhì)轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞通過(guò)內(nèi)部刪除能編碼流感聚合酶的核酸而衍生的一個(gè)或多個(gè)基因構(gòu)建體，由此使所述的基因構(gòu)建體不能生產(chǎn)功能聚合酶，且不能阻止將病毒的基因片段包裝進(jìn)病毒顆粒；和能編碼流感病毒的互補(bǔ)流感病毒核酸片段；和能在所述細(xì)胞中表達(dá)所述聚合酶的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)質(zhì)粒；在轉(zhuǎn)染后合適的時(shí)間點(diǎn)，從所述細(xì)胞的上清液中收獲至少一個(gè)病毒顆粒。所述的得到條件性缺陷的流感病毒顆粒的方法，包括第一步，用能在所述細(xì)胞中表達(dá)流感聚合酶的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞；第二步，用包含條件性缺陷的流感病毒顆粒的上清液感染所述的細(xì)胞；第三步，包括在感染后合適的時(shí)間點(diǎn)，從所述細(xì)胞的上清液中收獲至少一個(gè)病毒顆粒；或得到條件性缺陷的流感病毒顆粒的方法，其包括第一步，用下述物質(zhì)轉(zhuǎn)染合適的第一種細(xì)胞通過(guò)內(nèi)部刪除能編碼流感聚合酶的核酸而衍生的一個(gè)或多個(gè)基因構(gòu)建體，由此使所述的基因構(gòu)建體不能生產(chǎn)功能聚合酶，且不能阻止將病毒的基因片段包裝進(jìn)病毒顆粒；和能編碼流感病毒的互補(bǔ)流感病毒核酸片段；和能在所述細(xì)胞中表達(dá)所述聚合酶的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)質(zhì)粒；在轉(zhuǎn)染后合適的時(shí)間點(diǎn)，從所述的第一種細(xì)胞的上清液中收獲至少一個(gè)病毒顆粒；第二步，用能在所述細(xì)胞中表達(dá)所述聚合酶的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染合適的第二種細(xì)胞；第三步，用包含從所述的第一種細(xì)胞得到的至少一個(gè)病毒顆粒的上清液感染所述的第二種細(xì)胞；第四步，包括在感染后合適的時(shí)間點(diǎn)，從所述的第二種細(xì)胞的上清液中收獲至少一個(gè)病毒顆粒。在該方法中，所述的聚合酶可以是例如酸性聚合酶(PA)、堿性聚合酶1(PB1)或堿性聚合酶2(PB2)。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了通過(guò)內(nèi)部刪除能編碼流感聚合酶的核酸造成內(nèi)部缺失的方法，對(duì)于PA蛋白，所述的內(nèi)部缺失從位于由非編碼區(qū)計(jì)起的核苷酸58至207之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于由非編碼區(qū)計(jì)起的核苷酸27至194之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；或者對(duì)于PB1蛋白，從位于由非編碼區(qū)計(jì)起的核苷酸43至246之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于由非編碼區(qū)計(jì)起的核苷酸24至197之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；或者對(duì)于PB2蛋白，從位于由非編碼區(qū)計(jì)起的核苷酸34至234之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于由非編碼區(qū)計(jì)起的核苷酸27至209之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束。在另一個(gè)變體中，將外來(lái)片段插入該內(nèi)部缺失中。另外，本發(fā)明提供了用包含條件性缺陷的流感病毒顆粒的上清液感染細(xì)胞的方法，所述的細(xì)胞已經(jīng)能表達(dá)無(wú)功能的聚合酶，例如酸性聚合酶(PA)、堿性聚合酶1(PB1)或堿性聚合酶2(PB2)，和可以通過(guò)本文所述的方法得到的流感顆粒。例如，要用基因構(gòu)建體和核酸片段轉(zhuǎn)染的細(xì)胞已經(jīng)能表達(dá)無(wú)功能的聚合酶。更具體地，本發(fā)明提供了流感病毒顆粒，其包含一個(gè)或多個(gè)在片段中具有內(nèi)部缺失的核酸片段，所述缺失使片段不能生產(chǎn)功能性流感聚合酶，且不能阻止將病毒的基因片段包裝進(jìn)病毒顆粒中，其中聚合酶選自酸性聚合酶(PA)、堿性聚合酶1(PB1)或堿性聚合酶2(PB2)。