本發(fā)明屬于帕金森病治療領(lǐng)域，涉及一種治療帕金森病的基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：帕金森病(parkinson’sdisease，pd)又稱為震顫麻痹，是一種以黑質(zhì)紋狀體通路退變?yōu)橹饕卣鞯纳窠?jīng)系統(tǒng)疾病。主要病理學(xué)特征為中腦黑質(zhì)致密部(substantianigraparscompacta，snpc)多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergicneuron)變性伴隨胞漿內(nèi)嗜酸性蛋白包涵體(lewybody，lb)和營(yíng)養(yǎng)障礙性神經(jīng)突(lewyneurites)形成，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體通路破壞及尾狀核、殼核中多巴胺含量減少。其典型臨床癥狀為靜止性震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢(shì)反射受損和一定的步態(tài)障礙。帕金森氏病的特征是在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損失。這些神經(jīng)元的結(jié)果在呼氣和抑制途徑在大腦中的余額的變化的損失，并反過(guò)來(lái)這些途徑影響的運(yùn)動(dòng)控制。藥物治療，尤其是多巴胺替代療法在60年代末期被開(kāi)發(fā)并保持治療的中流砥柱。最近，手術(shù)治療(蒼白球或在大腦選定目標(biāo)的腦深部刺激)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了被歸因?yàn)樗陌l(fā)生是由于減少的多巴胺釋放的結(jié)果多巴胺釋放的細(xì)胞的損失增加腦細(xì)胞活動(dòng)，以改善運(yùn)動(dòng)功能。在帕金森氏病的醫(yī)療和外科治療的益處局限性激發(fā)了努力開(kāi)發(fā)新的治療方法?；蛑委熞殉^(guò)對(duì)帕金森氏癥的常規(guī)治療，因?yàn)樗赡鼙３只蛲ㄟ^(guò)使用生長(zhǎng)因子還原多巴胺能神經(jīng)元或備選增加多巴胺合成所需的酶的可用性常規(guī)處理不同的理論優(yōu)勢(shì)。在過(guò)去的10年中，3種不同的策略已經(jīng)出現(xiàn)，并已在精心設(shè)計(jì)的人類治療方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明提供了一種治療帕金森病的基因及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種治療帕金森病的基因，其特征在序列如seqidno.1所示。含有權(quán)利要求1所述序列的重組質(zhì)粒。權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于序列如seqidno.2所示。seqidno.1所示基因在制備治療帕金森病產(chǎn)品中的應(yīng)用。構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述基因的慢病毒載體的方法，其特征在于包括以下步驟：a.用pcr方法擴(kuò)增seqidno.1所示基因；b.將seqidno.1所示基因克隆到慢病毒載體中；c.制備感受態(tài)細(xì)胞；d.將步驟b制得的慢病毒載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；e.從平板上挑取克隆菌落，質(zhì)粒抽提并做鑒定挑出陽(yáng)性克??；f.純化提取的質(zhì)粒并鑒定。步驟a中所使用的引物為：正向引物：tccagcctccggatccgccaccatgtacccatacgacgtcccag；反向引物：tcgacatgatgctcgagtcagctcctaatgagagtcagg。步驟e中所使用的引物為：正向引物：tgtccaggatgagctggacac；反向引物：catagcgtaaaaggagcaaca。有益效果：本發(fā)明提供的慢病毒載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)用自體滅活的設(shè)計(jì)將大大減低傳統(tǒng)的病毒會(huì)激活附近的癌基因而導(dǎo)致白血病的可能性。融合gfp顯色基因的酪氨酸羥化酶、芳香族氨基酸脫羧酶與谷丙轉(zhuǎn)氨酶環(huán)的基因被分成兩部分置于慢病毒載體。上游載體帶有cmv啟動(dòng)子，gfp表達(dá)序列和編碼酪氨酸羥化酶、芳香族氨基酸脫羧酶與谷丙轉(zhuǎn)氨酶環(huán)的基因和多聚a信號(hào)尾端。帕金森病患者的紋狀體神經(jīng)元經(jīng)過(guò)基因轉(zhuǎn)染將具有合成多巴胺的能力。這些神經(jīng)元缺乏正常的多巴胺能神經(jīng)元的其他機(jī)制，包括將合成多巴胺儲(chǔ)存到突觸囊泡(通過(guò)囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體2)，釋放后再攝取(質(zhì)膜多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體，dat)，以及合成和釋放的自我調(diào)節(jié)(多巴胺d2樣自身受體)。達(dá)到提高腦內(nèi)多巴胺含量，改善帕金森病癥狀的治療效果。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于，它可能讓病人停止左旋多巴治療。