專利名稱：四碘甲狀腺素的檢測試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，具體涉及基于光激化學(xué)發(fā)光原理的四碘 甲狀腺素的檢測試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
甲狀腺疾病是一組較常見的內(nèi)分泌疾病，包括缺碘性甲狀腺腫、其他原因引起的 甲狀腺腫、甲亢、甲狀腺瘤、甲狀腺炎、甲狀腺功能減退等。甲狀腺病的發(fā)生率比較高。甲亢也就是甲狀腺功能亢進(jìn)癥，它是一種臨床上十分常見的內(nèi)分泌疾病。是指由 各種原因?qū)е录谞钕俟δ茉鰪?，甲狀腺激素分泌過多或因甲腺原氨酸(T4、T4)在血液中水 平增高所導(dǎo)致的機體神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)心血管系統(tǒng)等多系統(tǒng)的一系列高代謝 癥候群以及高興奮癥狀和眼部癥狀。甲狀腺機能減退癥系甲狀腺激素TSH合成與分泌不足，或甲狀腺激素生理效應(yīng)不 好、生物效應(yīng)不足而致的全身性疾病。臨床上可分為呆小病、幼年甲低、成人甲低。若功能 減退始于胎兒或新生兒期，稱為克汀??；始于性發(fā)育前兒童稱幼年型甲減；始于成人稱成 年型甲減。甲狀腺瘤是臨床常見病，其中絕大多數(shù)為良性病變，少數(shù)為癌，肉瘤，惡性淋巴瘤 等。該病女性發(fā)病率明顯高于男性，男女發(fā)病比例約1 2 3。甲狀腺炎是以炎癥為主要表現(xiàn)的甲狀腺疾病，包括感染性和非感染性。不少見。臨 床權(quán)威上所說的急性、亞急性及已經(jīng)慢性甲狀腺炎，只表明青年疾病過程的長短，它們之間 無內(nèi)在聯(lián)系，也不互相轉(zhuǎn)變，每種具有發(fā)表不同的病因有著臨床特點、病理過程及固有的結(jié)局。四碘甲狀腺素(3，5，3',5' -tetraiodo-L-thyronine，縮寫 T4)，是從甲狀腺濾 泡上皮分泌產(chǎn)生的激素，釋放入血后，T4絕大部分都與TBG(甲狀腺結(jié)合球蛋白)結(jié)合，通 過與細(xì)胞核內(nèi)特異受體蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)該蛋白產(chǎn)生活性構(gòu)象，使其DNA結(jié)合部位與DNA的特 定部位有效結(jié)合，從而激活DNA的轉(zhuǎn)寫過程，達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的生物功能，其中約0. 03% 的總血清T4呈游離狀態(tài)，與結(jié)合激素動態(tài)平衡，維持正常的生理功能。大量生物學(xué)和生理 學(xué)的實驗結(jié)果證明，甲狀腺激素對細(xì)胞的正常發(fā)育和分化、動物的體溫調(diào)節(jié)和各種糖、脂肪 和蛋白質(zhì)代謝平衡的維持起重要的調(diào)節(jié)和控制作用。因此，檢測血清T4對于甲狀腺功能亢 進(jìn)、甲狀腺功能減低及甲狀腺腫瘤的診斷或鑒別診斷，對甲狀腺功能相關(guān)疾病的發(fā)展過程、 療效及預(yù)后評估中具有十分重要的意義。血清中T4濃度高于正常值，可能是(1)甲狀腺機能亢進(jìn)；(2)藥物影響如服用 甲狀腺素、雌激素類藥物及避孕藥、奮乃靜等；(3)其它疾病如先天性遺傳性甲狀腺結(jié)合 球蛋白增高癥、急性傳染性肝炎、間歇性血卟啉病等；(4)生理因素如妊娠。血清中T4濃度低于正常值，可能是(1)甲狀腺疾病原發(fā)性甲狀腺功能下癥、慢 性淋巴性甲狀腺炎；(2)藥物影響抗甲狀腺藥物；(3)其它疾病嚴(yán)重肝腎功能衰竭、腎病 綜合癥、活動性肢端肥大癥、遺傳性甲狀腺素結(jié)合球蛋白減少癥等。
免疫學(xué)檢測是基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測的一種手段，由于其可以利 用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對被檢測信號進(jìn)行放大和顯示，因此常被用于檢測蛋白質(zhì)， 激素等微量生物活性物質(zhì)。我國免疫學(xué)檢測基本經(jīng)歷了放射免疫檢測(興起于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)仍普遍使 用于縣級以上醫(yī)院)；酶聯(lián)免疫檢測(興起于20世紀(jì)80年代，各臨床機構(gòu)普遍使用)；以化 學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測技術(shù)(20世紀(jì)90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成 長期)三個階段。這一衍變過程主要是基于對檢測方法的敏感性、準(zhǔn)確性、以及操作簡捷性 的需求的不斷提高而決定的。化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay)是近十年來在世界范圍內(nèi) 發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)。檢測原理是以發(fā)光物質(zhì)作為信號放大系統(tǒng)并籍助 其發(fā)光強度直接測定免疫結(jié)合。由于其高靈敏度，檢測范圍寬等優(yōu)點，已成為放射性免疫分 析與普通酶免疫分析的取代者，是免疫學(xué)檢測重要的發(fā)展方向。但目前國內(nèi)自行研制的化學(xué)發(fā)光檢測試劑，大多為非均相反應(yīng)，采用化學(xué)底物直 接標(biāo)記，通過化學(xué)反應(yīng)激發(fā)。其分析過程與傳統(tǒng)酶標(biāo)檢測類似，需反復(fù)清洗與分離，檢測耗 時長，自動化程度不高。國外廠家檢測試劑隨發(fā)光基質(zhì)與檢測形式而各不相同。以Abbott， Bayer與Chiron等公司為代表的化學(xué)激發(fā)，即以化學(xué)發(fā)光底物直接標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免 疫測定。最常用的為吖啶酯，在堿性環(huán)境中可被過氧化氫氧化而發(fā)光。BD則以AKP，金鋼 脘為基質(zhì)采用酶促化學(xué)發(fā)光。Roche為則采用電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence， ECL)，發(fā)光底物二價的三聯(lián)吡啶釕及反應(yīng)參與物三丙胺在電極表面失去電子而被氧化。