Epb41l4b基因在帕金森病診治中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及人EPB41L4B基因在帕金森病診斷、治療中 的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 帕金森?。≒arkinson'Sdisease,PD)是一種中老年常見的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性 疾病，臨床上W震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)異常為主要特征。病理特征不僅包括引 起核屯、的運(yùn)動(dòng)障礙癥狀的黑質(zhì)-紋狀體多己胺能系統(tǒng)變性，而且包括中樞、外周和自主神 經(jīng)系統(tǒng)的多祀點(diǎn)侵犯，并伴有廣泛的路易小體和路易軸突的形成。帕金森疾病中黑質(zhì)神經(jīng) 細(xì)胞死亡的原因尚不完全清楚，普遍認(rèn)為與環(huán)境毒素、基因突變、遺傳因素、氧化應(yīng)激、免疫 系統(tǒng)異常、鐵離子聚集和神經(jīng)興奮毒性增強(qiáng)等諸多機(jī)制有關(guān)。隨著人口老齡化的加劇和人 們生活節(jié)奏的增快，WPD為代表的中樞神經(jīng)退行性疾病已經(jīng)成為僅次于屯、血管疾病、惡性 腫瘤W及中風(fēng)之后的主要致死性疾病，給患者W及全社會(huì)都造成十分嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。帕金森 病是一種慢性進(jìn)展性疾病，具有高度異質(zhì)性，目前尚不能治愈。嚴(yán)重者可全身僵硬，生活不 能自理，甚至長(zhǎng)期邸床，最終多死于肺炎等并發(fā)癥。
[0003] 帕金森病的診斷主要是實(shí)驗(yàn)室檢查輔助WCT、MRI、SPECT、PET等影像表現(xiàn)，由于 缺乏疾病特異性生物標(biāo)志物和有效的實(shí)驗(yàn)室輔助檢測(cè)方法，所W帕金森病在臨床前期無(wú)法 檢測(cè)。當(dāng)該病發(fā)展到臨床期時(shí)，患者中腦多己胺神經(jīng)元蟻?zhàn)円堰_(dá)70%。因此早診早治是目 前改善帕金森病患者長(zhǎng)期生存的最佳途徑。帕金森病的輔助檢測(cè)方法如99mTc-TR0DAT-l 等作為示蹤劑行多己胺轉(zhuǎn)運(yùn)體功能顯像可支持診斷，但是檢查費(fèi)用較貴，難W在臨床大規(guī) 模地推廣。因此尋找一種特異和敏感的診斷方法愈發(fā)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于帕金森病診斷的分 子標(biāo)志物EPB41L4B基因。相比傳統(tǒng)的帕金森病的診斷方法，使用基因標(biāo)志物來(lái)診斷帕金森 病具有及時(shí)性、特異性和靈敏性，從而使患者在早期就能知曉疾病風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高低，采 取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。 陽(yáng)〇化]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種EPB41L4B基因在制備診斷帕金森病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0007] 進(jìn)一步，上面所提到的診斷產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位 雜交或忍片檢測(cè)EPB41L4B基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平W診斷帕金森病的產(chǎn)品。
[0008] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷帕金森病的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增EPB41L4B基 因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷帕金森病的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增EPB41L4B基 因的引物；所述用免疫檢測(cè)診斷帕金森病的產(chǎn)品包括：與EPB41L4B蛋白特異性結(jié)合的抗 體；所述用原位雜交診斷帕金森病的產(chǎn)品包括：與EPB41L4B基因的核酸序列雜交的探針； 所述用忍片診斷帕金森病的產(chǎn)品包括：蛋白質(zhì)忍片和基因忍片；其中，蛋白質(zhì)忍片包括與 EPB41L4B蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因忍片包括與EPB41L4B基因的核酸序列雜交的探針。
[0009] 優(yōu)選地，所述產(chǎn)品包括忍片、試劑盒。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種診斷帕金森病的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括但不限于忍片、試劑盒。
[0011] 其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白質(zhì)忍片；所述基因忍片包括固相載體W及固定 在固相載體上的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括用于檢測(cè)EPB41L4B基因轉(zhuǎn)錄水平 的針對(duì)EPB41L4B基因的寡核巧酸探針；所述蛋白質(zhì)忍片包括固相載體W及固定在固相載 體上的EPB41L4B蛋白的特異性抗體。所述基因忍片可用于檢測(cè)包括人EPB41L4B基因在內(nèi) 的多個(gè)基因（例如與帕金森病相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)忍片可用于檢測(cè) 包括人EPB41L4B蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)（例如與帕金森病相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水 平。通過將多個(gè)帕金森病的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高帕金森診斷的準(zhǔn)確率。
