本發(fā)明涉及一種高含碘量的生物可降解聚合物材料，具體涉及一種四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐的合成，以及由其聚合得到的聚四碘甲腺原氨酸在構(gòu)建納米藥物載體和造影劑中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

x-光計算機(jī)斷層掃描（ct）成像技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床診斷應(yīng)用，通過組織的x-射線衰減原理提供高電子密度材料的高清圖片。ct可用性強(qiáng)、成本低、造影效率高等優(yōu)勢，同時它可以聯(lián)合新型成像系統(tǒng)（spect、pet）來提供高分辨率的3d組織學(xué)詳圖。ct瞬時分辨率高，可以快速獲取心血管疾病圖片。含碘小分子如碘海醇、碘克沙醇等造影劑具有低毒、價格低廉、高效造影等優(yōu)點，是當(dāng)前臨床上最為常用的ct造影劑。但小分子造影劑通常會被腎臟快速清除，從而導(dǎo)致診斷部位的時間窗狹窄、ct圖片對比度不足、信息丟失較快等問題，這極大增加了疾病精確診斷的難度。如增加含碘小分子造影劑的濃度又會導(dǎo)致粘度增大、滲透壓增強(qiáng)和嚴(yán)重碘過敏反應(yīng)，這可能會危害病人的健康和生命。因此，開發(fā)新型的高造影效率、長循環(huán)時間、無毒和選擇性高的含碘造影劑對心血管和腫瘤等疾病的ct成像診斷具有重要的意義。

近些年來，研究者們設(shè)計制備了多種含碘的脂質(zhì)體、膠束、乳化劑等來用作ct造影劑。其中fenstra和exitronp由于具有低毒和較長的循環(huán)時間，已經(jīng)被商業(yè)化批準(zhǔn)用于小動物微ct造影。但是fenstra在成像時需要注射較高的量，除此之外這些造影劑依然存在以下諸多問題：如乳化造影劑里額外添加表面活性劑會帶來正常細(xì)胞的溶血；碘化膠束、脂質(zhì)體等含碘量一般都低于臨床小分子造影劑，造影效果受限。因此，研發(fā)具有優(yōu)異的生物相容性、生物可降解性、杰出的穩(wěn)定性、高碘含量、靈活修飾性、易放大生產(chǎn)的碘化納米造影劑是目前階段的首要任務(wù)，也是向臨床推進(jìn)的必要條件。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐及其制備方法，并用四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐通過開環(huán)聚合制備側(cè)鏈含碘的聚合物，并用這些聚合物自組裝形成納米粒子來構(gòu)建新型納米造影劑和納米藥物載體。該納米造影劑具有造影效率高、循環(huán)時間長、安全高效的優(yōu)點，能實現(xiàn)對心血管疾病和腫瘤等疾病的有效診斷。同時，基于聚四碘甲腺原氨酸的納米藥物載體穩(wěn)定性高，載藥效率極佳，且能靶向富集到腫瘤處，可有效提高藥物療效、抑制腫瘤生長。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種具有式ⅰ結(jié)構(gòu)的四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐；

式ⅰ。

上述四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐的制備方法如下：

以四碘甲腺原氨酸、三光氣為反應(yīng)物，在有機(jī)溶劑比如無水四氫呋喃中反應(yīng)，制備得到所述的四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐；所述四碘甲腺原氨酸為l型、d型或者dl型。

上述技術(shù)方案中，具體反應(yīng)過程如下：

將原料四碘甲腺原氨酸和三光氣依次加入到無水四氫呋喃中，并混合均勻。然后，在30~60℃條件下反應(yīng)1～2小時，再用石油醚沉淀得到粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品溶于乙酸乙酯，然后分別用0℃飽和nahco3溶液和0℃冰水洗滌，有機(jī)層用無水mgso4干燥過夜，過濾，濾液旋蒸濃縮，用石油醚沉淀，得淡黃色油狀產(chǎn)物，再用無水四氫呋喃和石油醚將沉淀洗滌三次，最終得到淡黃色固體，即為產(chǎn)物四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐（thy-nca）。