優(yōu)選地，內(nèi)部缺失對(duì)于PA蛋白，從位于由非編碼區(qū)計(jì)起的核苷酸58至207之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于由非編碼區(qū)計(jì)起的核苷酸27至194之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；對(duì)于PB1蛋白，從位于由非編碼區(qū)計(jì)起的核苷酸43至246之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于由非編碼區(qū)計(jì)起的核苷酸24至197之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束；對(duì)于PB2蛋白，從位于由非編碼區(qū)計(jì)起的核苷酸34至234之間(不含端點(diǎn))的5’-核苷酸開(kāi)始，至位于由非編碼區(qū)計(jì)起的核苷酸27至209之間(不含端點(diǎn))的3’-核苷酸結(jié)束。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的顆粒，其具有能編碼病毒糖蛋白的流感病毒核酸片段。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的顆粒，其具有能編碼核蛋白(NP)、堿性聚合酶1(PB1)、堿性聚合酶2(PB2)、血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段，或者提供了顆粒，其具有能編碼核蛋白(NP)、酸性聚合酶(PA)、堿性聚合酶2(PB2)、血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段，或者提供了顆粒，其具有能編碼核蛋白(NP)、酸性聚合酶(PA)、堿性聚合酶1(PB1)、血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段。更具體地，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的顆粒，其具有源自流感A病毒的流感病毒核酸片段。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的顆粒，其含有不編碼流感肽的核酸。另外，本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的顆粒的細(xì)胞，更具體地，細(xì)胞已經(jīng)含有一種或多種流感病毒聚合酶，其中聚合酶選自酸性聚合酶(PA)、堿性聚合酶1(PB1)或堿性聚合酶2(PB2)。另外，本發(fā)明提供了組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的顆粒或細(xì)胞或源自根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的物質(zhì)，這樣的組合物在生產(chǎn)旨在生成使對(duì)象免受流感病毒感染的免疫保護(hù)的藥物組合物中的應(yīng)用，和產(chǎn)生使對(duì)象免受流感病毒感染的免疫保護(hù)的方法，包括給需要的對(duì)象提供這樣的組合物。另外，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的顆粒在生產(chǎn)旨在將不編碼流感肽的核酸輸送給細(xì)胞的組合物中的應(yīng)用，和根據(jù)本發(fā)明的顆粒在生產(chǎn)旨在將不編碼流感肽的核酸輸送給對(duì)象的細(xì)胞中的藥物組合物中的應(yīng)用。這樣的核酸(在本文中也稱作外來(lái)核酸)可以編碼外來(lái)基因或基因片段，后者能編碼合適的抗原表位或蛋白，或者可以編碼一段核苷酸，后者能干擾細(xì)胞中的核酸轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的流感A病毒顆粒在生產(chǎn)旨在將不編碼流感肽的核酸輸送進(jìn)細(xì)胞或?qū)ο蟮募?xì)胞中的組合物中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明提供了將不編碼流感肽的核酸輸送進(jìn)細(xì)胞或?qū)ο笾械姆椒ǎńo所述細(xì)胞或所述的對(duì)象提供有缺陷的流感病毒顆粒，其含有根據(jù)本發(fā)明的外來(lái)核酸。
附例

圖1的圖例條件性缺陷的流感A病毒的生產(chǎn)和繁殖。首先，用7個(gè)能編碼A/PR/8/34的雙向質(zhì)粒、pHMG-PA和適當(dāng)時(shí)的pΔPA或pDIPA轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液，并用于接種給MDCK細(xì)胞和提前24小時(shí)用HMG-PA轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞。將病毒復(fù)制陽(yáng)性的MDCK-PA細(xì)胞的上清液在MDCK和MDCK-PA細(xì)胞中傳代4次。
圖2的圖例用于生產(chǎn)條件性缺陷的病毒顆粒的構(gòu)建體。上圖顯示了野生型PA基因片段。標(biāo)示了非編碼區(qū)(NCR)和起始密碼子。通過(guò)用StuI消化pHW183，一種含有A/WSN/33的PA的雙向質(zhì)粒(9)，并隨后重新連接，構(gòu)建了pΔPA。通過(guò)將A/PR/8/34的PA基因片段的5’194和3’207nts克隆入pSP72中，構(gòu)建了pDIPA。然后將插入物轉(zhuǎn)移給雙向的反向遺傳學(xué)載體。如本文所述，構(gòu)建了pΔPB1和pΔPB2。
