本發(fā)明屬于食品、保健品領(lǐng)域，具體涉及一種利用大型真菌發(fā)酵法生產(chǎn)富含巖藻糖的真菌多糖的方法。

背景技術(shù)：

真菌多糖是大型食用和藥用真菌類中最有效的成分之一，其藥理作用特別受到科技工作者的重視，有關(guān)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)也最多。如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，靈芝多糖能顯著調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，提高機(jī)體耐缺氧能力，消除自由基，抑制腫瘤、抗輻射、降血糖、保護(hù)肝臟等作用。

chunxiao等(2012)研究了大型真菌中靈芝多糖對(duì)2型糖尿病模型小鼠血糖的影響，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖能劑量依賴性地降低實(shí)驗(yàn)鼠空腹血糖，其機(jī)制是降低了實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟糖質(zhì)新生和肝糖降解的關(guān)鍵酶：肝糖磷酸化酶(gp)、葡萄糖-1,6-二磷酸酶(fbpase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepck)、葡萄糖-6-磷酸酶(g6pase)的mrna水平。

chi-hueywong等(2009)試驗(yàn)證實(shí)靈芝多糖與乙酸配合使用，可以增加模式生物秀麗隱桿線蟲壽命相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子daf-16的表達(dá)，蛋白組學(xué)對(duì)照分析，實(shí)驗(yàn)組中15種增壽蛋白有差異性表達(dá)。

目前，大型真菌中的靈芝多糖、鮮菇多糖、灰樹花多糖等的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性研究較多。最著名的是chi-hueywong等2013年發(fā)表在美國科學(xué)院院報(bào)的一篇關(guān)于靈芝多糖的研究報(bào)告，研究發(fā)現(xiàn)：試驗(yàn)小鼠通過腹腔注射靈芝多糖可以有效抑制肉瘤s-180和lewis肺癌增殖，證明靈芝多糖具有抗腫瘤活性。進(jìn)一步系統(tǒng)研究了靈芝多糖的抗腫瘤免疫機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過對(duì)靈芝多糖免疫的小鼠的脾淋巴細(xì)胞的免疫活性物質(zhì)表達(dá)譜分析，證實(shí)靈芝多糖免疫可以增加小鼠脾淋巴細(xì)胞的il-1,il-6,il-12,ifn-c,tnf-a,gm-csf,g-csf和m-csf表達(dá)。作用機(jī)制是靈芝多糖首先與巨噬細(xì)胞的tlr4受體結(jié)合，tlr4-靈芝多糖復(fù)合物進(jìn)一步激活胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(erk)、c-junn-末端激酶(jnk)和p38，誘導(dǎo)il-1的表達(dá)。靈芝多糖還可以強(qiáng)烈引起腹腔b1b細(xì)胞增殖，這暗示抗血清中抗糖抗體igm的增加。聚糖微陣列分析顯示，靈芝多糖免疫產(chǎn)生的igm可特異性識(shí)別腫瘤相關(guān)糖抗原的非還原端所含有的fucα1-2gal,fucα1-3/4man,fucα1-4xyl和fucα1-2fuc等特殊結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)典型存在于腫瘤相關(guān)抗原globoh中。推斷靈芝多糖抗腫瘤的分子基礎(chǔ)在于其特殊的糖組成及其形成的特殊的糖苷鍵，其中重要的單糖是巖藻糖，巖藻糖苷酶酶解后的靈芝多糖重復(fù)上述的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)靈芝多糖中巖藻糖的重要性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一種大型真菌發(fā)酵法生產(chǎn)富含巖藻糖的真菌多糖的方法：是經(jīng)過菌種選擇，利用液體發(fā)酵，在基本培養(yǎng)基中添加巖藻多糖，經(jīng)大型真菌代謝后，產(chǎn)生富含巖藻糖的真菌多糖產(chǎn)品。

與對(duì)照相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：本發(fā)明通過在大型真菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加來自于褐藻和棘皮動(dòng)物的巖藻多糖，能極大地提高了大型真菌發(fā)酵產(chǎn)物中真菌多糖(有多種單糖通過糖苷鍵鏈接而成)中巖藻糖的含量，有研究顯示真菌多糖中重要的單糖-巖藻糖對(duì)與真菌多糖的抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性十分重要。因此本發(fā)明生產(chǎn)的富含巖藻糖的真菌多糖制品將為腫瘤治療提供有益的輔助，提高人體的免疫能力，為人類健康提供有益的幫助，具有重大的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1液體發(fā)酵靈芝多糖中的單糖組成離子色譜分析；