上述技術(shù)方案中，四碘甲腺原氨酸、三光氣的摩爾比為2∶1～2，優(yōu)選2∶1。

上述制備方法可表示如下：

本發(fā)明還公開了一種聚合物及其制備方法，所述聚合物為不含靶向分子聚合物或者含靶向分子聚合物；所述不含靶向分子聚合物由上述四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐均聚得到或者由上述四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐與其他酸酐共聚得到；所述含靶向分子聚合物由上述四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐均聚并鍵合靶向分子制備得到或者由上述四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐與其他酸酐共聚并鍵合靶向分子制備得到。

本發(fā)明由上述thy-nca單體經(jīng)開環(huán)聚合制備均聚物和聚乙二醇-聚四碘甲腺原氨酸（peg-pthy）、透明質(zhì)酸-聚四碘甲腺原氨酸（ha-pthy）、殼聚糖-聚四碘甲腺原氨酸（dex-pthy）等嵌段共聚物；或者thy-nca單體與其他酸酐（甘氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、丙氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、苯丙氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、（異）亮氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、（γ-芐基）谷氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、（β-芐基）天冬氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、（ε-芐氧羰基）賴氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、（γ-芐氧羰基）鳥氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、（nim-二硝基苯）組氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、（s-叔丁基硫代）-半胱氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、（o-叔丁基）-絲氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、胱氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、蛋氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐或者色氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐）共聚得到嵌段聚合物。本發(fā)明的聚合物在引發(fā)劑存在下制備得到，引發(fā)劑包括小分子伯胺、仲胺和叔胺，如正己胺、十六烷基胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺、二乙胺、三乙胺等，以及大分子胺如端氨基聚乙二醇、殼聚糖、透明質(zhì)酸氨基衍生物等；在聚合過程中，碘元素不影響開環(huán)聚合，無需保護(hù)和脫保護(hù)工藝。聚四碘甲腺原氨酸鏈段的分子量為5～100kda；聚合物中，含碘量為20%～65%。

本發(fā)明的引發(fā)劑聚乙二醇可以為不同分子量的甲氧基聚乙二醇氨基、甲氧基聚乙二醇硅氮烷、丙烯酸酯聚乙二醇氨基、丙烯酸酯聚乙二醇硅氮烷、烯丙基聚乙二醇氨基、烯丙基聚乙二醇硅氮烷、馬來酰亞胺聚乙二醇氨基、馬來酰亞胺聚乙二醇硅氮烷、疊氮聚乙二醇氨基、疊氮聚乙二醇硅氮烷、炔基聚乙二醇氨基、炔基聚乙二醇硅氮烷、生物素聚乙二醇氨基、生物素聚乙二醇硅氮烷。例如，以端氨基peg（peg-nh2）為引發(fā)劑，dmf作溶劑，開環(huán)聚合thy-nca單體可制備得到peg-pthy嵌段共聚物；反應(yīng)式如下：

本發(fā)明還公開了一種聚合物納米結(jié)構(gòu)及其制備方法，所述聚合物納米結(jié)構(gòu)由上述不含靶向分子聚合物和/或含靶向分子聚合物交聯(lián)得到；或者所述聚合物納米結(jié)構(gòu)由上述不含靶向分子聚合物交聯(lián)后鍵合靶向分子得到。本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)包括膠束或者囊泡；優(yōu)選聚乙二醇-聚四碘甲腺原氨酸、透明質(zhì)酸-聚四碘甲腺原氨酸、殼聚糖-聚四碘甲腺原氨酸等聚合物囊泡或者膠束。

本發(fā)明還公開了一種納米藥物及其制備方法，所述納米藥物由上述聚合物納米結(jié)構(gòu)包載藥物得到。

本發(fā)明還公開了一種納米造影劑體系，所述納米造影劑體系包括上述聚合物納米結(jié)構(gòu)以及分散介質(zhì)；將聚合物納米結(jié)構(gòu)與分散介質(zhì)（緩沖液、生理鹽水等）混合得到納米造影體系；聚合物中，含碘量為48～65%。

本發(fā)明還公開了一種納米藥物體系，其特征在于：所述納米藥物體系包括上述納米藥物以及分散介質(zhì)；將納米藥物與分散介質(zhì)（緩沖液、生理鹽水等）混合得到納米藥物體系。

本發(fā)明還公開了上述四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、聚合物或者納米結(jié)構(gòu)在制備納米造影劑或者藥物載體中的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了上述四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐、聚合物、納米結(jié)構(gòu)或者納米藥物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