[0012] 其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè) 試劑盒包括用于檢測(cè)EPB41L4B基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括 EPB41L4B蛋白的特異性抗體。
[0013] 進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或忍片方 法檢測(cè)EPB41L4B基因表達(dá)水平的試劑。優(yōu)選地，所述試劑包括針對(duì)EPB41L4B基因的引物 和/或探針。根據(jù)EPB41L4B核巧酸序列信息設(shè)計(jì)出可W用于檢測(cè)EPB41L4B基因表達(dá)水平 的引物和探針。
[0014] 進(jìn)一步，與EPB41L4B基因的核酸序列雜交的探針可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合 體、PNA或其它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒有限制，只要能完成特異性雜交、與目的核巧酸序 列特異性結(jié)合，任何長(zhǎng)度都可W。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。 同樣，所述探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不 同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿 基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過30個(gè)堿基對(duì)，與目的核巧酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度W 15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。 所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，W免影響雜交效率。
[0015] 進(jìn)一步，所述EPB41L4B蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述 EPB41L4B蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾。例如，嵌合抗 體、scFv、F油、F(油'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與EPB41L4B蛋白的結(jié)合能力即可。 用于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可W使用任何方法來(lái) 制備所述抗體。
[0016] 本發(fā)明還提供了EPB41L4B基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng) 用。 陽(yáng)017] 進(jìn)一步，上面所述的藥物包括含有EPB41L4B基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑。
[0018] 進(jìn)一步，所述抑制劑包括抑制EPB41L4B基因表達(dá)的物質(zhì)、影響EPB41L4B基因表達(dá) 產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制EPB41L4B基因表達(dá)產(chǎn)物活性的物質(zhì)。
[0019] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述的治療帕金森病的藥物包括：通過干擾RNA抑制EPB41L4B基 因表達(dá)的雙鏈核糖核酸，或基于EPB41L4B抗原蛋白的腫瘤疫苗、或用于抑制EPB41L4B蛋白 活性的蛋白質(zhì)。
[0020] 優(yōu)選地，所述抑制劑為針對(duì)EPB41L4B的siRNA。
[0021] 本發(fā)明還提供了上面所述的抑制劑在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用。
[0022] 在本發(fā)明中，所述RNA干擾（RNAinterference,RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈 RNA(double-strandedRNA，dsRNA)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，從而導(dǎo)致祀基因 的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失的現(xiàn)象。RNAi技術(shù)是一種典型的負(fù)調(diào)控機(jī)制，使用該 技術(shù)可W特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能、基因治 療及新藥開發(fā)領(lǐng)域。W細(xì)胞為基礎(chǔ)的RNAi篩選在功能基因?qū)W研究方面具有許多優(yōu)勢(shì)，主要 表現(xiàn)在大多數(shù)細(xì)胞類型都能使用RNAi方法，并且相對(duì)較容易下調(diào)或沉默目的基因的表達(dá)。 陽(yáng)02引為了確保EPB41L4B基因能夠被高效剔除或沉默，根據(jù)EPB41L4B基因的mRNA 序列設(shè)計(jì)了siRNA特異性片段。siRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表的通用設(shè)計(jì)原則巧化ashir et.al2001，Schwarzet.al2003，趾vorovaet.al2003，Reynoldset.al2004， Hsiehet.al2004，Ui-Teiet.al2004)，通過在線工具完成設(shè)計(jì)，該在線工具為： siRNASelectionProgramofWhiteheadInstitute(BingbingYuanet.al2004，http:// jura.wi.mit.edu/bi°C/siRNAext/)和M/CK-iTTMRNA