氧 化的三丙胺失去一個H+而成為強還原劑，將氧化型的三價釕還原為激發(fā)態(tài)的二價釕，隨即 釋放光子而恢復(fù)為基態(tài)的發(fā)光底物。這一過程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，不斷地發(fā)出光 子而常保持底物濃度的恒定。因反應(yīng)過程中牽涉到分離清洗，自動化設(shè)計復(fù)雜，儀器相當(dāng)昂 貴。此外，發(fā)光基質(zhì)的穩(wěn)定性也是一大問題。光激化學(xué)發(fā)光法通過引入激光技術(shù)與納米微球技術(shù)，成功地解決了上述不足。因 反應(yīng)在均相中進(jìn)行，既加快了反應(yīng)速度，又避免了反復(fù)分離與清洗步驟，能有效降低檢測背 景值，減少反應(yīng)時間，并可實現(xiàn)自動化操作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可用于定量檢測血清中四碘甲狀腺素的檢測試劑盒及 其使用方法。本發(fā)明的技術(shù)原理本發(fā)明的四碘甲狀腺素檢測試劑及試劑盒與光激化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)相關(guān)，光激化 學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是一種利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)發(fā)射的光波進(jìn)行免疫測定的方法。該技術(shù)主要整 合了高分子微粒技術(shù)，有機合成，蛋白質(zhì)化學(xué)與臨床檢測相關(guān)領(lǐng)域的研究。本發(fā)明之所以能檢測血清中的四碘甲狀腺素的水平，首先使用解離劑將樣品中與 甲狀腺素結(jié)合球蛋白(thyroxine-binding globulin, TBG)結(jié)合的四碘甲狀腺素(T4)解 離。然后在均相條件下，將內(nèi)部帶有染料的感光微粒(納米級)以及包被有三碘甲腺原氨 酸(T3)并且內(nèi)部帶有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒(納米級)的混合物作為試劑和檢測樣品混
合o
T3又名三碘甲腺原氨酸，是一種從甲狀腺分泌出來的激素，是一組含碘的酪氨酸， 以碘和酪氨酸為原料在甲狀腺腺細(xì)胞內(nèi)合成。T3分泌量較少，但其活性大，是T4的5倍。 T3在甲狀腺外，可以由甲狀腺素的脫碘化形成，兩者在結(jié)構(gòu)上極為相似。血液中的T3絕大 部分與TBG結(jié)合，約0. 4%的游離T3作用于靶細(xì)胞，維持正常的生理功能。約20%循環(huán)中 T3由甲狀腺產(chǎn)生，其余80%主要來自肝臟，由T4的外環(huán)脫碘(5' D-I)轉(zhuǎn)換產(chǎn)生。T3分子式為C15H12I3N04，結(jié)構(gòu)如下所示 T4分子式為C15|||||4N04,結(jié)構(gòu)如下所示 由于T4和T3分子結(jié)構(gòu)十分相似，因此T3可和針對T4的抗體發(fā)生微弱的結(jié)合。當(dāng) 血清中存在T4時，這一脆弱的結(jié)合即被破壞，被T4和T4抗體的結(jié)合取代。此時納米感光微粒和包被有表面抗體的納米發(fā)光微?？裳杆儆行У夭蹲剿牡饧?狀腺素(T4)，在近距離內(nèi)，三者形成免疫夾心復(fù)合物。激發(fā)光照射后，納米感光微粒中的染 料被誘導(dǎo)激活，并釋放高能態(tài)的活性氧離子(單線態(tài)氧)。該高能態(tài)的活性氧離子被近距離 的納米發(fā)光微粒俘獲，從而傳遞能量以激活所述發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物。數(shù)微秒后，發(fā)光 微粒中的發(fā)光化合物將釋放出高能級紅光。用光子計數(shù)器測定這些高能級光子，并通過電 腦將光子數(shù)換算為目標(biāo)分子濃度，光子數(shù)的多少即精確地反映了目標(biāo)分子的濃度。而當(dāng)樣 本不含四碘甲狀腺素(T4)時，無法在近距離形成免疫夾心復(fù)合物，活性氧離子也無法傳遞 至發(fā)光微粒表面?；钚匝蹼x子在液相中迅速衰減，檢測時則無高能級紅光產(chǎn)生。具體原理 參見圖1及圖2。據(jù)文獻(xiàn)記載，8-苯胺基-1-萘磺酸銨(8-Anilino-l-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，簡稱ANS)能夠通過與蛋白疏水區(qū)域之間的強有力的結(jié)合作用，從 而使蛋白構(gòu)象變化，解離蛋白之間的相互作用。(Yoshimura，T.，Monitoring protein conformational changes during membrane fusion. Method Enzymol. ,221,72-82)基于上述原理，本發(fā)明第一方面提供了一種用于檢測四碘甲狀腺素(T4)的檢測 試劑盒，包括四碘甲狀腺素檢測微粒、生物素標(biāo)記的抗四碘甲狀腺素抗體和解離劑；其中 四碘甲狀腺素檢測微粒為三碘甲腺原氨酸包被的發(fā)光微粒，解離劑為8-苯胺基-1-萘磺酸銨、柳硫汞、水楊酸鈉或者三氯醋酸鈉。試劑盒中，還可包括親和素包被的感光微粒。 在試劑盒中，上述三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發(fā)光微粒、生物素標(biāo)記的抗四碘 甲狀腺素抗體(T4Ab)、解離劑和親和素包被的感光微粒分別獨立包裝，且三碘甲腺原氨酸 (T3)包被的發(fā)光微粒、生物素標(biāo)記的抗四碘甲狀腺素抗體(T4Ab)和親和素包被的感光微 粒均為混懸液。上述含有三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發(fā)光微粒、生物素標(biāo)記的抗四碘甲狀 腺素抗體(T4Ab)或親和素包被的感光微粒的溶液的溶劑可以是常規(guī)的適合抗原抗體反應(yīng) 的溶劑體系，如HEPES緩沖體系、Tris緩沖體系。三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發(fā)光微粒的 溶劑優(yōu)選PH8. 0的成分為HEPES、NaCUEDTA和BSA的HEPES緩沖液，生物素標(biāo)記的抗四碘 甲狀腺素抗體(T4Ab)的溶劑優(yōu)選pH8. 0的成分為Tris、NaCl和EDTA_Na-2H20的Tris緩 沖液，親和素包被的感光微粒的溶劑優(yōu)選HEPES、NaCl和EDTA_Na-2H20的HEPES緩沖液，上 述各種溶劑中還可添加起封閉和蛋白保護(hù)作用的物質(zhì)如BSA以及防止微粒聚集的穩(wěn)定試 劑如Tween20，出于對試劑防腐以及長期儲存的考慮還可在溶劑中添加防腐劑，防腐劑優(yōu)選 100U/ml慶大霉素和質(zhì)量百分比為萬分之五的Proclin 300作為防腐劑。