圖中包括標(biāo)準(zhǔn)單糖，fucose(巖藻糖)，arabinose(阿拉伯糖)，galactose(半乳糖)，glucose(葡萄糖)，xylose(木糖)，mannose(甘露糖)的離子色譜分析；該標(biāo)準(zhǔn)單糖離子色譜圖：1.巖藻糖，2.阿拉伯糖，3.半乳糖，4.葡萄糖，5.木糖和甘露糖。

圖2液體發(fā)酵靈芝多糖中的單糖組成離子色譜分析；

圖中曲線1為發(fā)酵基本培養(yǎng)基中添加5g/l甘露糖，曲線2為發(fā)酵基本培養(yǎng)基；

圖3液體發(fā)酵靈芝多糖中的單糖組成離子色譜分析；

圖中曲線1為發(fā)酵基本培養(yǎng)基，曲線2為發(fā)酵基本培養(yǎng)基中添加5g/l巖藻糖；

圖4液體發(fā)酵靈芝多糖中的單糖組成離子色譜分析；

圖中曲線1為發(fā)酵基本培養(yǎng)基，曲線2-6為發(fā)酵基本培養(yǎng)基中添加巖藻多糖分別為0.5g/l，1.0g/l，1.5g/l，3.0g/l，4.0g/l。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

本發(fā)明的一種大型真菌發(fā)酵法生產(chǎn)富含巖藻糖的真菌多糖的方法，步驟是：

1)選擇大型真菌中的一種(如靈芝，蟲草，香菇，或灰樹花等)靈芝作為發(fā)酵用菌種；

2)采用液體發(fā)酵，基本培養(yǎng)基中添加巖藻多糖，在一定的發(fā)酵條件下發(fā)酵一定時(shí)間；

所述基本培養(yǎng)基為pda改良培養(yǎng)基(基本配方為土豆泥30.0-40.0g/l，麩皮汁30.0-40.0g/l，葡萄糖5.0-15.0g/l，磷酸二氫鉀1-2g/l，mgso4·7h2o0.5-1g/l，ph自然)。本發(fā)明對(duì)pda培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，可以降低成本，節(jié)約資源。

所述巖藻多糖優(yōu)選為來自于褐藻的巖藻多糖，添加濃度為巖藻多糖干粉0.5–4.0g/l(巖藻多糖干粉中巖藻多糖含量≥60％)。

實(shí)施例1

添加褐藻提取的巖藻多糖干粉，利用泰山赤靈芝發(fā)酵，生產(chǎn)富含巖藻糖的靈芝多糖方法：

1)用pda斜面保存泰山赤靈芝菌種，培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基，加1.5％的瓊脂粉，121℃滅菌30分鐘，制成試管斜面，接種泰山赤靈芝，30℃培養(yǎng)4-5天制成斜面種子；

2)制備液體搖瓶泰山赤靈芝種子液：培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基，121℃滅菌30分鐘；冷卻后，用上述培養(yǎng)好的試管斜面種子接種；30℃，搖床180rpm，培養(yǎng)4天，得到培養(yǎng)好的泰山赤靈芝搖瓶種子；

3)一級(jí)發(fā)酵罐發(fā)酵：將制備好的搖瓶泰山赤靈芝液體種子按10％(v/v)的量接種到經(jīng)過121℃滅菌30分鐘，然后冷卻至30℃的一級(jí)發(fā)酵罐中，進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵，定時(shí)取樣分析，確定終點(diǎn)，作為種子待轉(zhuǎn)到二級(jí)發(fā)酵罐。

上述一級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是改良的pda培養(yǎng)基(單位g/l)：土豆泥40，40g麩皮煮沸30分鐘過濾取汁，葡萄糖10.0，kh2po41.5，mgso4·7h2o0.75。