圖3的圖例RT-PCR分析PA基因片段在上清液rPR8-7，rPR8-ΔPA和rPR8-DIPA中的存在。使MDCK-PA第4代上清液穿過(guò)22μM過(guò)濾器，并離心濃縮。隨后，分離RNA，并使用針對(duì)PA片段的非編碼區(qū)的引物，進(jìn)行RT-PCR。使用從野生型A/PR/8/34分離出的RNA作為對(duì)照。泳道1rPR8-7；泳道2rPR8-ΔPA；泳道3 rPR8-DIPA；泳道4野生型A/PR/8/34。標(biāo)記物大小標(biāo)示在左側(cè)。
圖4的圖例再刪除pΔPA構(gòu)建體的較大部分，產(chǎn)生了pΔPA-2，pΔPA-3，pΔPA-4，pΔPA-5。
發(fā)明詳述實(shí)施例1從重組DNA生成有缺陷的流感A病毒顆粒流感A病毒是負(fù)鏈的、分段的病毒。其基因組由8個(gè)基因片段組成。所有8個(gè)功能性基因片段是生產(chǎn)感染性病毒所必需的，即所述的感染性病毒是可復(fù)制的病毒，其能在通常認(rèn)為適合流感病毒復(fù)制的細(xì)胞中復(fù)制無(wú)限個(gè)或至少幾個(gè)周期。流感A病毒的基因片段的包裝過(guò)程，無(wú)論是通過(guò)隨機(jī)的還是特異性的機(jī)理，都已經(jīng)爭(zhēng)論了許多年。已經(jīng)描述了這2種選擇的一些證據(jù)。隨機(jī)包裝的證據(jù)是，聚集的病毒顆粒具有比未聚集的病毒顆粒更高的感染性(6)，且當(dāng)以低moi感染細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，一些感染的細(xì)胞不能表達(dá)一個(gè)片段(8)，這二者表明存在不含有完整流感病毒基因組的病毒粒子。隨機(jī)包裝的其它證據(jù)是，已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)中生產(chǎn)了含有9個(gè)片段的流感病毒(4)。Bancroft和Parslow發(fā)現(xiàn)，源自相同的基因片段的vRNA之間在包裝病毒粒子方面沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)(1)。
一個(gè)支持特異性包裝過(guò)程的理由是，盡管所有基因片段都等量地存在于病毒原液中，它們以不同的量存在于生產(chǎn)細(xì)胞中(10)。另外，當(dāng)生成了有缺陷的干擾(DI)顆粒時(shí)，DI vRNA會(huì)替換其所源自的片段(3)(有缺陷的干擾顆粒是其中一個(gè)基因片段具有較大的內(nèi)部缺失的病毒顆粒。當(dāng)病毒以高moi傳代時(shí)，會(huì)出現(xiàn)這些顆粒，且認(rèn)為其發(fā)生的原因是聚合酶酸性蛋白的R638A突變[Fodor等；J.Virol.77，5017-5020，2003])。最后，病毒粒子形成的效率隨著基因片段數(shù)目的增加而增加(5)。Fujii等也證實(shí)了NA片段區(qū)，它是將片段有效地整合進(jìn)病毒粒子所必需的，后來(lái)該研究組也證實(shí)了HA和NS區(qū)，其對(duì)于包裝進(jìn)病毒顆粒是重要的[Fujii，2005#256；Watanabe，2003#184]。
在這里，我們提出了特異性包裝的證據(jù)。為了生產(chǎn)僅僅含有7個(gè)功能性基因片段的病毒顆粒，我們必須確定可以省去哪個(gè)基因片段，而不妨礙病毒生產(chǎn)。鑒于有復(fù)制缺陷的病毒作為疫苗的應(yīng)用，未省去HA和NA，也未省去MA或NS，因?yàn)樾枰?個(gè)分開(kāi)的表達(dá)質(zhì)粒。我們生產(chǎn)了缺少聚合酶基因的病毒。當(dāng)沒(méi)有用表達(dá)質(zhì)粒反式補(bǔ)償缺失的基因片段時(shí)，我們不能生產(chǎn)病毒(表1，2和3，rPR8-7ntc)。在7個(gè)基因片段和能以非常低的滴度表達(dá)通常由缺失的基因片段表達(dá)的蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，可以生產(chǎn)病毒(表1，2和3，rPR8-7)。因此，生產(chǎn)了流感病毒A/WSN/33的基因片段1，2和3的缺失突變體，其分別攜帶1032，528和1120個(gè)核苷酸的內(nèi)部缺失。將這些缺失突變體命名為pΔPB2，pΔPB1和pΔPA(見(jiàn)圖2)。如前所述(de Wit，E.，M.I.Spronken，T.M.Bestebroer，G.F.Rimmelzwaan，A.D.Osterhaus，and R.A.Fouchier.2004.Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34from eight cDNA fragments.Virus Res 103155-61)，用這些缺失的基因片段中的每一個(gè)和7個(gè)互補(bǔ)的能編碼A/PR/8/34的雙向構(gòu)建體(DeWit等，2004)和合適的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收獲上清液。隨后，如前所述(2)，用表達(dá)質(zhì)粒HMG-PB2，HMG-PB1或HMG-PA中的一個(gè)，轉(zhuǎn)染了MDCK細(xì)胞。將這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種給轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的對(duì)應(yīng)上清液(見(jiàn)圖1，其解釋了實(shí)驗(yàn)方法)。通過(guò)HA-實(shí)驗(yàn)，確定了這些MDCK細(xì)胞中的病毒復(fù)制。開(kāi)始時(shí)，在未轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞中沒(méi)有病毒復(fù)制。在用HMG-PB2，HMG-PB1或HMG-PA轉(zhuǎn)染的、接種到對(duì)應(yīng)上清液中的MDCK細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了病毒復(fù)制。接著，在從流感序列數(shù)據(jù)庫(kù)(www.flu.lanl.gov，登記號(hào)K00867)得到的流感病毒A/PR/8/34的有缺陷的干擾PA vRNA的序列的基礎(chǔ)上，我們克隆了有缺陷的PA基因片段。PCR-擴(kuò)增了PA的5’207nt和3’194nt，克隆進(jìn)源自如前所述(De Wit等.，2004)修飾的pHW2000(7)的雙向轉(zhuǎn)錄載體中。得到的質(zhì)粒稱作pDIPA(見(jiàn)圖2)。用pDIPA，HMG-PA和7個(gè)能編碼剩余的流感病毒A/PR/8/34基因片段的雙向構(gòu)建體轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞(見(jiàn)圖2)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收獲上清液，隨后，將提前24小時(shí)用HMG-PA轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞接種給該上清液。接種后72小時(shí)，在這些MDCK細(xì)胞的上清液中進(jìn)行HA-實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)是陽(yáng)性的，這指示著這些細(xì)胞中的病毒復(fù)制。如通過(guò)HA-實(shí)驗(yàn)所確定的，接種未轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞也不能導(dǎo)致病毒生產(chǎn)。隨后在未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染了HMG-PA的MDCK細(xì)胞上，傳代含有PA-缺陷的病毒顆粒的上清液，產(chǎn)生了相同的結(jié)果(表1)。直到第4代，在用HMG-PA轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞中生產(chǎn)了病毒。系列稀釋了MDCKp4的上清液，得到病毒滴度的示度(indication)，證實(shí)它是約104TCID50/ml。
使用的方法步驟是用構(gòu)建體pΔPB2，pΔPB1，pΔPA，pΔNP中的一個(gè)，7個(gè)能編碼A/PR/8/34的互補(bǔ)構(gòu)建體(De Wit等.，2004)和HMG-PB2，HMG-PB1，HMG-PA中的一個(gè)(表達(dá)質(zhì)粒描述在例如Pleschka，S.，R.Jaskunas，O.G.Engelhardt，T.Zurcher，P.Palese，and A.Garcia-Sastre.1996.A plasmid-based reverse genetics systemfor influenza A virus.J Virol 704188-92.；獲自A.Garcia-Sastre andP.Palese)，轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞(關(guān)于轉(zhuǎn)染方法，見(jiàn)De Wit等.，2004)。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收獲轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的上清液。當(dāng)生成了病毒時(shí)，它們存在于上清液中。同時(shí)，用表達(dá)質(zhì)粒HMG-PB2，HMG-PB1，HMG-PA中的一個(gè)(根據(jù)使用的缺失突變體，所以在使用pΔPB2的情況下，則用HMG-PB2轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞)轉(zhuǎn)染了MDCK細(xì)胞(關(guān)于轉(zhuǎn)染方法，見(jiàn)Basler等.