在用于定量檢測四碘甲狀腺素(T4)時，上述試劑盒中還可包括含有多種已知四 碘甲狀腺素濃度的溶液。上述不同四碘甲狀腺素濃度的溶液分別獨立包裝。上述解離劑選自8-苯胺基-1-萘磺酸銨、柳硫汞、水楊酸鈉或者三氯醋酸鈉，優(yōu)選 為8-苯胺基-1-萘磺酸銨(ANS)。解離劑的緩沖液可以為Tris緩沖液、PBS緩沖液或者雙 蒸水，較佳為雙蒸水。上述發(fā)光微粒是指填充有發(fā)光化合物和鑭系元素化合物的高分子微粒。發(fā)光化合 物可以是Dioxene (二氧雜環(huán)己烯)或thioxene (二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合 物可以是Eu (TTA) 3/Τ0Ρ0或Eu (TTA) 3/Phen等，該微?？捎墒袌錾腺彽谩Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，由于最終的檢測反應(yīng)是均相反應(yīng)，發(fā)光微粒的粒徑(微粒的平均直徑) 太大(>400nm)會自然沉降，影響檢測效果，微粒的粒徑太小(< lOOnm)，會使制備過程中 的清洗工作比較困難，對抗體連接工作不利，因此發(fā)光微粒的粒徑范圍應(yīng)在100-400nm之 間，較好為150-300nm之間，優(yōu)選250nm。發(fā)光微粒的表面官能團可以是任何能聯(lián)接蛋白質(zhì)的基團，但最常用的主要有羧基 和醛基表面官能團的微粒。使用不同的微粒表面官能團，連接抗體的反應(yīng)方式和條件也不 相同。鑒于獲得更好的三碘甲腺原氨酸(T3)的連接效率，試劑穩(wěn)定性和連接重復(fù)性，經(jīng) 試驗優(yōu)選醛基表面官能團的微粒，并應(yīng)用了 NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)作為抗體的連接方法。發(fā)光微粒的發(fā)光量會直接影響最終檢測的發(fā)光效果。市場提供的發(fā)光微粒發(fā)光 量一般會在150，000-350, 000光子數(shù)/100 μ g發(fā)光微粒范圍內(nèi)，優(yōu)選中等強度偏上的水平 (彡250，000光子數(shù)/IOOug)發(fā)光微粒。上述三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發(fā)光微粒中，發(fā)光微粒與三碘甲腺原氨酸(T3) 的質(zhì)量比例較佳為10 (0.01-0. 05)，優(yōu)選10 0.02。上述生物素標(biāo)記的抗體(T4Ab)中，生物素與抗體的分子比例較佳為(10-50) 1， 優(yōu)選30 1。上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670-690nm光激發(fā)下，可以 產(chǎn)生單線態(tài)氧離子，當(dāng)其與發(fā)光微粒距離足夠近的情況下，單線氧離子傳遞到發(fā)光微粒，與發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物反應(yīng)，產(chǎn)生紫外光，紫外光再進(jìn)一步激發(fā)鑭系元素化合物，產(chǎn)生 520-620nm波長光子。感光化合物可以是酞菁染料等，該微粒也可由市場上購得。
上述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質(zhì)量比例無特殊限制，較佳 為 1 (3-10)，優(yōu)選 1 5。市售感光微粒均適用于本發(fā)明，微粒粒徑較佳為180-260nm，優(yōu)選220nm。三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發(fā)光微粒采用NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制備，反應(yīng) 步驟如下1)混合將發(fā)光微粒與三碘甲腺原氨酸(T3)按質(zhì)量比例為10 (0. 1-0. 5)混合 于緩沖液中；2)反應(yīng)加入緩沖液配制的NaBH3CN溶液混合并反應(yīng)；3)封閉加入緩沖液配制的Gly及NaBH3CN溶液，混勻反應(yīng)后，再加入BSA溶液封 閉；4)清洗產(chǎn)物，獲得三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發(fā)光微粒。其中，混合步驟中，發(fā)光微粒與三碘甲腺原氨酸(T3)的質(zhì)量比例為 10 (0.1-0. 4)，優(yōu)選10 0.2。反應(yīng)緩沖液可為MES緩沖液、磷酸緩沖液，優(yōu)選MES緩沖 液，濃度優(yōu)選0. 05M,反應(yīng)步驟中，反應(yīng)溶液中發(fā)光微粒的濃度可為10-40mg/ml，優(yōu)選20mg/ ml ο改進(jìn)的，三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發(fā)光微?？刹捎孟率龇椒ㄖ频?)混合將發(fā)光微粒與三碘甲腺原氨酸(T3)混合于緩沖液中。較佳的，緩沖液 為MES緩沖液，發(fā)光微粒與三碘甲腺原氨酸(T3)的質(zhì)量比例為10 (0.01-0. 05)，優(yōu)選
10 0.02ο2)反應(yīng)加入緩沖液配制的EDACd-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽 酸鹽)溶液混合并反應(yīng)。較佳的，緩沖液為MES緩沖液，混合溶液中，發(fā)光微粒與EDAC的質(zhì) 量比優(yōu)選為25 1混合。反應(yīng)條件為37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)。一般約48小時反應(yīng)充分。3)往步驟2獲得的反應(yīng)液中加入緩沖液配制的BSA溶液混勻并反應(yīng)。較佳的，緩沖 液為MES緩沖液。BSA溶液與步驟2獲得的反應(yīng)液體積比較佳為5 8。反應(yīng)條件為37°C 旋轉(zhuǎn)反應(yīng)。一般約16小時反應(yīng)充分。4)清洗產(chǎn)物，獲得三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發(fā)光微粒。清洗的方式可以為離心法清洗或透析法清洗。透析法清洗步驟采用反應(yīng)緩沖液透析，每次4-5小時，更換緩沖液4次。透析清 洗操作時間較長，且微粒損失較多，造成收率降低。