附圖說(shuō)明圖1為酶切圖譜，用bamhi-hf和xhoi對(duì)工具載體進(jìn)行酶切，回收6508bp載體片段；圖2為pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜；圖3為菌落pcr鑒定圖；圖4為慢病毒載體在大鼠雙側(cè)紋狀體內(nèi)注射后da釋放圖；圖5為慢病毒載體在大鼠雙側(cè)紋狀體內(nèi)注射后帕金森鼠癥狀改善示意圖；圖6為慢病毒載體在大鼠雙側(cè)紋狀體內(nèi)注射后帕金森鼠腦部組織的病理改善示意圖；圖7為慢病毒載體在大鼠雙側(cè)紋狀體內(nèi)注射后帕金森鼠體內(nèi)da的含量測(cè)定圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1：第一部分：說(shuō)明本發(fā)明方法完整的步驟(ddc,th,gch1)載體構(gòu)建完成報(bào)告實(shí)驗(yàn)流程描述：pcr擴(kuò)增目的基因。表達(dá)載體酶切后進(jìn)行膠回收載體片段。目的基因與載體片段同源重組后轉(zhuǎn)化e.coli感受態(tài)細(xì)胞。用菌落pcr鑒定轉(zhuǎn)化子，陽(yáng)性克隆送測(cè)序。測(cè)序無(wú)誤的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提。實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。多克隆位點(diǎn)：用bamhi-hf和xhoi對(duì)工具載體進(jìn)行酶切，回收6508bp載體片段，酶切圖譜如圖2所示。目的基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)合成：1.primer1(+)tccagcctccggatccgccaccatgtacccatacgacgtcccag引物說(shuō)明：用于pcr釣取目的基因2.primer2(－)tcgacatgatgctcgagtcagctcctaatgagagtcagg引物說(shuō)明：用于pcr釣取目的基因3.primerid(+)tgtccaggatgagctggacac引物說(shuō)明：用于菌落pcr鑒定轉(zhuǎn)化子。4.primerid(－)catagcgtaaaaggagcaaca引物說(shuō)明：用于菌落pcr鑒定轉(zhuǎn)化子。pcr反應(yīng)體系為：試劑體積(μl)h2o32.55×buffer(withmg2+)10dntp(各2.5mm)4primer1(+)(10μm)1primer2(－)(10μm)1template1primestar0.5primer1+2：pcr產(chǎn)物大小：4797bppcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜(圖3)：pcr循環(huán)條件：目的基因同源重組入表達(dá)載體：將目的dna片段和線性化載體以摩爾比2:1加到試管中進(jìn)行重組反應(yīng)：試劑陽(yáng)性對(duì)照(μl)自連對(duì)照(μl)連接組(μl)膠回收后的目的基因片段444線性化的表達(dá)載體111無(wú)縫克隆反應(yīng)液15015ddh2oupto20upto20upto20混勻后在42℃孵育30分鐘，然后轉(zhuǎn)移到冰上。放置2-3分鐘后取10μl反應(yīng)液體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中。說(shuō)明：陽(yáng)性對(duì)照和自連對(duì)照，加入的載體和連接組一致，但陽(yáng)性對(duì)照加入的基因片段是目的基因(帶有同樣的同源重組交換臂)轉(zhuǎn)化：取一支感受態(tài)細(xì)胞(每管100μl，-80℃保存)于冰上，待溶解后加入10μl連接液，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘。1.將管放到預(yù)加溫到42℃的恒溫水浴鍋中熱激90秒。2.快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3分鐘。3.每管加900μllb培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育1小時(shí)使細(xì)菌復(fù)蘇。4.取恰當(dāng)量的轉(zhuǎn)化菌液涂布于lb瓊脂平板上(含表達(dá)載體相應(yīng)的抗生素)。倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，16小時(shí)。陽(yáng)性克隆鑒定：挑取平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子重懸于10μllb培養(yǎng)液中，從中取1μl做模板進(jìn)行菌落pcr鑒定。pcr儀進(jìn)行反應(yīng)，按以下循環(huán)條件：菌落pcr鑒定圖(圖3)挑取的4個(gè)轉(zhuǎn)化子接種陽(yáng)性克隆，保種并分裝100μl送測(cè)序。測(cè)序沒(méi)有問(wèn)題的，再接種抽提質(zhì)粒。陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果分析:陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果表明，和預(yù)期的目的基因序列基本一致，載體序列如seqidno.1所示，目的序列如seqidno.2所示。慢病毒的包裝、濃縮和滴度測(cè)定用于包裝的293t細(xì)胞(atccno.crl-11268)必需選擇處于生長(zhǎng)旺盛期，細(xì)胞狀態(tài)較佳，存活率90％以上，細(xì)胞邊緣清晰，傳代次數(shù)較低。任何時(shí)候細(xì)胞匯合率都不準(zhǔn)達(dá)到100％。a.慢病毒的包裝預(yù)先準(zhǔn)備2個(gè)t10cm培養(yǎng)皿的293t細(xì)胞，培養(yǎng)基為dmem+10％fbs，1％glutamax，1％青霉素-鏈霉素。將細(xì)胞分到10個(gè)10cm培養(yǎng)皿中，每瓶的細(xì)胞密度約1×107個(gè)。