，2000)，因?yàn)樯a(chǎn)的病毒缺少能表達(dá)該蛋白的基因片段，因?yàn)樗鼈儼b了含有內(nèi)部缺失的基因片段。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞接種給從轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞得到的上清液。當(dāng)病毒存在于293T上清液中時(shí)，該病毒會(huì)在轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞中復(fù)制，并生產(chǎn)更多的病毒。在接種后72小時(shí)，可以再次收集上清液。
為了證實(shí)沒(méi)有發(fā)生會(huì)產(chǎn)生功能性PA基因片段的PA或DIPA重組，從MDCKp4的上清液分離出了RNA。首先，使上清液穿過(guò)22μM過(guò)濾器，并離心濃縮。隨后，分離RNA，并使用針對(duì)PA片段的非編碼區(qū)的引物，進(jìn)行RT-PCR。使用對(duì)PA vRNA特異性的引物進(jìn)行的RT-PCR證實(shí)了，ΔPA和DIPA經(jīng)過(guò)多次傳代后仍然穩(wěn)定。在感染了DIPA病毒顆粒的MDCK細(xì)胞的上清液中，出現(xiàn)了約400bp的清晰帶，在感染了含有ΔPA的病毒的MDCK細(xì)胞的上清液中，出現(xiàn)了1100bp的帶。在感染了野生型A/PR/8/34的MDCK細(xì)胞的上清液中，可見(jiàn)約2300nt的帶(圖3)。這些結(jié)果表明，ΔPAPR8基因片段穩(wěn)定地包裝進(jìn)了病毒粒子中。
為了生產(chǎn)缺少PB2的病毒，用7個(gè)能編碼流感病毒A/PR/8/34的基因片段2，3，4，5，6，7和8(de Wit，E.，M.I.Spronken，T.M.Bestebroer，G.F.Rimmelzwaan，A.D.Osterhaus，和R.A.Fouchier.2004.Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34from eight cDNA fragments.Virus Res 103155-61)的雙向構(gòu)建體轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞(Hoffmann，E.，G.Neumann，Y.Kawaoka，G.Hobom，和R.G.Webster.2000.A DNA transfection system for generation ofinfluenza A virus from eight plasmids.Proc Natl Acad Sci USA976108-13.)，導(dǎo)致了vRNA和mRNA的表達(dá)。共轉(zhuǎn)染了能表達(dá)A/PR/8/34的PB2、pHMG-PB2的質(zhì)粒(Pleschka，S.，R.Jaskunas，O.G.Engelhardt，T.Zurcher，P.Palese，和A.Garcia-Sastre.1996.Aplasmid-based reverse genetics system for influenza A virus.J Virol704188-92.)。作為對(duì)照，僅僅轉(zhuǎn)染了能編碼A/PR/8/34的7個(gè)雙向構(gòu)建體，省去了pHMG-PB2。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收獲上清液，并接種給MDCK細(xì)胞或提前24小時(shí)在100mm盤中轉(zhuǎn)染了pHMG-PB2(MDCK-PB2)的MDCK細(xì)胞。接種后3天，使用火雞紅細(xì)胞作為病毒生產(chǎn)的指示劑，測(cè)試了接種的MDCK細(xì)胞的上清液的血細(xì)胞凝集活性。在接種了僅僅轉(zhuǎn)染了7個(gè)基因片段、沒(méi)有轉(zhuǎn)染pHMG-PB2(rPR8-7ntc，表2)的293T細(xì)胞的上清液的細(xì)胞中，沒(méi)有檢測(cè)到病毒。接種了轉(zhuǎn)染了7個(gè)基因片段和pHMG-PB2的293T細(xì)胞上清液的MDCK-PB2細(xì)胞上清液是陽(yáng)性的。隨后，使rPR8-7上清液在MDCK和MDCK-PB2細(xì)胞中傳代。rPR8-7能在MDCK-PB2細(xì)胞中復(fù)制，但是在MDCK細(xì)胞中不能(表2)。我們接著生產(chǎn)了流感病毒A/WSN/33的基因片段1的1032nt缺失突變體，產(chǎn)生了344個(gè)氨基酸的缺失(pΔPB2，圖2)。如上所述，生產(chǎn)了含有ΔPB2(rPR8-ΔPB2)的重組病毒(圖1)。在MDCK細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到病毒，而在接種了rPR8-ΔPB2的MDCK-PB2細(xì)胞中檢測(cè)到了病毒。傳代rPR8-ΔPB2后，在MDCK細(xì)胞中沒(méi)有病毒生成的證據(jù)，這與MDCK-PB2細(xì)胞相反(表2)。