離心法清洗步驟包括離心去上清，加入反應(yīng)緩沖液洗滌，超聲處理打開沉淀，如此 反復(fù)3-5次。離心法清洗時離心力會使發(fā)光微粒暫時聚集在一起，但經(jīng)過超聲處理可以很 容易再次分散打開，此法操作時間短，且收率較高。因此優(yōu)選采用此種清洗方式。上述改進(jìn)的制備方法與NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法的主要差別在于主要反應(yīng)試劑 NaBH3CN替換成了 EDAC，該試劑的替換，不僅使得反應(yīng)時間與NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法相 比縮短了 10個多小時，而且發(fā)光微粒與二碘甲腺氨酸的交聯(lián)效率獲得了提高，節(jié)省了二碘 甲腺氨酸用量，此外，試驗表明，該方法制得的檢測微粒與NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制得 的檢測微粒相比，在相同條件下反應(yīng)信號更強，靈敏度更高，檢測范圍也更廣。
親和素包被的感光微粒可采用NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制備。本發(fā)明第二方面，公開了上述四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，四碘甲狀 腺素的檢測試劑盒利用光激化學(xué)發(fā)光原理，采用雙抗體夾心法，可定量檢測血清中的四碘 甲狀腺素。 四碘甲狀腺素(T4)的檢測試劑盒的使用方法包括下列步驟首先使用解離劑對樣品進(jìn)行預(yù)處理，然后將樣品與試劑盒中用于檢測四碘甲狀腺 素的檢測微粒、生物素標(biāo)記的游離抗四碘甲狀腺素抗體(T4Ab)和親和素包被的感光微粒 混合反應(yīng)，而后用激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測量每個反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號值。具體包括下列步驟1)在反應(yīng)孔中加入樣品，再依次加入T3包被的發(fā)光微粒、解離劑和生物素標(biāo)記的 抗T4抗體(T4Ab)，獲得初始反應(yīng)溶液，混合反應(yīng)；2)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應(yīng)溶液進(jìn)行反應(yīng)；3)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測量每個反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號值。上述激發(fā)光光源波長范圍為600-700nm，優(yōu)選640-680nm ；反應(yīng)孔發(fā)光的發(fā)射光光 源波長范圍為600-680nm，優(yōu)選610_620nm ；發(fā)射光延遲時間范圍為lOOms-lOOOms ；激發(fā)光 光源的功率范圍為5-lOOmw，優(yōu)選40-60w。上述四碘甲狀腺素(T4)的檢測試劑盒在應(yīng)用在定量檢測四碘甲狀腺素(T4)時， 需根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中T4含量。上述步驟1)的反應(yīng)條件為37°C溫育10-30分鐘，優(yōu)選20分鐘，步驟2)的反應(yīng)條 件也為37°C溫育10-30分鐘，優(yōu)選15分鐘。上述初始反應(yīng)溶液中，三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發(fā)光微粒的濃度無特殊限制， 可以為 50-200 μ g/ml，優(yōu)選 150 μ g/ml。上述解離劑的工作濃度可以為0. 5mg/ml-l. 5mg/ml，較佳為lmg/ml。初始反應(yīng)溶液中，生物素標(biāo)記的抗四碘甲狀腺素抗體的濃度無特殊限制，可以為 0. 5-1. 5 μ g/ml,較佳為 1 μ g/ml。在最終反應(yīng)溶液中，親和素包被的感光微粒的濃度一般控制在10-100 μ g/ml，可 以為 30-60 μ g/ml，優(yōu)選 40 μ g/ml。上述方法中，初始反應(yīng)溶液的體積無特殊限制，可以為60-100 μ 1，優(yōu)選ΙΟΟμ 1 ； 最終反應(yīng)溶液的體積也無特殊限制，可以為120-275 μ 1，優(yōu)選275 μ 1。上述樣品包括血清、血漿、全血或標(biāo)準(zhǔn)品。當(dāng)本發(fā)明的檢測試劑盒用于定量檢測四碘甲狀腺素(Τ4)時，還需根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 計算待測樣品中四碘甲狀腺素的含量本發(fā)明是采用光激化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)，配合光激化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)測定人血清樣 品中四碘甲狀腺素(Τ4)的定量體外診斷試劑盒，可以與其它血清和臨床信息聯(lián)合用于甲 狀腺疾病的輔助診斷及相關(guān)病人治療效果的監(jiān)測。本發(fā)明的四碘甲狀腺素(Τ4)光激化學(xué) 發(fā)光檢測試劑盒靈敏度高、精密性好、檢測范圍寬、而且操作簡便、快速、成本低、穩(wěn)定性好、 無環(huán)境污染和放射危害，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景。