比如：本發(fā)明公開了用peg-pthy、ha-pthy、dex-pthy等共聚物來制備聚合物膠束，以及這些聚合物膠束在藥物遞送中的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了用peg-pthy、ha-pthy、dex-pthy等共聚物來制備聚合物囊泡，以及這些聚合物囊泡在藥物遞送中的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了用peg-pthy、ha-pthy、dex-pthy等共聚物來制備聚合物囊泡，以及這些聚合物囊泡在ct造影劑中和疾病診療試劑中的應(yīng)用。所述生物可降解聚合物囊泡中的含碘量為48～65%。

本發(fā)明的產(chǎn)物結(jié)合腫瘤的早期診斷(尤其是影像學(xué)診斷)和治療、實現(xiàn)診療一體化在理想情況下可以在診斷出病灶后直接給藥治療，還可以直接監(jiān)控病灶的治愈情況，解決了現(xiàn)階段納米藥物載體存在體內(nèi)穩(wěn)定性不足導(dǎo)致藥物泄露、載藥效率低、細(xì)胞內(nèi)藥物內(nèi)吞量低和細(xì)胞內(nèi)釋放緩慢等諸多問題，可用于診療一體化的多功能納米藥物，其同時具備優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性、較長的循環(huán)時間、精確的靶向效果、高的成像靈敏性和可控的抗癌藥物釋放。

由本發(fā)明的氨基酸單體開環(huán)聚合得到側(cè)鏈含有碘元素的聚氨基酸聚合物，該聚合物由于其具有良好的生物相容性和含碘量高的特點，可以用于制備納米藥物載體和ct顯影劑。

由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點:

1.本發(fā)明公開的聚四碘甲腺原氨酸聚合物是用天然氨基酸制備得到，具有良好的生物相容性、降解性和安全性，在納米藥物載體和生物組織工程等方面有廣泛的應(yīng)用前景。

2.本發(fā)明公開的基于聚四碘甲腺原氨酸的納米造影劑具有較小的粘度和滲透壓，且受造影劑濃度的影響較小。這較好地克服了現(xiàn)在臨床廣泛使用的ct造影劑如碘海醇和碘克沙醇的粘度和滲透壓會隨著濃度增加而變大的缺點。而且，基于聚四碘甲腺原氨酸的納米造影劑具有明顯延長的體內(nèi)循環(huán)時間和顯著增強(qiáng)的成像效果，這十分有利于疾病的早期準(zhǔn)確診斷。

3.本發(fā)明公開的基于聚四碘甲腺原氨酸聚合物的納米造影劑的制備方法簡單、可控性高、原料天然，這克服現(xiàn)有納米造影劑普遍存在制備工藝復(fù)雜、可控性差、安全性不足等缺點，極有利于臨床的轉(zhuǎn)化。

附圖說明

圖1是實施例一中四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐（thy-nca）的氫核磁譜圖；

圖2為實施例八中peg-pthy聚合物囊泡的透動態(tài)光散射（dls）圖；

圖3為實施例八中peg-pthy聚合物囊泡的穩(wěn)定性測試圖；

圖4為實施例十四中peg-pthy聚合物納米粒子的細(xì)胞毒性結(jié)果圖；

圖5為實施例十五中載阿霉素peg-pthy聚合物囊泡的細(xì)胞毒性結(jié)果圖；

圖6為實施例十六中peg-pthy聚合物囊泡的體外滲透壓結(jié)果圖；

圖7為實施例十七中peg-pthy聚合物囊泡的體內(nèi)急毒性實驗中的血常規(guī)測試圖；

圖8為實施例十八中peg-pthy聚合物囊泡體外的x射線衰減系數(shù)和體外的ct效果圖；

圖9為實施例十九中peg-pthy聚合物囊泡作為血池造影的ct圖（主動脈）；

圖10為實施例十九中peg-pthy聚合物囊泡在小鼠體內(nèi)的ct圖（心臟和肝臟）；

圖11為實施例二十中crgd-peg-pthy聚合物囊泡用作b16黑色素瘤的ct成像圖；

圖12為實施例二十一中側(cè)鏈含碘的帶有新生血管靶向分子crgd的crgd-peg-pthy聚合物囊泡對于a549原位肺癌的ct成像圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實施例一四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐（thy-nca）的合成。