第二天，鏡下檢查細(xì)胞。細(xì)胞融合度應(yīng)大致為80-90％，分布均勻。轉(zhuǎn)染前1小時(shí)，取出細(xì)胞板，去除原有細(xì)胞培養(yǎng)基，加入9ml的opti-mem培養(yǎng)基，將細(xì)胞送回培養(yǎng)箱。取兩支無(wú)菌的15ml離心管，其中一支中加入100μg慢病毒載體，65μgdr8.9包裝質(zhì)粒和35μgvsvg質(zhì)粒，用opti-mem培養(yǎng)基補(bǔ)齊到5ml。另一支中加入500μltrans-ez溶液和4.5mlopti-mem培養(yǎng)基，用電動(dòng)移液器輕輕混勻。將trans-ez稀釋液滴加到質(zhì)粒管中，邊加邊輕輕晃勻。室溫孵育20分鐘，使dna和trans-ez充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體。取1支5ml的移液管，將得到的dna-trans-ez復(fù)合體均勻滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，每板1ml。來(lái)回晃動(dòng)培養(yǎng)板，混勻后放回到5％二氧化碳培養(yǎng)箱。6小時(shí)后，移去細(xì)胞上清，更換為10ml的dmem完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后一天觀察細(xì)胞，所有的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)都是健康的并且密度接近60–80％。如果所轉(zhuǎn)染質(zhì)粒帶有g(shù)fp熒光，那么這時(shí)候可以看到大于95％的細(xì)胞都是帶有熒光的。將細(xì)胞送回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2天(36-48小時(shí))。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)逐漸融合形成多核體，大多數(shù)的細(xì)胞依然貼壁。收集所有的上清，分裝到50ml離心管中。4℃，500g離心10分鐘，除去脫落的細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片?？偟纳锨寮s為160ml，用60ml0.22μmpvdf過(guò)濾裝置過(guò)濾。如果發(fā)現(xiàn)濾膜被堵住，表現(xiàn)為過(guò)濾速度變慢，更換新的濾器。b.慢病毒的濃縮與純化超速離心沉淀法取6個(gè)μltra-clearsw28離心管，用70％乙醇消毒后，放在超凈工作臺(tái)中打開(kāi)紫外燈繼續(xù)消毒30分鐘。每個(gè)μltra-clearsw28離心管中加入約32ml的預(yù)先處理的病毒上清液。取一支10ml的移液管，吸取12ml20％的蔗糖溶液。將移液管一直插入到離心管的底部，緩慢將蔗糖溶液打出4ml。同樣地，將剩下8ml的蔗糖溶液分別加入到另兩個(gè)離心管中。另取一支干凈的移液管，對(duì)剩下3管進(jìn)行同樣處理。用pbs調(diào)整各管的重量，使對(duì)應(yīng)的離心管之間的重量相差不超過(guò)0.1g。按次序?qū)⑺?個(gè)離心管放入beckmansw28超速離心轉(zhuǎn)頭中。4℃，25，000rpm.(82，700g)離心2小時(shí)。小心將管子從轉(zhuǎn)頭中取出。倒掉上清，將離心管倒扣在紙巾上放置10分鐘使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底應(yīng)當(dāng)有可見(jiàn)的沉淀。每管中加入200μl不含血清的opti-mem洗下沉淀。將sw28超速離心管插入到50ml錐底離心管中，蓋上蓋子。在4℃溶解2小時(shí)，每隔20分鐘輕輕震蕩。4℃，500g離心1分鐘，使溶液集中于管底。用200μl移液器輕柔吹打使沉淀重懸。避免產(chǎn)生泡沫。將所有管中的液體集中到一個(gè)sw28離心管中。集中后的病毒懸液分裝成50μl每份，保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲(chǔ)存在-80℃。c.病毒滴度的測(cè)定定量pcr法病毒感染1天，取24孔板接種293t細(xì)胞。每孔細(xì)胞為5×104個(gè)，所加培養(yǎng)基體積為100μl,不同種類的細(xì)胞生長(zhǎng)速度有所差異，我保證有較好的實(shí)驗(yàn)效果，進(jìn)行病毒感染時(shí)的細(xì)胞融合率為40％-60％，因?yàn)閘entivirus表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)，故在進(jìn)行感染時(shí)細(xì)胞接種不宜過(guò)密；第二天，準(zhǔn)備3個(gè)無(wú)菌ep管，在每個(gè)管中加入90μl的新鮮完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs)接種細(xì)胞24小時(shí)后，取兩個(gè)孔的細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，確定感染時(shí)細(xì)胞的實(shí)際數(shù)目，記為n。取待測(cè)定的病毒原液10μl加入到第一個(gè)管中，輕輕混勻后，取10μl加入到第二個(gè)管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410μl完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs),終體積為500μl；第三天，感染開(kāi)始后20小時(shí)，除去培養(yǎng)上清，更換為500μl完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs)，5％co2繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。