圖1 光激化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)原理圖微粒結(jié)合形成二聚體，產(chǎn)生光子信號。圖2 光激化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)原理圖未結(jié)合微粒，無光子信號產(chǎn)生。圖3 單線態(tài)氧隨微粒間距離衰減，在大概600nm的距離，基本沒有單線氧的存在， 因此也不發(fā)光FG BEAD 發(fā)光微粒，內(nèi)含發(fā)光分子；GG BEAD 感光微粒，內(nèi)含感光分子；Singlet Oxygen 單線態(tài)氧,活性氧離子；A/B 兩者可直接或間接特異結(jié)合的活性分子。如在雙抗夾心檢測中，A，B為針對 靶分子C不同的表位的單克隆抗體。圖4 比較試驗測試結(jié)果示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而 非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均 為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。實驗中儀器原料來源及試劑配方原料及試劑廠家Biotin-X-X-NHSSigma TLC ^ 95%BSAEquitech/protease freeT3BiochemikaGlySigma ^ 95%HEPES經(jīng)科宏達(dá)Tris國藥NaBH3CNAcrosANSSigma抗-T4單克隆抗體Biospecfic感光微粒美國PentaTek公司發(fā)光微粒美國PentaTek公司8-苯胺基-1-萘磺酸銨(ANS) Sigma儀器型號 廠家光激化學(xué)發(fā)光分析儀HT 上海博陽醫(yī)療儀器公司紫外分光光度計 752P 上海光譜公司高速冷凍離心機 CR21GHITACHI分析天平ALC-2100. 2 ACCULAB分析天平AG285METTLERPH 計DELTA320METTLER粒徑儀Model 370 Nicomp
酶標(biāo)儀MultiSKAN MK3 labsystem超聲波清洗器 KQ5200E昆山超聲儀器公司漩渦混合器 QL-901其林貝爾 磁力攪拌器(79-1)2003-03國華實施例1 T3包被的發(fā)光微粒的制備抗體與發(fā)光微粒制備方法1)發(fā)光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康聂然l(fā)光微粒于高速冷凍離心機中離心， 棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光微 粒濃度至100mg/ml。2)抗體處理T3于0. 05Μ pH6. 0的MES緩沖液(以下簡稱MES緩沖液)透析，透 析完成后測定濃度，并調(diào)節(jié)濃度至2mg/ml。3) MES緩沖液、100mg/ml的發(fā)光微?；鞈乙?MES緩沖液)和2mg/ml的T3 (MES緩 沖液)以1 10 1的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。4)用MES緩沖液配制40mg/ml的EDAC溶液，按照與發(fā)光微粒100mg/100uL EDAC 的比加入，迅速混勻，37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時。5)加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5 8，迅速混 勻，37。C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時。6)用MES緩沖液離心清洗四次，最后用發(fā)光試劑緩沖液進(jìn)行懸浮，測定粒徑和固 含量，調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。將上述方法與采用NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制得的檢測微粒進(jìn)行比較。NaBH3CN還原胺化反應(yīng)法的制備方法1)發(fā)光微粒處理吸取一定量的發(fā)光微粒于高速冷凍離心機中離心，棄去上清， 加入一定量PH6. 00. 05M MES緩沖液(以下簡稱MES緩沖液)，超聲至微粒重新懸浮。2)混合T3用0. 2Ν NaOH配制成lmg/ml的溶液。按照IOmg發(fā)光微粒0. 2mg T3 加入T3溶液，補加MES緩沖液至發(fā)光微粒固含量為25mg/ml，振蕩混勻得到反應(yīng)液。3)反應(yīng)用MES緩沖液配制25mg/mL的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液3 250的 體積比加入，混勻。37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)68-70小時。4)封閉用MES緩沖液配制75mg/mL的Gly溶液以及25mg/mL的NaBH3CN溶液，按 照與反應(yīng)液2 1 10的體積比加入上述溶液中，混勻，37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時。5)清洗向反應(yīng)好的發(fā)光抗體中加入0. IM Na2CO3溶液，高速冷凍離心機離心，棄 上清，加入新鮮0. IM Na2CO3，重新懸浮，再次離心，如此清洗4次，最后用少量發(fā)光試劑緩沖 液進(jìn)行懸浮。6)取樣測定清洗好的發(fā)光抗體的固含量、粒徑，用發(fā)光試劑緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光抗體 濃度lOmg/mL準(zhǔn)備進(jìn)行稀釋。兩者制備結(jié)果的比較1.節(jié)省了制備時間 2.提高了抗體交聯(lián)效率，節(jié)省了抗體用量 3.增強了反應(yīng)信號 4.提高了靈敏度 5.擴大了檢測范圍 參照上述的制備方法制備T3包被的發(fā)光微粒，并通過各項性能測試比較從以下 幾方面進(jìn)行了具體工藝條件的選擇研究本實施例中涉及的各個參數(shù)的檢測方法如下1.光信號檢測方法
在反應(yīng)孔中分別加入25 μ 1樣品，再依次加入25 μ 1發(fā)光試劑(150 μ g/ml)、25ul 解離劑ANS (lmg/ml)、25 μ 1生物素化抗體試劑(1 μ g/ml)。然后放入儀器(光激化學(xué)發(fā)光 分析系統(tǒng))，由儀器自動按以下步驟操作振動，37°C溫育20分鐘，再自動加入175 μ 1親和 素包被的感光微粒試劑(40 μ g/ml)后37°C溫育15分鐘。儀器自動產(chǎn)生激光照射微孔計算 每孔發(fā)光光子量。2.精密性檢測方法 分別采用2個批號的T4試劑盒對質(zhì)控品QC L、QC H進(jìn)行1次檢測，每次復(fù)測10 孔，每份樣品共檢測20次。得到如下結(jié)果 由上述結(jié)果可知，本產(chǎn)品其批內(nèi)精密性小于5%，批間精密性小于10%。3.靈敏度檢測方法檢測10孔校準(zhǔn)品0 μ g/dl，計算其RLU均值(AVE)和二個標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，以 AVE-2SD反代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的濃度值即為本試劑盒的分析靈敏度，經(jīng)檢測兩個批號的試 齊U，其分析靈敏度分別為0. 46ug/dL、0. 50ug/dL，均不高于1 μ g/dl。4.