還生產(chǎn)了缺少PB1的病毒。用能編碼流感病毒A/PR/8/34的基因片段1，3，4，5，6，7和8的7個(gè)雙向構(gòu)建體轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞，導(dǎo)致了vRNA和mRNA的表達(dá)。共轉(zhuǎn)染了能表達(dá)A/PR/8/34的PB1和pHMG-PB1的質(zhì)粒。作為對(duì)照，僅僅轉(zhuǎn)染了能編碼A/PR/8/34的7個(gè)雙向構(gòu)建體，省去了pHMG-PB1。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收獲上清液，并接種給MDCK細(xì)胞或提前24小時(shí)在100mm盤中轉(zhuǎn)染了pHMG-PB1(MDCK-PB1)的MDCK細(xì)胞(2)(圖1)。接種后3天，使用火雞紅細(xì)胞作為病毒生產(chǎn)的指示劑，測(cè)試了接種的MDCK細(xì)胞的上清液的血細(xì)胞凝集活性。在接種了僅僅轉(zhuǎn)染了7個(gè)基因片段、沒(méi)有轉(zhuǎn)染pHMG-PB1(rPR8-7ntc，表3)的293T細(xì)胞的上清液的細(xì)胞中，沒(méi)有檢測(cè)到病毒。接種了轉(zhuǎn)染了7個(gè)基因片段和pHMG-PB1的293T細(xì)胞上清液的MDCK-PB1細(xì)胞上清液是陽(yáng)性的。隨后，使rPR8-7上清液在MDCK和MDCK-PB1細(xì)胞中傳代。rPR8-7能在MDCK-PB1細(xì)胞中復(fù)制，但是在MDCK細(xì)胞中不能(表3)。我們接著生產(chǎn)了流感病毒A/WSN/33的基因片段2的528nt缺失突變體，產(chǎn)生了178個(gè)氨基酸的缺失(pΔPB1，圖2)。如上所述，生產(chǎn)了含有ΔPB1(rPR8-ΔPB1)的重組病毒(圖1)。在MDCK細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到病毒，而在接種了rPR8-ΔPB1的MDCK-PB1細(xì)胞中檢測(cè)到了病毒。傳代rPR8-ΔPB1后，在MDCK細(xì)胞中沒(méi)有病毒生成的證據(jù)，這與MDCK-PB1細(xì)胞相反(表3)。
因而，我們已經(jīng)能使用如上所述的RNA聚合酶II-驅(qū)動(dòng)的PB2，PB1或PA表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)提供pΔPB2，pΔPB1，或pΔPA/pDIPA構(gòu)建體和反式互補(bǔ)，生產(chǎn)缺少片段1，2，或3的病毒。這里所述的條件性缺陷的病毒可以在非反式補(bǔ)償?shù)募?xì)胞中僅僅經(jīng)歷1個(gè)周期的復(fù)制，但是可以在反式互補(bǔ)的細(xì)胞系中繁殖。這是首次使用反向遺傳學(xué)生產(chǎn)有缺陷的病毒，其僅僅含有7個(gè)功能性基因片段，且可以經(jīng)歷1個(gè)周期的復(fù)制，或者當(dāng)反式補(bǔ)償了有缺陷的基因片段時(shí)，可以經(jīng)歷多個(gè)周期的復(fù)制。
以該方式生產(chǎn)的有缺陷的病毒顆粒是疫苗候選品，因?yàn)樗鼈兛梢越?jīng)歷1個(gè)周期的復(fù)制，而不生成感染性病毒。該單周期復(fù)制的結(jié)果是，疫苗會(huì)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。盡管這些有缺陷的顆粒不能在正常細(xì)胞中復(fù)制，為了生產(chǎn)目的，可以使大量病毒在能表達(dá)有缺陷的蛋白的細(xì)胞系中生長(zhǎng)。正如我們已經(jīng)證實(shí)的，多個(gè)周期的復(fù)制不會(huì)影響病毒的基因型。除了有缺陷的病毒顆粒作為疫苗的應(yīng)用外，它們也是基因輸送和表達(dá)外來(lái)蛋白的候選載體，因?yàn)榭梢詫⒐δ苄曰虿迦?’和3’PA，PB2或PB1序列之間。這也得到了Watanabe等(11)的證實(shí)，他們用外來(lái)基因替換了HA和NA，仍然能生成病毒。
pΔPA的進(jìn)一步截短另外，刪除了pΔPA構(gòu)建體的更大部分，產(chǎn)生了pΔPA-2，pΔPA-3，pΔPA-4，pΔPA-5(圖4)。如前所述(De Wit等.，2004)，用這些缺失的基因片段之一和能編碼A/PR/8/34的7個(gè)互補(bǔ)雙向構(gòu)建體(De Wit等，2004)和能表達(dá)PA的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收獲上清液。隨后，如前所述(Basler，C.F.，等.，2000.Proc Natl AcadSci USA 9712289-94.)，用表達(dá)質(zhì)粒HMG-PA轉(zhuǎn)染了MDCK細(xì)胞。用轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的上清液接種了這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。通過(guò)HA-實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了這些MDCK和MDCK-PA細(xì)胞中的病毒復(fù)制。在未轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞中沒(méi)有病毒復(fù)制。在接種了任一種上清液的HMG-PA轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了病毒復(fù)制。因而，所有源自這些構(gòu)建體的vRNA都包裝進(jìn)了病毒粒子(表4)。
表1.缺少完整的PA基因片段的重組流感A/PR/8/34病毒在MDCK和MDCK-PA細(xì)胞中的復(fù)制
ntc未反式補(bǔ)償?shù)?在293T細(xì)胞中沒(méi)有轉(zhuǎn)染pHMG-PA)
表2.缺少完整的PB2基因片段的重組流感A/PR/8/34病毒在MDCK和MDCK-PB2細(xì)胞中的復(fù)制
ntc未反式補(bǔ)償?shù)?在293T細(xì)胞中沒(méi)有轉(zhuǎn)染pHMG-PB2)表3.缺少完整的PB1基因片段的重組流感A/PR/8/34病毒在MDCK和MDCK-PB1細(xì)胞中的復(fù)制
ntc未反式補(bǔ)償?shù)?在293T細(xì)胞中沒(méi)有轉(zhuǎn)染pHMG-PB1)表4.缺少完整的PA基因片段的重組流感A/PR/8/34病毒在MDCK-PA和MDCK細(xì)胞中的復(fù)制
實(shí)施例2用有缺陷的重組病毒接種疫苗在含有相關(guān)流行病病毒(例如A/莫斯科/10/99)的HA和NA基因的高通量病毒主鏈(例如源自疫苗株A/PR/8/34)的基礎(chǔ)上，如本文所述，生產(chǎn)了條件性缺陷的缺少功能性PA、PB1或PB2基因的重組病毒。通過(guò)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)了條件性缺陷的病毒，其中通過(guò)反式互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)了聚合酶蛋白表達(dá)。隨后，在能穩(wěn)定表達(dá)相關(guān)聚合酶的合適細(xì)胞基質(zhì)(例如MDCK細(xì)胞或Vero細(xì)胞)中擴(kuò)增了病毒。通過(guò)在1000xg離心10分鐘，澄清了病毒上清液。通過(guò)在20-60％蔗糖梯度中進(jìn)行超離心，濃縮和純化了病毒，沉淀后，重新懸浮到磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。使用考馬斯亮藍(lán)染色的12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠，確認(rèn)了病毒制品的純度和數(shù)量，通過(guò)MDCK細(xì)胞和能表達(dá)相關(guān)聚合酶的MDCK細(xì)胞的感染和用抗-核蛋白單克隆抗體染色，確定了條件性缺陷的病毒的病毒滴度。使用噴霧器，給小鼠氣管內(nèi)地或鼻內(nèi)地接種1×10550％組織-培養(yǎng)物感染劑量(TCID-50)。使用血凝反應(yīng)抑制實(shí)驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)、ELISA或病毒中和實(shí)驗(yàn)，確定了接種疫苗之前和之后收集的血清樣品中的針對(duì)流感病毒的HA、NA和內(nèi)部蛋白的抗體滴度。通過(guò)流式細(xì)胞儀、CD4和CD8-陽(yáng)性細(xì)胞的四聚體染色、細(xì)胞裂解活性、T-細(xì)胞增殖等，測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子表達(dá)，對(duì)接種疫苗的動(dòng)物中的抗原特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)行了定量。接種疫苗后6周，使用1×106TCID-50的流感病毒A/莫斯科/10/99或異源病毒分離株，攻擊接種疫苗的動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物。攻擊后，每天從動(dòng)物收集鼻的或咽喉的拭抹樣品，進(jìn)行10天，通過(guò)定量PCR分析或病毒滴定，確定了感染動(dòng)物排出的病毒的量。通過(guò)對(duì)抗體滴度的升高進(jìn)行定量，確定了得到的疫苗誘導(dǎo)的體液免疫，通過(guò)對(duì)輔助和細(xì)胞毒性T-細(xì)胞反應(yīng)的升高進(jìn)行定量，確定了得到的疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫，通過(guò)確定針對(duì)攻擊病毒的感染的保護(hù)，確定了免疫的總水平。
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權(quán)利要求