稱取四碘甲腺原氨酸（4g，5.1mmol）于干燥的三頸圓底燒瓶中，加入無水thf（100ml），將反應(yīng)體系置于50℃油浴中后加入固體三光氣（0.8g,2.6mmol），反應(yīng)1小時后將反應(yīng)提出油浴通氮氣半小時,用石油醚沉淀得到thy-nca粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品溶于乙酸乙酯后，分別用0℃飽和nahco3溶液和0℃冰水各洗滌三次，再用無水mgso4干燥過夜，過濾。所得濾液旋蒸濃縮，用石油醚沉淀，得淡黃色固體，最后用無水乙酸乙酯和石油醚洗滌三次，得到淡黃色固體thy-nca（3.3g，產(chǎn)率80%）。

thy-nca核磁表征見附圖1，¹hnmr(dmso-d6,400mhz,δ):9.27(s,1h,-oh),9.15(s,1h,-conh),7.83(s,2h,-c6h2i2oh),7.10(s,2h,-c6h2i2-),4.79(t,1h,-chnh),2.98-3.08(d,2h,-c6h2i2ch2ch-);¹³cnmr(300mhz,dmso-d6,δ):170.99,152.26,152.15,151.37,150.57,141.41,137.68,125.48,92.41,88.20,58.35,35.15；thy-nca的元素分析為c,24.46;h,1.32;n,1.96（理論：c,23.91;h,1.12;n,1.74）。質(zhì)譜：802.6（理論分子量：802.6）。

實施例二聚乙二醇-聚四碘甲腺原氨酸（peg3k-pthy10k）兩嵌段聚合物的合成

兩嵌段聚合物peg3k-pthy10k是用大分子引發(fā)劑peg3k-nh2引發(fā)thy-nca開環(huán)聚合制備。在氮氣條件下，將thy-nca(1.1g,1.32mmol)溶解在dmf(5ml)中，將peg-nh2(0.3g,0.1mmol)溶解在n,n二甲基甲酰胺（dmf，(6ml）中，然后將peg-nh2/dmf溶液快速加到thy-nca/dmf溶液中，密閉條件下于40℃反應(yīng)72h。反應(yīng)完后用過量無水乙醚沉淀，砂芯過濾，沉淀再用氯仿溶解，再次用過量無水乙醚沉淀，砂芯過濾，室溫下真空干燥24h。產(chǎn)率:90%。通過改變引發(fā)劑和單體投料比，可方便制備得到不同分子量和組成的peg-pthy聚合物（表1）。

實施例三聚乙二醇-聚（四碘甲腺原氨酸-co-亮氨酸）（peg5k-p(thy10k-co-leu1k)）嵌段共聚合物的合成

嵌段共聚物peg5k-p（thy10k-co-leu1k）是用大分子引發(fā)劑peg5k-nh2引發(fā)thy-nca和leu-nca開環(huán)聚合制備。在氮氣條件下，將thy-nca(1.1g,1.32mmol)溶解在dmf(4ml)中，leu-nca(0.14g,0.88mmol)溶解在dmf(4ml)，將peg-nh2(0.5g,0.1mmol)溶解在dmf(4ml)中，然后將thy-nca/dmf和leu-nca/dmf溶液快速加到peg-nh2/dmf溶液中，密閉條件下于40℃反應(yīng)72h。反應(yīng)完后用過量無水乙醚沉淀，砂芯過濾，沉淀再用氯仿溶解，再次用過量無水乙醚沉淀，砂芯過濾，室溫下真空干燥24h。產(chǎn)率:91.2%。通過改變引發(fā)劑和單體投料比，可方便制備得到不同分子量和組成的peg-p(thy-co-leu)聚合物（表1）。

實施例四馬來酰亞胺官能化的mal-peg6k-pthy10k嵌段共聚合物的合成

mal-peg6k-pthy10k嵌段共聚物是用大分子引發(fā)劑mal-peg-nh2引發(fā)thy-nca開環(huán)聚合制備。在氮氣條件下，將thy-nca(1.1g,1.32mmol)溶解在dmf(6ml)中，將mal-peg-nh2(0.6g,0.1mmol)溶解在dmf(5ml)中，然后將thy-nca/dmf溶液快速加到mal-peg-nh2/dmf溶液中，密閉條件下于40℃反應(yīng)72h。反應(yīng)完后用過量無水乙醚沉淀，砂芯過濾，沉淀再用氯仿溶解，再次用過量無水乙醚沉淀，砂芯過濾，室溫下真空干燥24h。產(chǎn)率:89.9%。采用上述類似的制備方法可以制備mal-peg-p(thy-co-leu)共聚物。