工藝條件選擇1)防腐劑的考察出于對試劑防腐以及長期儲存的考慮，我們選擇萬分之五Proclin 300作為防腐 劑進(jìn)行考察。檢測未添加防腐劑及添加萬分之五Proclin 300作為防腐劑的T4測定值< 2 μ g/ dL的血清、正常人血清、T4測定值彡25 μ g/dL的血清、BSA 0. OlM PBS。每種條件檢測 兩孔，取RLU檢測均值。結(jié)果見下表 根據(jù)以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)以萬分之五Proclin 300作為防腐劑對試驗結(jié)果沒有明 顯影響，故選用萬分之五Proclin 300作為防腐劑。2)校準(zhǔn)品稀釋液的選擇為了得到長期穩(wěn)定且較易獲取的校準(zhǔn)品稀釋液來取代不含T4的血清，使用20份T4測定值< 2 μ g/dL的臨床血清作為參照來考察備選校準(zhǔn)品稀釋液，備選校準(zhǔn)品稀釋液分 別有生理鹽水、雙蒸水、添加BSA的0. OlM pH 7. 4PBS、去激素牛血清，20份陰性血清每 份測單孔，計算該20孔的RLU檢測均值；備選校準(zhǔn)品稀釋液每種檢測兩孔，取RLU檢測均 值。檢測結(jié)果如下 根據(jù)以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)BSA 0. OlM PBS的光信號水平與臨床T4參照血清相 當(dāng)，所以我們選用1%BSA 0.01M PBS作為校準(zhǔn)品稀釋液。3)發(fā)光微粒與T3的反應(yīng)比例發(fā)光微粒T3分別按 10mg/0. 01mgU0mg/0. 02mgU0mg/0. 05mg 的比例包被，比較
選取最佳的包被反應(yīng)比例。檢測三種不同反應(yīng)比例制備好的T3包被發(fā)光微粒，其靈敏度、精密性、線性。檢測 結(jié)果如下表發(fā)光微粒與T3反應(yīng)比例的比較 根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，抗原加入量與發(fā)光微粒上包被的抗原量基本呈正比關(guān) 系，但T3抗原繼續(xù)增加時包被上的抗原達(dá)到飽和。綜合考慮QC結(jié)果及成本問題，選擇IOmg 發(fā)光微粒與0. 02mg T3的反應(yīng)比例可得到較好的線性及靈敏度。4)發(fā)光試劑緩沖液將T3包被的發(fā)光微粒用HEPES緩沖液、PBS緩沖液分別配成150 μ g/ml的濃度，比較選取最佳緩沖液。
HEPES 緩沖液pH8. 0,0. 05M HEPES+0. 3M NaCl+25mM EDTA+1. 6% BSA+ 表面活性 劑+防腐劑；PBS緩沖液pH7. 4，0. 02M PBS+1 % BSA+表面活性劑+防腐劑；以兩種緩沖液配制的T3包被的發(fā)光微粒，檢測其靈敏度、37°C破壞7天穩(wěn)定性、線 性。檢測結(jié)果如下表T3包被的發(fā)光微粒緩沖液比較 根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，把以兩種緩沖液配制的T3包被的發(fā)光微粒37°C破壞7d 后，整體RLU都有一定程度的下降，線性無明顯變化，但HEPES緩沖液比PBS緩沖液靈敏度 下降的程度更小一些，因此選擇HEPES作為試劑1的緩沖液。5)防腐劑的選擇出于對試劑防腐以及長期儲存的考慮，我們選擇萬分之五Proclin 300作為防腐 劑進(jìn)行考察。檢測未添加防腐劑及添加萬分之五Proclin 300作為防腐劑的T4測定值< 2 μ g/ dL的血清、正常人血清、T4測定值彡25 μ g/dL的血清、BSA 0. OlM PBS。每種條件檢測 兩孔，取RLU檢測均值。結(jié)果見下表 根據(jù)以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)以萬分之五Proclin 300作為防腐劑對試驗結(jié)果沒有明顯影響，故選用萬分之五Proclin 300作為防腐劑。6)清洗方式的選擇
透析法清洗步驟100倍體積透析，每次4-5小時，更換緩沖液2次。透析清洗操 作時間較長，且清洗不徹底。離心法清洗步驟12000rpm離心30分鐘，清洗3次，沉淀以超聲法重懸。這種方 法清洗所用時間較短，效果好。綜合考慮選用離心法清洗。最終選擇250nm的粒徑，發(fā)光量為≥250，000光子數(shù)/IOOug的發(fā)光微粒，BSA 的0. OlM pH 7. 4PBS作為稀釋液，萬分之五Proclin 300作為防腐劑，20mg/ml的發(fā)光微粒 反應(yīng)濃度，10 0. 02的re-bead與T3的比例，離心法清洗作為最優(yōu)制備條件。實施例2生物素標(biāo)記抗體的制備制備方法1)抗體處理將抗-T4單克隆抗體(標(biāo)記)透析于0. IM NaHC03溶液中，測定抗 體濃度并調(diào)節(jié)至lmg/mL ；2)用 DMSO 配制 16. 17mg/mL 的 Biotin 溶液；3)標(biāo)記取處理好的lmg/mL抗-T4單克隆抗體(標(biāo)記)與配制好的Biotin溶液， 二者按照10000 54的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻；2 8°C靜置反應(yīng)12 16小時；4)透析將反應(yīng)好的生物素標(biāo)記抗體透析于生物素標(biāo)記透析緩沖液；5)將透析好的生物素化抗體吸出轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，取樣測定抗體濃度，用生 物素標(biāo)記透析緩沖液調(diào)節(jié)生物素標(biāo)記抗體濃度至0. 5mg/mL。本實施例中涉及的各個參數(shù)的檢測方法如下1、將抗體與Biotin按照不同比例進(jìn)行反應(yīng)并進(jìn)行檢測將Biotin-X-X-NHS 抗體按照20 1、30 1、40 1的不同比例進(jìn)行標(biāo)記，比較 選取最佳的標(biāo)記比例。檢測三種不同標(biāo)記比例制備好的生物素-抗T4，其靈敏度、精密性以及線性。檢測 結(jié)果如下表抗體與生物素的標(biāo)記比例比較