4)二級(jí)發(fā)酵罐發(fā)酵：將一級(jí)發(fā)酵好的菌種按10％(v/v)的量轉(zhuǎn)到經(jīng)過121℃滅菌30分鐘，然后冷卻至30℃的二級(jí)發(fā)酵罐中，通氣攪拌發(fā)酵，定時(shí)取樣分析，確定發(fā)酵終點(diǎn)作為種子待轉(zhuǎn)到三級(jí)發(fā)酵罐。

上述二級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是改良的pda培養(yǎng)基(同上)。

5)三級(jí)發(fā)酵罐發(fā)酵：將二級(jí)發(fā)酵好的菌種按10％(v/v)的量轉(zhuǎn)到經(jīng)過121℃滅菌30分鐘，然后冷卻至30℃的三級(jí)發(fā)酵罐中，通氣攪拌發(fā)酵，定時(shí)取樣分析，發(fā)酵終點(diǎn)。

上述三級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是改良的pda培養(yǎng)基(同上)，添加巖藻多糖0.5g/l。

實(shí)施例2

制備方法如實(shí)施例1，區(qū)別在于所述三級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)基中添加1.0g/l巖藻多糖。

實(shí)施例3

制備方法如實(shí)施例1，區(qū)別在于所述三級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)基中添加1.5g/l巖藻多糖。

實(shí)施例4

制備方法如實(shí)施例1，區(qū)別在于所述三級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)基中添加3.0g/l巖藻多糖。

實(shí)施例5

制備方法如實(shí)施例1，區(qū)別在于所述三級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)基中添加4.0g/l巖藻多糖。

對(duì)比例1

制備方法如實(shí)施例1，區(qū)別在于所述三級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)基中添加5g/l甘露糖。

對(duì)比例2

制備方法如實(shí)施例1，區(qū)別在于所述三級(jí)發(fā)酵罐培養(yǎng)基中添加5g/l巖藻糖。

將上述實(shí)施例與對(duì)比例中，分離純化的靈芝多糖的單糖組成進(jìn)行離子色譜分析。如表1和圖1-4所示的，表中的數(shù)值為峰面積。

表1基本培養(yǎng)基中不同底物添加發(fā)酵靈芝中靈芝多糖的巖藻糖、葡萄糖及其比值的變化

上述實(shí)施例中涉及的分析方法匯總?cè)缦拢?/p>

1.菌絲形態(tài)和菌絲球密度用鏡檢分析，染色用革蘭氏染色法，用常規(guī)光學(xué)顯微鏡油鏡觀察，最大倍數(shù)1500倍。

2.ph用ph計(jì)測(cè)定。

3.多糖分析實(shí)驗(yàn)采用兩次dns法，第一次dns法分析發(fā)酵液中殘留還原糖，然后發(fā)酵液用3n鹽酸，100℃水解30分鐘，中和后，第二次dns法分析水解后的發(fā)酵液中還原糖，兩次分析差值為靈芝多糖含量。

本發(fā)明中涉及的菌種購自天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司。

根據(jù)巖藻糖的體內(nèi)合成途徑：分為補(bǔ)救途徑和從頭合成途徑，本發(fā)明在靈芝多糖的液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的巖藻糖單糖，甘露糖單糖以及來自于海洋褐藻的富含巖藻糖的多糖(即巖藻多糖)，來研究能否增加靈芝多糖中的巖藻糖含量，尋找能使靈芝多糖中巖藻糖含量達(dá)到最高的最佳添加物及濃度，以獲得富含巖藻糖的靈芝多糖。結(jié)果顯示(圖1-4和表1)：在基本培養(yǎng)液中添加來自于褐藻的巖藻多糖，添加濃度為巖藻多糖干粉0.5-4.0g/l，當(dāng)添加巖藻多糖干粉小于等于3.0g/l時(shí)，可以逐步地提高靈芝多糖單糖組成中的巖藻糖含量，當(dāng)基本培養(yǎng)基中添加3.0g/l巖藻多糖干粉，巖藻糖與葡萄糖比值最高達(dá)到0.594；而當(dāng)添加4.0g/l巖藻多糖干粉時(shí)，靈芝生長量減少，巖藻糖與葡萄糖比值也減少，具體原因需繼續(xù)分析。

以上實(shí)施例僅是本發(fā)明若干種優(yōu)選實(shí)施方式中的幾種，應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例；對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。