表1.聚乙二醇-聚四碘甲腺原氨酸共聚物的制備。

實施例五crgd短肽修飾的peg6k-pthy10k聚合物（crgd-peg6k-pthy10k）的合成

在氮氣環(huán)境下將mal-peg-thy和crgd-sh分別溶解在dmf中，然后在氮氣氛圍下快速將crgd-sh加到mal-peg-pthy的dmf溶液中，反應(yīng)進(jìn)行24h。反應(yīng)完后，反應(yīng)物依次用dmf和一次水透析，凍干得到白色粉末。產(chǎn)率：80%。

實施例六ha8k-g-pthy10k接枝共聚物的合成

兩嵌段聚合物ha8k-b/g-pthy10k是用大分子引發(fā)劑ha-nh2引發(fā)thy-nca開環(huán)聚合制備。在氮氣條件下，將thy-nca(1.1g,1.32mmol)溶解在dmf(6ml)中，將ha-nh2(0.8g,0.1mmol)溶解在dmf(5ml)中，然后將ha-nh2的dmf溶液快速加到thy-nca/dmf溶液中，密閉條件下于40℃反應(yīng)72h。反應(yīng)完后用過量無水乙醚沉淀，砂芯過濾，沉淀再用氯仿溶解，再次用過量無水乙醚沉淀，砂芯過濾，室溫下真空干燥24h。產(chǎn)率:89.3%.

實施例七dex8k-pthy6k接枝共聚物的合成

兩嵌段聚合物dex8k-pthy6k使用大分子引發(fā)劑dex8k-nh2引發(fā)thy-nca開環(huán)聚合制備。在氮氣條件下，將thy-nca(0.63g,0.79mmol)溶解在dmf(3ml)中，將dex-nh2(0.8g,0.1mmol)溶解在dmf(3ml)中，然后將dex-nh2/dmf溶液快速加到thy-nca/dmf溶液中，密閉條件下于40℃反應(yīng)72h。反應(yīng)完后用過量無水乙醚沉淀，砂芯過濾，沉淀再用氯仿溶解，再次用過量無水乙醚沉淀，砂芯過濾，室溫下真空干燥24h。產(chǎn)率:84.3%.）

實施例八peg-pthy聚氨基酸囊泡的制備

peg-pthy聚氨基酸囊泡（ps）通過透析方法制備。具體過程是：將5mg聚合物peg3k-pthy10k(分子量為12.9kg/mol)溶在1mldmf中，在25℃攪拌條件下，向其中滴加4.0ml磷酸鹽緩沖溶液（10mm,ph7.4）。得到的溶液攪拌1h后，裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的透析袋中（spectra/por,mwco:7000），用磷酸鹽緩沖溶液（10mm,ph7.4）透析24h。附圖2為上述peg-pthy聚氨基酸自組裝形成囊泡的動態(tài)光散射（dls）圖，可以看出由四碘甲腺原氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐與聚乙二醇聚合形成的兩親性聚合物形成的納米粒子粒徑約為60納米。同時，用dls研究了peg-pthy聚氨基酸囊泡的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其在100倍稀釋條件下和10%血清中粒徑變化不大，說明具有很好的穩(wěn)定性（圖3）。

實施例九crgd修飾的peg-pthy聚合物囊泡（crgd-ps）的制備

分別將crgd-peg6k-pthy10k和peg5k-pthy10k聚合物溶解在dmf中（5mg/ml），然后取800μlpeg-pthy聚合物溶液和200μlcrgd-peg-pthy聚合物溶液混合均勻后，向其中逐滴加入4ml磷酸鹽緩沖溶液（pb，ph7.4,10mm），在pb（ph7.4,10mm）中透析（mwco7000）8小時，得到crgd-ps聚合物囊泡。動態(tài)激光光散射（dls）測試結(jié)果顯示crgd-ps的水合直徑60nm，同時具有很小的粒徑分布0.13。另外，還按照上述方法先用peg-pthy和mal-peg-pthy制得表面含有mal功能基團(tuán)的聚合物囊泡，然后再通過邁克爾加成反應(yīng)將含巰基的crgd鍵合到聚合物囊泡表面，制備得到crgd-ps。