根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，生物素抗T4標(biāo)記比例為30 1時，其靈敏度較好，成本 也較低。故選擇30 1的比例作為生物素抗T4的標(biāo)記比例。2、生物素標(biāo)記抗體緩沖液的選取將生物素標(biāo)記抗T4抗體用Tris緩沖液、PBS緩沖液分別配成1 μ g/ml的濃度，比 較選取最佳緩沖液。Tris 緩沖液pH 8. 0,0. IM Tris+0. 3M NaCl+25mM EDTA+0. BSA+表面活性劑 + 防腐劑；PBS緩沖液pH7. 4，0. 02M PBS+1 % BSA+表面活性劑+防腐劑；以兩種緩沖液配制的生物素標(biāo)記抗T4，檢測其靈敏度、37°C破壞7天穩(wěn)定性、線 性。檢測結(jié)果如下表生物素標(biāo)記抗T4緩沖液比較 根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，把以兩種緩沖液配制的生物素標(biāo)記抗T437°C破壞7天 后，整體RLU都有一定程度的下降，線性無明顯變化，但Tris緩沖液比PBS緩沖液靈敏度下 降更小一些，因此選擇Tris作為試劑2的緩沖液。3、生物素標(biāo)記抗體溶液工作濃度的選取3. 1.生物素標(biāo)記抗T4工作濃度選取將試劑2中的生物素標(biāo)記抗T4用Tris緩沖液分別配成0. Syg/mlUyg/ml、 1. 5 μ g/ml的濃度，比較選取最佳工作濃度。以三種不同濃度的生物素標(biāo)記抗T4的試劑2，檢測其靈敏度、線性。檢測結(jié)果如下 表生物素標(biāo)記抗T4工作濃度的選取 根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，試劑2中生物素標(biāo)記抗T4的工作濃度為1 μ g/ml時，其 靈敏度、線性更佳。實施例3親和素包被的感光微粒的制備感光微粒采用粒徑為220 士40nm的感光微粒(美國PentaTek公司)制備方法a、感光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康母泄馕⒘Ｓ诟咚倮鋬鲭x心機中離心，棄去 上清，加入一定量MES緩沖液，超聲細(xì)胞破碎儀上超聲至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào) 節(jié)感光微粒濃度至100mg/ml。b、親和素溶液配制稱量一定量Avidin，加MES緩沖液溶解至8mg/ml。
c、混合將處理好的感光微?；鞈乙骸?mg/ml的Avidin以及MES緩沖液，以 2:5: 1的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。 d、反應(yīng)MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液1 25的體積比 加入，迅速混勻。37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時。e、封閉MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與 反應(yīng)液2 1 10的體積比加入上述溶液中，混勻，37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時。再加入200mg/ ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5 8，迅速混勻，37°C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小 時。f、清洗向反應(yīng)好的溶液中加入MES緩沖液，高速冷凍離心機離心，棄上清，加入 新鮮MES緩沖液超聲法重新懸浮，再次離心，如此清洗3次，最后用少量的感光試劑緩沖液 進(jìn)行懸浮，測定固含量，用感光試劑緩沖液調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。實施例4解離劑ANS的制備解離劑使用8-苯胺基-1-萘磺酸銨(ANS)溶于95%乙醇配制成10mg/mL濃縮液， 然后加入萬分之五的Proclin-300防腐儲存。本實施例中涉及的各個參數(shù)的檢測方法如下1、解離劑緩沖液的選取將8-苯胺基-1-萘磺酸銨(ANS)用Tris緩沖液、PBS緩沖液、雙蒸水分別配成 lmg/ml的濃度，比較選取最佳緩沖液。Tris 緩沖液:pH 8. 0,0. IM Tris+O. 3M NaCl+25mM EDTA+O. BSA+表面活性劑 + 防腐劑；PBS緩沖液pH7. 4，0. 02M PBS+1 % BSA+表面活性劑+防腐劑；以三種緩沖液配制的解離劑，檢測其靈敏度、37°C破壞7天穩(wěn)定性、線性。檢測結(jié) 果如下表解離劑緩沖液比較 根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，把以三種緩沖液配制的解離劑37°C破壞7d后，整體RLU 都有一定程度的下降，線性無明顯變化，但使用雙蒸水比Tris緩沖液及PBS緩沖液靈敏度 下降更小一些，因此選擇雙蒸水作為解離劑的緩沖液。2、解離劑工作濃度的選取將解離劑中的ANS用雙蒸水分別配成0. 5mg/ml、lmg/ml、l. 5mg/ml的濃度，比較選 取最佳工作濃度。使用三種不同濃度的ANS的解離劑，檢測其靈敏度、線性。檢測結(jié)果如下表解離劑工作濃度的選取 根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，解離劑中ANS工作濃度為lmg/ml時，其靈敏度、線性更佳。
3、解離劑加樣模式的選取將ANS分別加入試劑1與試劑2配制成lmg/ml的工作濃度，與試劑1+解離劑+ 試劑2的加樣模式進(jìn)行比較。 模式1 試劑1+ANS+試劑2 ；模式2 =ANS加入試劑1中；模式3 =ANS加入試劑2中；以三種加樣模式檢測其靈敏度、37°C破壞7天穩(wěn)定性、線性。檢測結(jié)果如下表 根據(jù)上表可知，ANS無論是加入試劑1中，還是加入試劑2中，37°C破壞7天后反 應(yīng)體系都會受極大影響，故選擇模式1。實施例5標(biāo)準(zhǔn)品的制備標(biāo)準(zhǔn)品使用衛(wèi)生部臨檢中心出品的四碘甲狀腺素定量參考品，以PBS為稀釋液， 按照濃度 Oug/dl, lug/dl，2. 4ug/dl，6. 5ug/dl，15ug/dl，32ug/dl 配制 6 個標(biāo)準(zhǔn)品。實施例6四碘甲狀腺素定量檢測然后向反應(yīng)孔中分別加入樣品，再依次加入發(fā)光試劑(T3包被的發(fā)光微粒)、解離 劑和生物素標(biāo)記抗T4抗體。然后放入儀器(光激化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動按以下 步驟操作振動，37°C溫育。再自動加入親和素包被的感光微粒后37°C再次溫育。溫育結(jié) 束后儀器自動產(chǎn)生激光照射微孔計算每孔發(fā)光光子量。按上述方法檢測各個定標(biāo)品的發(fā)光光子量，將測得的光信號值與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃 度采用cubic spline擬和作圖即得，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按樣本實測光信號 值計算每一個樣本的T4含量，單位是yg/dL。