3～4天后，觀察熒光表達(dá)情況，正常情況下，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相應(yīng)減少,并拍照留檔。用0.2ml0.25％胰酶-edta溶液消化細(xì)胞，在37℃放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗整個(gè)細(xì)胞面，離心收集細(xì)胞。按照dneasy試劑盒的說(shuō)明抽提基因組dna。每個(gè)樣品管中加入200μl洗脫液洗下dna。用dna定量試劑盒定量(bio-rad)?；蚪Mdna可以穩(wěn)定保存在–20℃至少2個(gè)月。準(zhǔn)備pcr所需的試劑和樣品。為病毒序列檢測(cè)引物配總管?。?×taqmanmastermix25μl×nforwardprimer(100pmol·ml-1)0.1μl×nreverseprimer(100pmol·ml-1)0.1μl×nprobe(100pmol·ml-1)0.1μl×nh2o19.7μl×nn＝numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlh2o混和。震蕩后放在冰上。為人基因組序列檢測(cè)引物配總管ⅱ：2×taqmanmastermix25μl×n10×rnasepprimer/probemix2.5μl×nh2o17.5μl×nn＝numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，100μl10×rnasepprimer/probemix和700μlh2o混和。震蕩后放在冰上。在預(yù)冷的96孔pcr板上完成pcr體系建立。從總管ⅰ中各取45μl加入到a-d各行的孔中，從總管ⅱ中各取45μl加入到e-g各行的孔中。分別取5μl質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品基因組dna加入到a-d行中，每個(gè)樣品重復(fù)1次。另留1個(gè)孔加入5μl的水做為無(wú)模板對(duì)照(no-templatecontrol)。分別取5μl基因組標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品基因組dna加入到e-g行中，每個(gè)樣品重復(fù)1次。另留1個(gè)孔加入5μl的水做為無(wú)模板對(duì)照(no-templatecontrol)。所使用定量pcr儀為abiprism7000定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為：50℃2分鐘，95℃10分鐘，然后是95℃15秒，60℃1分鐘的40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析：測(cè)得的dna樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定，得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度(integrationunitsperml，iuml-1)的計(jì)算公式如下：iuml-1＝(c×n×d×1000)/v其中：c＝平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)n＝感染時(shí)細(xì)胞的數(shù)目(約為1×105)d＝病毒載體的稀釋倍數(shù)v＝加入的稀釋病毒的體積數(shù)a、滴度照片及滴度結(jié)果1)qpcr表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告引物序列表定量數(shù)值及分析(2-δδct分析法)樣品說(shuō)明：1.blank為293t空細(xì)胞；2.pmt174為對(duì)照病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞；3.pse2473為thtyrosinehydroxylase基因過(guò)表達(dá)病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞。real-timepcr檢測(cè)結(jié)果顯示：pse2473過(guò)表達(dá)病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，結(jié)果顯示thtyrosinehydroxylase基因過(guò)表達(dá)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>金慶文,丁新生<120>治療帕金森病的基因及其應(yīng)用<130><160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>4725<212>dna<213>人工序列<400>1aacgcaagtgaattccgaaggagagggaaggagatggtggattacgtggccaactacatg60gaaggcattgagggacgccaggtctaccctgacgtggagcccgggtacctgcggccgctg120atccctgccgctgcccctcaggagccagacacgtttgaggacatcatcaacgacgttgag180aagataatcatgcctggggtgacgcactggcacagcccctacttcttcgcctacttcccc240actgccagctcgtacccggccatgcttgcggacatgctgtgcggggccattggctgcatc300ggcttctcctgggcggcaagcccagcatgcacagagctggagactgtgatgatggactgg360