實施例十peg-pthy聚氨基酸膠束的制備

peg-pthy聚氨基酸膠束通過透析方法制備。具體過程是：將5mg聚合物peg3k-pthy2k(分子量為5.0kg/mol)溶在1mln,n二甲基甲酰胺中，在25℃攪拌條件下，向其中滴加40ml磷酸鹽緩沖溶液（10mm,ph7.4）。得到的溶液攪拌1h后，裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的透析袋中（spectra/por,mwco:7000），用磷酸鹽緩沖溶液（10mm,ph7.4）透析24h。發(fā)現(xiàn)聚氨基酸膠束粒徑約為50納米，pdi小于0.2。靶向膠束的制備工藝參考實施例九。

實施例十一dex-pthy聚氨基酸膠束的制備

dex-pthy聚氨基酸膠束通過透析方法制備。具體過程是：將5mg聚合物dex8k-pthy6k(分子量為14.0kg/mol)溶在1mln,n二甲基甲酰胺中，在25℃攪拌條件下，向其中滴加40ml磷酸鹽緩沖溶液（10mm,ph7.4）。得到的溶液攪拌1h后，裝入預(yù)先準(zhǔn)備好的透析袋中（spectra/por,mwco:7000），用磷酸鹽緩沖溶液（10mm,ph7.4）透析24h。發(fā)現(xiàn)聚氨基酸粒徑約為45納米，pdi小于0.2。

實施例十二peg-pthy聚氨基酸囊泡對抗癌藥物阿霉素的包裹

采用溶劑交換法制備peg-pthy聚氨基酸囊泡。4ml磷酸緩沖溶液（10mm，ph7.4）逐滴加入到1mlpeg3k-b-pthy10k的n，n-二甲基甲酰胺溶液（5mg/ml）和100μl阿霉素（dox，10%，5mg/ml）的二甲亞砜溶液的混合液中，超聲1小時后裝入透析袋（spectra/pore^?，mwco3500）中，在pb（10mm，ph7.4）中透析12小時，然后冷凍干燥制得包載阿霉素的peg-pthy聚氨基酸囊泡納米藥物。

為計算peg-pthy聚氨基酸囊泡對阿霉素的載藥量和載藥效率，先將納米藥物溶解于n，n-二甲基甲酰胺溶液中，再利用熒光分光光譜儀測定阿霉素的量。阿霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過配制一系列不同濃度的阿霉素溶液，然后測得其熒光值來得到。載藥量（dlc）和包封率（dle）根據(jù)以下公式計算：

載藥量（wt.%）=（藥物重量/（聚合物重量+藥物重量））×100%

包封率（%）=（裝載藥物重量/藥物總投入量）×100%

從熒光測得結(jié)果可算出，peg-pthy聚氨基酸囊泡載阿霉素理論載藥量為10%時，載藥效率為60%，載藥量為6%，具體聚氨基酸囊泡的載藥量以及包載效率見表2。由以上結(jié)果可知，peg-pthy聚氨基酸囊泡對抗癌藥物阿霉素有很高的包裹效率。

表2聚氨基酸囊泡包載抗癌藥物阿霉素（dox）的表征

實施例十三dex8k-pthy6k聚氨基酸膠束對抗癌藥物阿霉素的包裹

采用溶劑交換法制備dex8k-pthy6k聚氨基酸膠束。4ml磷酸緩沖溶液（10mm，ph7.4）逐滴加入到1mldex8k-pthy6k的n，n-二甲基甲酰胺溶液（5mg/ml）和100μl阿霉素（10%，5mg/ml）的二甲亞砜溶液的混合液中，超聲1小時后裝入透析袋（spectra/pore^?，mwco3500）中，在pb（10mm，ph7.4）中透析12小時，然后冷凍干燥制得包載阿霉素的dex-pthy聚氨基酸膠束納米藥物。

為計算dex-pthy聚氨基酸膠束對阿霉素的載藥量和載藥效率，先將納米藥物溶解于n，n-二甲基甲酰胺溶液中，再利用熒光分光光譜儀測定阿霉素的量。阿霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過配制一系列不同濃度的阿霉素溶液，然后測得其熒光值來得到。載藥量（dlc）和包封率（dle）根據(jù)以下公式計算：

