本發(fā)明屬于發(fā)酵后提取領(lǐng)域，具體涉及一種從轉(zhuǎn)化液中提取左旋多巴的方法。

背景技術(shù)：

左旋多巴又名3,4-二羥基苯丙氨酸，為白色結(jié)晶性粉末，無臭無味，在乙醇、氯仿和丙酮中不溶，在稀酸中易溶，作為一種重要的生物活性物質(zhì)，左旋多巴是神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的前體，可以通過血腦屏障，進(jìn)入腦循環(huán)而到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在中樞神經(jīng)脫羧酶的作用下，轉(zhuǎn)化為多巴胺，從而使腦組織中多巴胺含量增加達(dá)到治療帕金森疾病。

左旋多巴是治療老年帕金森病的首選和最有效藥物，除此之外，左旋多巴還具有治療弱視和心力衰竭的作用，雖然在長時間的使用以后會有一些副作用，但是四十余年過去了，目前仍然沒有更好的替代藥物出現(xiàn)。目前市面上的藥物或者是植物提取，或者是化學(xué)合成，但是均無法保證原料來源，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場需求，據(jù)統(tǒng)計，2015年左旋多巴的全球銷售總額達(dá)到了3.3億美元，在世界暢銷藥中排名第97位，其總產(chǎn)量達(dá)到了2000噸以上，預(yù)計未來5-10年全球銷售總額有望達(dá)到10億美元，隨著分子生物學(xué)及生物技術(shù)的迅速發(fā)展，利用生物合成左旋多巴已經(jīng)成為一種很有競爭力、前途光明的方法。

左旋多巴的生產(chǎn)方法有天然植物提取法、化學(xué)合成本法和微生物酶轉(zhuǎn)化法。傳統(tǒng)的制取方法是主要是從植物貓豆中提取的，中國專利cn104311440a發(fā)明公開了一種從貓豆中提取左旋多巴的方法，通過原料處理、高壓提取、雙水相萃取、脫鹽、靜置，析晶，干燥幾個步驟得到左旋多巴。植物提取由于受到原料來源的限制，產(chǎn)量小，遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前市場的需求。左旋多巴的化學(xué)合成法較多，但合成法目前主要的困難就是合成出來的產(chǎn)品是d-型和l-型的混合物，將二者分開的過程控制難度大，同時存在生產(chǎn)成本高、污染環(huán)境嚴(yán)重等問題。微生物酶轉(zhuǎn)化法就是利用代謝途徑中的某些酶，如酪氨酸酶、酪氨酸酚裂解酶、轉(zhuǎn)移酶將不同的底物轉(zhuǎn)變成左旋多巴，可獲得大量的左旋多巴，許多國家對其進(jìn)行了大量的研究，采取了許多不同的方法。

微生物酶轉(zhuǎn)化法是一種反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境友好的左旋多巴制備方法，然而，目前利用微生物酶法制備左旋多巴實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的報道并不多見，主要是因?yàn)檗D(zhuǎn)化液提純方法產(chǎn)生的廢水較難處理。中國專利cn106117071a和cn106117072a公布了兩種轉(zhuǎn)化液中提純左旋多巴的方法，但是這兩個辦法均沒有給出提純廢水的處理方法，而這兩個提取工藝的母液廢水或離心廢水均是含有鄰苯二酚，后續(xù)處理成本較高。含酚廢水危害身體健康，并造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，同時廢水中左旋多巴也得不到回收。因此，目前廢水中含有高濃度鄰苯二酚限制了左旋多巴微生物酶轉(zhuǎn)化法的工業(yè)化進(jìn)程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種從轉(zhuǎn)化液中提取左旋多巴的方法，包括以下步驟：

a.利用酪氨酸酚裂解酶生物轉(zhuǎn)化，反應(yīng)結(jié)束后，加入抗氧化劑；

b.向轉(zhuǎn)化液中流加無機(jī)酸，至將反應(yīng)液中析出的左旋多巴顆粒完全溶解；

c.高速離心機(jī)離心收集清液；

d.加入活性炭攪拌脫色，過濾收集清液；

e.使用吸附樹脂將所述清液上樣吸附，稀酸溶液洗脫后，再用有機(jī)溶劑洗脫，獲得左旋多巴洗脫液，再用有機(jī)溶劑洗脫，用純化水洗脫，獲得鄰苯二酚洗脫液；

f.左旋多巴精制：

所述左旋多巴洗脫液濃縮后調(diào)堿結(jié)晶，過濾收集左旋多巴晶體，真空干燥獲得左旋多巴成品；

g.鄰苯二酚回收：

所述鄰苯二酚洗脫液利用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取轉(zhuǎn)相，轉(zhuǎn)相后氯化鈉溶液洗滌，洗滌后濃縮結(jié)晶，干燥得鄰苯二酚粉末。