ctcgggaagatgctggaactaccaaaggcatttttgaatgagaaagctggagaaggggga420ggagtgatccagggaagtgccagtgaagccaccctggtggccctgctggccgctcggacc480aaagtgatccatcggctgcaggcagcgtccccagagctcacacaggccgctatcatggag540aagctggtggcttactcatccgatcaggcacactcctcagtggaaagagctgggttaatt600ggtggagtgaaattaaaagccatcccctcagatggcaacttcgccatgcgtgcgtctgcc660ctgcaggaagccctggagagagacaaagcggctggcctgattcctttctttatggttgcc720accctggggaccacaacatgctgctcctttgacaatctcttagaagtcggtcctatctgc780aacaaggaagacatatggctgcacgttgatgcagcctacgcaggcagtgcattcatctgc840cctgagttccggcaccttctgaatggagtggagtttgcagattcattcaactttaatccc900cacaaatggctattggtgaattttgactgttctgccatgtgggtgaaaaagagaacagac960ttaacgggagcctttagactggaccccacttacctgaagcacagccatcaggattcaggg1020cttatcactgactaccggcattggcagataccactgggcagaagatttcgctctttgaaa1080atgtggtttgtatttaggatgtatggagtcaaaggactgcaggcttatatccgcaagcat1140gtccagctgtcccatgagtttgagtcactggtgcgccaggatccccgctttgaaatctgt1200gtggaagtcattctggggcttgtctgctttcggctaaagggttccaacaaagtgaatgaa1260gctcttctgcaaagaataaacagtgccaaaaaaatccacttggttccatgtcacctcagg1320gacaagtttgtcctgcgctttgccatctgttctcgcacggtggaatctgcccatgtgcag1380cgggcctgggaacacatcaaagagctggcggccgacgtgctgcgagcagagagggagtag1440ctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagt1500atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctcccca1560gcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgccccta1620actccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctga1680ctaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaag1740tagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtata1800tccattttcggccaccatggagcagaaactcatctctgaagaggatctgcccacccccga1860cgccaccacgccacaggccaagggcttccgcagggccgtgtctgagctggacgccaagca1920ggcagaggccatcatggtaagagggcagggcgccccggggcccagcctcacaggctctcc1980gtggcctggaactgcagccccagctgcatcctacacccccaccccaaggtccccgcggtt2040cattgggcgcaggcagagcctcatcgaggacgcccgcaaggagcgggaggcggcggtggc2100agcagcggccgctgcagtcccctcggagcccggggaccccctggaggctgtggcctttga2160ggagaaggaggggaaggccgtgctaaacctgctcttctccccgagggccaccaagccctc2220ggcgctgtcccgagctgtgaaggtgtttgagacgtttgaagccaaaatccaccatctaga2280gacccggcccgcccagaggccgcgagctgggggcccccacctggagtacttcgtgcgcct2340cgaggtgcgccgaggggacctggccgccctgctcagtggtgtgcgccaggtgtcagagga2400cgtgcgcagccccgcggggcccaaggtcccctggttcccaagaaaagtgtcagagctgga2460caagtgtcatcacctggtcaccaagttcgaccctgacctggacttggaccacccgggctt2520ctcggaccaggtgtaccgccagcgcaggaagctgattgctgagatcgccttccagtacag2580gcacggcgacccgattccccgtgtggagtacaccgccgaggagattgccacctggaagga2640ggtctacaccacgctgaagggcctctacgccacgcacgcctgcggggagcacctggaggc2700ctttgctttgctggagcgcttcagcggctaccgggaagacaatatcccccagctggagga2760cgtctcccgcttcctgaaggagcgcacgggcttccagctgcggcctgtggccggcctgct2820gtccgcccgggacttcctggccagcctggccttccgcgtgttccagtgcacccagtatat2880ccgccacgcgtcctcgcccatgcactcccctgagccggactgctgccacgagctgctggg2940gcacgtgcccatgctggccgaccgcaccttcgcgcagttctcgcaggacattggcctggc3000gtccctgggggcctcggatgaggaaattgagaagctgtccacgctgtactggttcacggt3060ggagttcgggctgtgtaagcagaacggggaggtgaaggcctatggtgccgggctgctgtc3120ctcctacggggagctcctgcactgcctgtctgaggagcctgagattcgggccttcgaccc3180tgaggctgcggccgtgcagccctaccaagaccagacgtaccagtcagtctacttcgtgtc3240tgagagcttcagtgacgccaaggacaagctcaggagctatgcctcacgcatccagcgccc3300cttctccgtgaagttcgacccgtacacgctggccatcgacgtgctggacagcccccaggc3360cgtgcggcgctccctggagggtgtccaggatgagctggacacccttgcccatgcgctgag3420tgccattggctagaattctaccgggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagca3480tgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcaca3540cattccacatccaccggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgcca3600ccttctactcctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgcagctcgcgtcgtgcagg3660acgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgag3720caatggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttc3780tgggctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctcaggggc3840ggggcgggcgcccgaaggtcctccggaggcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacg3900tctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcggccaccatggattacaag3960gatgacgacgataaggagaagggccctgtgcgggcaccggcggagaagccgcggggcgcc4020aggtgcagcaatgggttccccgagcgggatccgccgcggcccgggcccagcaggccggcg4080gagaagcccccgcggcccgaggccaagagcgcgcagcccgcggacggctggaagggcgag4140cggccccgcagcgaggaggataacgagctgaacctccctaacctggcagccgcctactcg4200tccatcctgagctcgctgggcgagaacccccagcggcaagggctgctcaagacgccctgg4260agggcggcctcggccatgcagttcttcaccaagggctaccaggagaccatctcagatgtc4320ctaaacgatgctatatttgatgaagatcatgatgagatggtgattgtgaaggacatagac4380atgttttccatgtgtgagcatcacttggttccatttgttggaaaggtccatattggttat4440cttcctaacaagcaagtccttggcctcagcaaacttgcgaggattgtagaaatctatagt4500agaagactacaagttcaggagcgccttacaaaacaaattgctgtagcaatcacggaagcc4560ttgcggcctgctggagtcggggtagtggttgaagcaacacacatgtgtatggtaatgcga4620ggtgtacagaaaatgaacagcaaaactgtgaccagcacaatgttgggtgtgttccgggag4680gatccaaagactcgggaagagttcctgactctcattaggagctga4725<210>2<211>4874<212>dna<213>人工序列<400>2ccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccggga60ccgatccagcctccggatccgccaccatgtacccatacgacgtcccagactacgctaacg120caagtgaattccgaaggagagggaaggagatggtggattacgtggccaactacatggaag180gcattgagggacgccaggtctaccctgacgtggagcccgggtacctgcggccgctgatcc240ctgccgctgcccctcaggagccagacacgtttgaggacatcatcaacgacgttgagaaga300taatcatgcctggggtgacgcactggcacagcccctacttcttcgcctacttccccactg360ccagctcgtacccggccatgcttgcggacatgctgtgcggggccattggctgcatcggct420tctcctgggcggcaagcccagcatgcacagagctggagactgtgatgatggactggctcg480ggaagatgctggaactaccaaaggcatttttgaatgagaaagctggagaagggggaggag540tgatccagggaagtgccagtgaagccaccctggtggccctgctggccgctcggaccaaag600tgatccatcggctgcaggcagcgtccccagagctcacacaggccgctatcatggagaagc660tggtggcttactcatccgatcaggcacactcctcagtggaaagagctgggttaattggtg720gagtgaaattaaaagccatcccctcagatggcaacttcgccatgcgtgcgtctgccctgc780aggaagccctggagagagacaaagcggctggcctgattcctttctttatggttgccaccc840tggggaccacaacatgctgctcctttgacaatctcttagaagtcggtcctatctgcaaca900aggaagacatatggctgcacgttgatgcagcctacgcaggcagtgcattcatctgccctg960agttccggcaccttctgaatggagtggagtttgcagattcattcaactttaatccccaca1020aatggctattggtgaattttgactgttctgccatgtgggtgaaaaagagaacagacttaa1080cgggagcctttagactggaccccacttacctgaagcacagccatcaggattcagggctta1140tcactgactaccggcattggcagataccactgggcagaagatttcgctctttgaaaatgt1200ggtttgtatttaggatgtatggagtcaaaggactgcaggcttatatccgcaagcatgtcc1260agctgtcccatgagtttgagtcactggtgcgccaggatccccgctttgaaatctgtgtgg1320aagtcattctggggcttgtctgctttcggctaaagggttccaacaaagtgaatgaagctc1380ttctgcaaagaataaacagtgccaaaaaaatccacttggttccatgtcacctcagggaca1440agtttgtcctgcgctttgccatctgttctcgcacggtggaatctgcccatgtgcagcggg1500cctgggaacacatcaaagagctggcggccgacgtgctgcgagcagagagggagtagctgt1560ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgc1620aaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcag1680gcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactc1740cgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaa1800ttttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagt1860gaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatcca1920ttttcggccaccatggagcagaaactcatctctgaagaggatctgcccacccccgacgcc1980accacgccacaggccaagggcttccgcagggccgtgtctgagctggacgccaagcaggca2040gaggccatcatggtaagagggcagggcgccccggggcccagcctcacaggctctccgtgg2100cctggaactgcagccccagctgcatcctacacccccaccccaaggtccccgcggttcatt2160gggcgcaggcagagcctcatcgaggacgcccgcaaggagcgggaggcggcggtggcagca2220gcggccgctgcagtcccctcggagcccggggaccccctggaggctgtggcctttgaggag2280aaggaggggaaggccgtgctaaacctgctcttctccccgagggccaccaagccctcggcg2340ctgtcccgagctgtgaaggtgtttgagacgtttgaagccaaaatccaccatctagagacc2400cggcccgcccagaggccgcgagctgggggcccccacctggagtacttcgtgcgcctcgag2460gtgcgccgaggggacctggccgccctgctcagtggtgtgcgccaggtgtcagaggacgtg2520cgcagccccgcggggcccaaggtcccctggttcccaagaaaagtgtcagagctggacaag2580tgtcatcacctggtcaccaagttcgaccctgacctggacttggaccacccgggcttctcg2640gaccaggtgtaccgccagcgcaggaagctgattgctgagatcgccttccagtacaggcac2700ggcgacccgattccccgtgtggagtacaccgccgaggagattgccacctggaaggaggtc2760tacaccacgctgaagggcctctacgccacgcacgcctgcggggagcacctggaggccttt2820gctttgctggagcgcttcagcggctaccgggaagacaatatcccccagctggaggacgtc2880tcccgcttcctgaaggagcgcacgggcttccagctgcggcctgtggccggcctgctgtcc2940gcccgggacttcctggccagcctggccttccgcgtgttccagtgcacccagtatatccgc3000cacgcgtcctcgcccatgcactcccctgagccggactgctgccacgagctgctggggcac3060gtgcccatgctggccgaccgcaccttcgcgcagttctcgcaggacattggcctggcgtcc3120ctgggggcctcggatgaggaaattgagaagctgtccacgctgtactggttcacggtggag3180ttcgggctgtgtaagcagaacggggaggtgaaggcctatggtgccgggctgctgtcctcc3240tacggggagctcctgcactgcctgtctgaggagcctgagattcgggccttcgaccctgag3300gctgcggccgtgcagccctaccaagaccagacgtaccagtcagtctacttcgtgtctgag3360agcttcagtgacgccaaggacaagctcaggagctatgcctcacgcatccagcgccccttc3420tccgtgaagttcgacccgtacacgctggccatcgacgtgctggacagcccccaggccgtg3480cggcgctccctggagggtgtccaggatgagctggacacccttgcccatgcgctgagtgcc3540attggctagaattctaccgggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagcatgcg3600ctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacatt3660ccacatccaccggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccacctt3720ctactcctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgcagctcgcgtcgtgcaggacgt3780gacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaat3840ggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttctggg3900ctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctcaggggcgggg3960cgggcgcccgaaggtcctccggaggcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctg4020ccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcggccaccatggattacaaggatg4080acgacgataaggagaagggccctgtgcgggcaccggcggagaagccgcggggcgccaggt4140gcagcaatgggttccccgagcgggatccgccgcggcccgggcccagcaggccggcggaga4200agcccccgcggcccgaggccaagagcgcgcagcccgcggacggctggaagggcgagcggc4260cccgcagcgaggaggataacgagctgaacctccctaacctggcagccgcctactcgtcca4320tcctgagctcgctgggcgagaacccccagcggcaagggctgctcaagacgccctggaggg4380cggcctcggccatgcagttcttcaccaagggctaccaggagaccatctcagatgtcctaa4440acgatgctatatttgatgaagatcatgatgagatggtgattgtgaaggacatagacatgt4500tttccatgtgtgagcatcacttggttccatttgttggaaaggtccatattggttatcttc4560ctaacaagcaagtccttggcctcagcaaacttgcgaggattgtagaaatctatagtagaa4620gactacaagttcaggagcgccttacaaaacaaattgctgtagcaatcacggaagccttgc4680ggcctgctggagtcggggtagtggttgaagcaacacacatgtgtatggtaatgcgaggtg4740tacagaaaatgaacagcaaaactgtgaccagcacaatgttgggtgtgttccgggaggatc4800caaagactcgggaagagttcctgactctcattaggagctgactcgagcatcatgtcgaca4860atcaacctctggat4874<210>3<211>44<212>dna<213>人工序列<400>3tccagcctccggatccgccaccatgtacccatacgacgtcccag44<210>4<211>39<212>dna<213>人工序列<400>4tcgacatgatgctcgagtcagctcctaatgagagtcagg39<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5tgtccaggatgagctggacac21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<400>6catagcgtaaaaggagcaaca21<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7ttcccaagaaaagtgtcagag21<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列<400>8gtccaagtccaggtcagg18<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9catgtacgttgctatccaggc21<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10ctccttaatgtcacgcacgat21當(dāng)前第1頁(yè)12