載藥量（wt.%）=（藥物重量/（聚合物重量+藥物重量））×100%

包封率（%）=（裝載藥物重量/藥物總投入量）×100%

從熒光測得結(jié)果可算出，dex-pthy聚氨基酸膠束載阿霉素理論載藥量為10%時，載藥效率為50%，載藥量為5%，由以上結(jié)果可知，dex-pthy聚氨基酸膠束對抗癌藥物阿霉素有較高的包裹效率。

實施例十四peg-pthy兩嵌段聚合物囊泡的細(xì)胞毒性測試

采用mtt法對peg-pthy聚氨基酸囊泡的細(xì)胞毒性進(jìn)行測試。使用到的細(xì)胞為u87細(xì)胞（人腦膠質(zhì)瘤）和l929細(xì)胞（小鼠成纖維細(xì)胞）。在37℃，5%二氧化碳條件下，在含有10%血清的dulbecco’smodifiedeagle培養(yǎng)基（dmem）中培養(yǎng)，細(xì)胞密度為1×10⁴個/孔。24小時后，培養(yǎng)基用90μl含有10%血清的dmem和10μl不同濃度的peg-pthy納米粒子溶液（濃度分別為0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml）替換，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時；接著培養(yǎng)基用100μl新鮮的dmem替換，并加入10μlmtt溶液（5mg/ml）。繼續(xù)培養(yǎng)4小時，加入100μldmso溶解生成的結(jié)晶子。樣品的光學(xué)密度用biotek微盤測量儀在570nm處測定。細(xì)胞單獨在10%血清的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)的結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，記為100%存活。附圖4為u87細(xì)胞（人腦膠質(zhì)瘤）和l929（小鼠成纖維細(xì)胞）存活率圖；從圖4可以看出，即使當(dāng)聚合物納米粒子濃度達(dá)到2mg/ml時，u87細(xì)胞（人腦膠質(zhì)瘤）和l929（小鼠成纖維細(xì)胞）的細(xì)胞存活率均大于百分之八十，說明聚合物peg-pthy材料生物相容性很好。

表3為本發(fā)明其他聚合物表征，其中阿霉素理論載藥量20wt.%。

表3本發(fā)明其他聚合物表征

所以，由本發(fā)明的含有碘元素的聚氨基酸聚合物可以形成納米粒子并且對細(xì)胞毒性小，可以作為相容性好的藥物載體。

實施例十五載阿霉素peg-pthy聚合物囊泡的細(xì)胞毒性測試

采用mtt法對包載阿霉素peg-pthy聚氨基酸囊泡的細(xì)胞毒性進(jìn)行測試。使用到的細(xì)胞為u87細(xì)胞（人腦膠質(zhì)瘤）。在37℃，5%二氧化碳條件下，在含有10%血清的dulbecco’smodifiedeagle培養(yǎng)基（dmem）中培養(yǎng)，細(xì)胞密度為1×10⁴個/孔。12小時后，培養(yǎng)基用80μl含有10%血清的dmem替換，然后分別加入20μl載阿霉素藥的peg-pthy聚合物囊泡（dox-ps）和crgd-peg-pthy聚合物囊泡（dox-crgd-ps）溶液，阿霉素濃度設(shè)定為0.01μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4小時后培養(yǎng)基用100μl新鮮的dmem替換，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)44小時后每個孔加入10μl的mtt溶液（5mg/ml）。繼續(xù)培養(yǎng)4小時，加入100μldmso溶解生成的結(jié)晶子。樣品的光學(xué)密度用biotek微盤測量儀在570nm處測定。實驗用臨床廣泛使用的阿霉素脂質(zhì)體納米藥物（dox-lps）為陽性對照組。細(xì)胞單獨在10%血清的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)的結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，記為100%存活。附圖5為u87細(xì)胞（人腦膠質(zhì)瘤）存活率圖，結(jié)果顯示dox-ps的細(xì)胞毒性與dox-lps的細(xì)胞毒性相對，而且接上crgd靶向分子后對腫瘤細(xì)胞的毒性大大增加，crgd-dox-ps對u87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的半致死濃度（ic50）低至值4.77μg/ml，與peg-pthy膠束藥物的4.82近似。這些結(jié)果表明基于peg-pthy聚合物囊泡的納米藥物有較好的體外抗腫瘤活性。