1.有缺陷的流感病毒顆粒，當(dāng)與它的天然基因組相比較時(shí)，其缺少一個(gè)功能性流感病毒核酸片段。
2.有缺陷的流感病毒顆粒，其缺少編碼酸性聚合酶(PA)的功能性流感病毒核酸片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的有缺陷的流感病毒顆粒，其中缺少的片段編碼酸性聚合酶(PA)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任一項(xiàng)的有缺陷的流感病毒顆粒，其具有編碼病毒糖蛋白的流感病毒核酸片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)的有缺陷的流感病毒顆粒，其具有編碼核蛋白(NP)、堿性聚合酶1(PB1)、堿性聚合酶2(PB2)、血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)的流感病毒核酸片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項(xiàng)的有缺陷的流感病毒顆粒，其具有源自WHO推薦的用于疫苗目的的流感病毒的流感病毒核酸片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項(xiàng)的有缺陷的流感病毒顆粒，其具有源自流感A病毒的流感病毒核酸片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)的有缺陷的流感病毒顆粒，其含有不編碼流感肽的核酸。
9.細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求1至8中的任一項(xiàng)的有缺陷的流感病毒顆粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的細(xì)胞，其含有流感病毒酸性聚合酶(PA)。
11.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至8中的任一項(xiàng)的有缺陷的流感病毒顆?；蚋鶕?jù)權(quán)利要求9或10的細(xì)胞或源自所述細(xì)胞的物質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物在生產(chǎn)旨在生成使對(duì)象免受流感病毒感染的免疫保護(hù)的藥物組合物中的應(yīng)用。
13.產(chǎn)生使對(duì)象免受流感病毒感染的免疫保護(hù)的方法，包括給有此需要的對(duì)象提供根據(jù)權(quán)利要求11的組合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求8的有缺陷的流感病毒顆粒在生產(chǎn)旨在將不編碼流感肽的核酸輸送給細(xì)胞的組合物中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利要求8的有缺陷的流感病毒顆粒在生產(chǎn)旨在將不編碼流感肽的核酸輸送給對(duì)象的細(xì)胞的藥物組合物中的應(yīng)用。
16.將不編碼流感肽的核酸輸送給細(xì)胞的方法，包括為所述細(xì)胞提供根據(jù)權(quán)利要求8的有缺陷的流感病毒顆粒。
17.將不編碼流感肽的核酸輸送給對(duì)象的方法，包括為所述對(duì)象提供根據(jù)權(quán)利要求8的有缺陷的流感病毒顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及流感病毒和針對(duì)流感的疫苗接種領(lǐng)域。本發(fā)明提供了條件性缺陷的流感病毒顆粒，其具有7個(gè)不同的流感核酸片段。本發(fā)明還提供了條件性缺陷的流感病毒顆粒，其缺少選自基本編碼酸性聚合酶(PA)、堿性聚合酶1(PB1)和堿性聚合酶2(PB2)的片段的流感核酸片段。更具體地，本發(fā)明提供了有缺陷的流感病毒顆粒，其具有7個(gè)不同的流感核酸片段，且缺少基本編碼酸性聚合酶的流感核酸片段。另外，本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的有缺陷的流感病毒顆粒的組合物在生產(chǎn)旨在生成使對(duì)象免受流感病毒感染的免疫保護(hù)的藥物組合物中的應(yīng)用，并提供了產(chǎn)生使對(duì)象免受流感病毒感染的免疫保護(hù)的方法，包括給需要的對(duì)象提供包含這樣的有缺陷的流感病毒顆粒的組合物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101056976SQ200580038694
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2005年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月11日
發(fā)明者E·德維特, M·I·J·斯普隆肯, R·A·M·福切爾, A·D·M·E·奧斯特霍斯 申請(qǐng)人:索爾瓦藥物有限公司, 伊拉斯謨大學(xué)鹿特丹醫(yī)藥中心