優(yōu)選地，在本發(fā)明從轉(zhuǎn)化液中提取左旋多巴的方法中，所述轉(zhuǎn)化液的左旋多巴的起始含量為35～60g/l，鄰苯二酚的起始含量為4～7g/l。

優(yōu)選地，在本發(fā)明從轉(zhuǎn)化液中提取左旋多巴的方法中，所述步驟a中抗氧化劑為抗壞血酸。

優(yōu)選地，在本發(fā)明從轉(zhuǎn)化液中提取左旋多巴的方法中，所述步驟b中所述無機(jī)酸選自硫酸、鹽酸、磷酸、硝酸的一種或幾種，所述無機(jī)酸調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化液的ph至0.5～2.0。

優(yōu)選地，在本發(fā)明從轉(zhuǎn)化液中提取左旋多巴的方法中，所述活性炭的型號選自zx301、zx862、zx720的一種或幾種，所述活性炭的加量為料液體積的0.5％～3％；所述活性炭攪拌脫色時間為30～90min。

優(yōu)選地，在本發(fā)明從轉(zhuǎn)化液中提取左旋多巴的方法中，所述吸附樹脂為大孔吸附樹脂，所述大孔吸附樹脂的型號選自x-5、h-103、nka-ⅱ中的一種。

優(yōu)選地，在本發(fā)明從轉(zhuǎn)化液中提取左旋多巴的方法中，所述步驟e稀酸溶液選自稀硫酸、稀鹽酸、稀硝酸的一種或幾種，所述稀酸溶液的濃度為1～10mol/l，所述有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇。

優(yōu)選地，在本發(fā)明從轉(zhuǎn)化液中提取左旋多巴的方法中，所述步驟f調(diào)堿結(jié)晶溫度控制在30～50℃之間，ph調(diào)至3.0～4.5；調(diào)堿所用的堿液選自氨水溶液、氫氧化鉀溶液、氫氧化鈉溶液。

優(yōu)選地，在本發(fā)明從轉(zhuǎn)化液中提取左旋多巴的方法中，所述步驟g鄰苯二酚萃取的有機(jī)溶劑選自甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯的一種或幾種。

本發(fā)明的另一方面為提供了上述方法獲得左旋多巴、鄰苯二酚與左旋多巴轉(zhuǎn)化液廢液，使用上述方法獲得的獲得左旋多巴成品，左旋多巴產(chǎn)品含量≧99％，純度≧99.6％，產(chǎn)品總雜≦0.05％,左旋多巴收率82～87％；鄰苯二酚含量≧90％，回收率91～95％。

本發(fā)明摒棄了先提取左旋多巴，再處理含鄰苯二酚廢水的現(xiàn)有工藝，發(fā)明了一種在提取左旋多巴的同時回收鄰苯二酚的提取工藝，減輕后續(xù)廢水處理壓力。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、采用大孔吸附樹脂法來提取左旋多巴，在提純左旋多巴的同時回收未消耗的鄰苯二酚，使后續(xù)廢水處理變得簡單，大大降低了提取的成本，降低后續(xù)污水處理費(fèi)用。

2、利用這種方法制備的左旋多巴產(chǎn)品質(zhì)量好，其中左旋多巴產(chǎn)品含量≧99％，純度≧99.6％，產(chǎn)品總雜≦0.05％，符合中國藥典中關(guān)于左旋多巴的質(zhì)量要求。

3、回收得到的鄰苯二酚可重復(fù)利用于酪氨酸酚裂解酶生物轉(zhuǎn)化制備左旋多巴工藝。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例中酪氨酸酚裂解酶生物轉(zhuǎn)化方法獲得左旋多巴轉(zhuǎn)化液是現(xiàn)有技術(shù)，可所使用的常見大腸桿菌基因工程菌，如使用基因工程對酪氨酸酚裂解酶進(jìn)行過優(yōu)化的大腸桿菌基因工程菌；例如使用大腸桿菌基因工程菌為e.colim15，為一種常見的酪氨酸酚裂解酶優(yōu)化大腸桿菌基因工程菌，可購自香港標(biāo)新特有限公司。