本發(fā)明以peg-pthy、crgd-peg-pthy為對象分析造影性能，結(jié)果如下，其他聚合物囊泡取得近似的效果。

實施例十六peg-pthy聚合物囊泡的體外滲透壓

使用美國wescorvapro5600露點滲透壓儀測定碘海醇、碘克沙醇以及peg-pthy囊泡在體外的滲透壓值。使用到的碘海醇、碘克沙醇以及peg-pthy囊泡的濃度分別為20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml及50mg/ml。納米粒子用pbs透析得到，通過超濾濃縮，離心速度為3000rpm。附圖6為不同濃度的碘海醇、碘克沙醇以及peg-pthy囊泡在體外的滲透壓值，從圖中可以看出，隨著濃度的增加，小分子單體碘海醇和碘克沙醇的滲透壓值會不斷增加，而peg-pthy聚合物囊泡的滲透壓則不會隨濃度的增加而有多大變化，說明聚合物peg-pthy材料生物相容性很好。因此，與傳統(tǒng)小分子造影劑不同，本發(fā)明制備的peg-pthy囊泡在濃度增大時不會產(chǎn)生滲透壓過大的問題。

實施例十七peg-pthy聚合物囊泡的體內(nèi)急性毒性實驗

50mgi/ml聚合物囊泡粒子通過尾靜脈注射（200μl）到km小鼠體內(nèi)，24小時候以后，采集血液后將小鼠犧牲。血常規(guī)的數(shù)據(jù)如附圖7。數(shù)據(jù)顯示，該造影劑在給藥劑量為50mgi/ml的時候在體內(nèi)并沒有顯示出急毒性，而且對肝臟和腎臟的功能并沒有產(chǎn)生影響。

實施例十八peg-pthy聚合物囊泡的體外ct造影

附圖8為上述peg-pthy聚合物囊泡溶液的ct圖，可以看出，隨著聚合物納米粒子濃度的增大，ct值隨之增大；并且聚氨基酸囊泡的濃度與ct值之間有很好的線性關(guān)系。所以，含碘聚氨基酸聚合物可以做為ct成像的顯影劑。

實施例十九peg-pthy聚合物囊泡在小鼠體內(nèi)的造影

50mgi/ml聚合物囊泡通過尾靜脈注射（200μl）到c57/bl6小鼠體內(nèi)，收集不同時間間隔的ct圖像，分別選取0小時，2小時，4小時，6小時，10小時來觀測peg-pthy囊泡作為血池造影的效果。如附圖9所示，在2小時從冠狀面可以看出，主動脈和下腔靜脈有明顯的增強(qiáng)；從矢狀面觀察，2小時的時候，可以從ct圖像上看到明顯且清晰的血管圖像，ct值增強(qiáng)有200hu。并且，ct增強(qiáng)值在8小時后仍大于100。由此結(jié)果說明，該囊泡可以用于血池的長時間和高效造影。附圖10是小鼠心臟和肝臟在不同時間的ct造影圖象，從附圖9可以看出，該囊泡在小鼠體內(nèi)經(jīng)過循環(huán)后大部分都在肝臟部位富集。

實施例二十crgd-peg-pthy囊泡用作腫瘤新生血管的納米造影劑

50mgi/ml混有crgd-peg-pthy囊泡通過尾靜脈注射（200μl）到荷瘤裸鼠體內(nèi)，b16黑色素瘤模型被選用作為新生血管靶向的模型的ct成像。不同時間點的ct圖像被收集用來證明腫瘤新生血管的靶向能力。由附圖11可知，b16黑色素瘤小鼠在腫瘤部位6小時ct值增強(qiáng)達(dá)到70hu。說明該納米粒子可以很好的靶向到u87mg腦膠質(zhì)瘤部位的新生血管。

實施例二十一crgd-peg-pthy囊泡用于人a549原位肺癌的ct成像

通過尾靜脈注射囊泡溶液到小鼠體內(nèi)，觀察不同時間點的ct造影圖，從圖12中可以觀察到，帶有靶向的囊泡在小鼠體內(nèi)經(jīng)過6個小時的循環(huán)，ct圖顯示有明顯的顯影效果，說明帶有靶向的囊泡可以有效的在腫瘤部位積累。

以上這些結(jié)果均說明本發(fā)明的含碘聚合物形成的靶向囊泡可以在體內(nèi)體外有很好的造影效果，可以用于制備顯影劑，在腫瘤及其他疾病的診斷方面有廣泛的應(yīng)用前景。