本發(fā)明的實(shí)施例提供了一種從轉(zhuǎn)化液中提取左旋多巴的具體方法，包括以下步驟：

a.利用酪氨酸酚裂解酶生物轉(zhuǎn)化，反應(yīng)結(jié)束后，加入抗氧化劑；

b.向轉(zhuǎn)化液中流加無機(jī)酸，至將反應(yīng)液中析出的左旋多巴顆粒完全溶解；

c.高速離心機(jī)離心收集清液；

d.加入活性炭攪拌脫色，過濾收集清液；

e.使用吸附樹脂將所述清液上樣吸附，稀酸溶液洗脫后，再用有機(jī)溶劑洗脫，獲得左旋多巴洗脫液，再用有機(jī)溶劑洗脫，用純化水洗脫，獲得鄰苯二酚洗脫液；

f.左旋多巴精制：

所述左旋多巴洗脫液濃縮后調(diào)堿結(jié)晶，過濾收集左旋多巴晶體，真空干燥獲得左旋多巴成品；

g.鄰苯二酚回收：

所述鄰苯二酚洗脫液利用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取轉(zhuǎn)相，轉(zhuǎn)相后氯化鈉溶液洗滌，洗滌后濃縮結(jié)晶，干燥得鄰苯二酚粉末。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)化液的左旋多巴的起始含量為35～60g/l，鄰苯二酚的起始含量為4～7g/l。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述步驟a中抗氧化劑為抗壞血酸。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述步驟b中所述無機(jī)酸選自硫酸、鹽酸、磷酸、硝酸的一種或幾種，更優(yōu)選地，所述無機(jī)酸調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化液的ph至0.5～2.0。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述活性炭的型號選自zx301、zx862、zx720的一種或幾種，所述活性炭的加量為料液體積的0.5％～3％；所述活性炭攪拌脫色時間為30～90min。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述吸附樹脂為大孔吸附樹脂，所述大孔吸附樹脂的型號選自x-5、h-103、nka-ⅱ中的一種。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述步驟e稀酸溶液選自稀硫酸、稀鹽酸、稀硝酸的一種或幾種，所述稀酸溶液的濃度為1～10mol/l，所述有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述步驟f調(diào)堿結(jié)晶溫度控制在30～50℃之間，ph調(diào)至3.0～4.5；調(diào)堿所用的堿液選自氨水溶液、氫氧化鉀溶液、氫氧化鈉溶液。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述步驟g鄰苯二酚萃取的有機(jī)溶劑選自甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯的一種或幾種。

本發(fā)明的另一方面為提供了上述方法獲得左旋多巴、鄰苯二酚與左旋多巴轉(zhuǎn)化液廢液，使用上述方法獲得的獲得左旋多巴成品，左旋多巴產(chǎn)品含量≧99％，純度≧99.6％，產(chǎn)品總雜≦0.05％,左旋多巴收率82～87％；鄰苯二酚含量≧90％，回收率91～95％。

下面將結(jié)合本發(fā)明中的實(shí)施例，對本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1左旋多巴轉(zhuǎn)化液的提取工藝

a.大腸桿菌基因工程菌為e.colim15，購自香港標(biāo)新特有限公司，轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，獲得轉(zhuǎn)化液體積500l，左旋多巴的含量為48g/l，鄰苯二酚的含量為4g/l，向轉(zhuǎn)化液中加入1kg抗壞血酸，防止后續(xù)處理過程中左旋多巴和鄰苯二酚被氧化；

b.向轉(zhuǎn)化液中流加鹽酸，調(diào)ph至1.0，攪拌至反應(yīng)析出的左旋多巴顆粒完全溶解后繼續(xù)攪拌30min；

c.攪拌結(jié)束后，高速離心機(jī)離心轉(zhuǎn)化液，控制轉(zhuǎn)速為4000rpm，溫度20℃，時間30min，離心去除不溶解的菌體碎片、蛋白質(zhì)等一些不溶雜質(zhì)，離心后留清液，棄沉淀；

d.上清液550l，加入5.5kg活性炭脫色,型號為zx301，攪拌60min，過濾取清液；

e.準(zhǔn)備適量h-103型大孔吸附樹脂，裝柱，柱體積100l，2倍柱體積4％氫氧化鈉溶液沖柱，純化水洗至中性后，再用3倍柱體積5％鹽酸溶液沖柱，再次用純化水洗至中性，處理完備用。550l清液上樣吸附，控制流速10l/min。

吸附完成后，先用300l、10mol/l的稀鹽酸溶液洗脫，前100l洗脫液作為廢液，再用200l甲醇洗脫，控制洗脫流速5l/min，獲得左旋多巴洗脫液400l，之后再用300l甲醇洗脫，最后用100l純化水洗脫，同樣控制洗脫流速5l/min，獲得鄰苯二酚洗脫液400l。

f.左旋多巴精制：

左旋多巴洗脫液濃縮后用10％氨水調(diào)ph至4.0，結(jié)晶，控制溫度40℃，緩慢攪拌1小時待大量晶體生成后，降溫至4℃，靜置4h后過濾收集左旋多巴晶體，真空干燥，獲得左旋多巴成品20.2kg，左旋多巴產(chǎn)品含量99.3％，純度99.8％，產(chǎn)品總雜0.02％，左旋多巴收率84.2％；

g.鄰苯二酚回收：

鄰苯二酚洗脫液利用100l乙酸丁酯進(jìn)行萃取轉(zhuǎn)相，轉(zhuǎn)相后用50l、0.5％氯化鈉溶液洗滌，洗滌后濃縮結(jié)晶，真空干燥得鄰苯二酚粉末1.85kg，鄰苯二酚含量91％，回收率92.5％。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。