最后打印試驗報告。檢測條件的優(yōu)化試驗1、溫育時間的確定試驗材料采用抗體包被的150 μ g/ml的T3包被發(fā)光微粒試劑(下簡稱發(fā)光抗體試劑)和1 μ g/ml的生物素標(biāo)記抗體試劑，lmg/ml的解離劑ANS，及40 μ g/ml的親和素包 被的感光微粒試劑。檢驗樣本靈敏度參考品和質(zhì)控品QcL，QcH0 初始反應(yīng)條件加樣量為樣品25 μ 1，發(fā)光微粒試劑25 μ 1，解離劑25 μ 1，生物素 標(biāo)記抗體試劑25 μ 1，親和素包被的感光微粒試劑為175 μ 1，兩步溫浴。1. 1第一步溫育時間的確定第一步分別實驗溫育時間分別為10min、15min、20min、30min，第二步溫育時間為 15min,比較選取最適溫育時間。以四種不同溫育時間檢測其靈敏度、精密度、線性。檢測結(jié)果如下表第一步溫育時間的比較 根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，在其余條件相同的情況下，第一步溫育時間為20min結(jié) 果已經(jīng)趨于穩(wěn)定，延長第一步溫育時間已經(jīng)沒有實際意義，故將第一步溫育時間確定為 20mino1. 2第二步溫育時間的確定第一步溫育時間為20min，第二步分別實驗溫育時間分別為lOmin、15min、20min、 30min,比較選取最適溫育時間。以四種不同溫育時間檢測其靈敏度、精密度、線性。檢測結(jié)果如下表第二步溫育時間的比較 根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，在其余條件相同的情況下，第二步溫育時間為15min結(jié) 果已經(jīng)趨于穩(wěn)定，延長第二步溫育時間已經(jīng)沒有實際意義，故將第二步溫育時間確定為 15min。2、加樣模式的考察根據(jù)關(guān)于抗原_抗體反應(yīng)時間的文獻(xiàn)資料，并結(jié)合本方法的特點我們設(shè)計了兩種 加樣模式進(jìn)行考察。模式1 :25ul樣品+25ul發(fā)光抗體試劑+25ul解離劑+25ul生物素化抗體試劑 +175ul親和素包被的感光微粒；模式2 :15ul樣品+15ul發(fā)光抗體試劑+15ul解離劑+15ul生物素化抗體試劑 +60ul親和素包被的感光微粒。按照以上兩種加樣模式，分別考察靈敏度、精密度、線性。結(jié)果見下表加樣模式的比較 根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，模式1靈敏度、精密性皆好于模式2，故選擇模式1。3、生物素化抗體濃度的篩選試驗材料采用抗體包被的發(fā)光微粒試劑(下簡稱發(fā)光抗體試劑)和生物素標(biāo)記 抗體試劑，及親和素包被的感光微粒試劑檢驗樣本靈敏度參考品和質(zhì)控品QcL，QcH0初始反應(yīng)條件依次添加25 μ 1樣品、25 μ 1發(fā)光微粒試劑、25 μ 1解離劑ANS、 25 μ 1生物素標(biāo)記抗體試劑、175 μ 1親和素包被的感光微粒，兩步溫浴，其中第一溫浴時間 為20min，第二溫浴時間為15min。將生物素標(biāo)記抗T4抗體用Tris緩沖液分別配成0. 5 μ g/ml、1 μ g/ml、1. 5 μ g/ml 的濃度，比較選取最佳工作濃度。以三種不同濃度的生物素標(biāo)記抗T4的試劑2，檢測其靈敏度、線性。檢測結(jié)果如下 表生物素標(biāo)記抗T4工作濃度的選取 根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，試劑2中生物素標(biāo)記抗T4的工作濃度為Iy g/ml時，其 靈敏度、線性更佳。4、親和素包被的感光微粒的濃度的篩選發(fā)光抗體濃度選用150 μ g/ml，生物素化抗體的濃度選用1 μ g/ml，親和素包被的 感光微粒濃度分別配制為30 μ g/ml，40 μ g/ml，60 μ g/ml，在初始反應(yīng)條件下，結(jié)果如下 根據(jù)靈敏度比較，Qc L和Qc H的測定濃度，親和素包被的感光微粒濃度在40 μ g/ ml時結(jié)果最為理想。實施例7評價試驗試劑采用發(fā)光抗體試劑(150 μ g/ml)、生物素標(biāo)記抗體試劑(lyg/ml)、親和素 包被的感光微粒試劑(40 μ g/ml)及解離劑ANS(lmg/ml)。首先在反應(yīng)孔中加入25 μ 1樣品，再依次加入25 μ 1發(fā)光試劑、25 μ 1解離劑ANS 和25 μ 1生物素化抗體試劑。然后放入儀器，由儀器自動按以下步驟操作振動，37°C溫育 20分鐘，再自動加入親和素包被的感光微粒試劑175μ 1后37°C溫育15分鐘。儀器自動 產(chǎn)生激光照射微孔計算每孔發(fā)光光子量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以推算樣品T4濃度，單位是μ g/ dL，最后打印試驗報告。檢測具體步驟如下1、檢測范圍本試劑盒線性檢測范圍為1-32 μ g/dl，對其用雙對數(shù)模型擬合，劑量-反應(yīng)曲線 相關(guān)系數(shù)(r)的絕對值不低于0. 9900。如要準(zhǔn)確的測定樣品中T4濃度值，樣品中T4濃度值應(yīng)不超出l-32yg/dl校準(zhǔn)品曲線的濃度范圍，超出此范圍的測定結(jié)果是通過校準(zhǔn)品曲線 外延得出的計算結(jié)果。經(jīng)本試劑盒對大量的臨床樣本的檢驗結(jié)果可知道，大部分樣本結(jié)果 小于32μ g/dl，因此，本試劑盒設(shè)定的檢測范圍為1-32μ g/dl完全可滿足臨床應(yīng)用要求。2、靈敏度的檢測 檢測10孔校準(zhǔn)品0 μ g/dl，計算其RLU均值(AVE)和二個標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，以 AVE-2SD反代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的濃度值即為本試劑盒的分析靈敏度，經(jīng)檢測兩個批號的試 齊U，其分析靈敏度分別為0. 46ug/dL、0. 50ug/dL，均不高于1 μ g/dl。3、精密性檢測分別采用2個批號的T4試劑盒對質(zhì)控品QC L、QC H進(jìn)行1次檢測，每次復(fù)測10 孔，每份樣品共檢測20次。得到如下結(jié)果 由上述結(jié)果可知，本產(chǎn)品其批內(nèi)精密性小于5%，批間精密性小于10%。4、線性的檢測對除0值外其他5點校準(zhǔn)品用雙對數(shù)或其他數(shù)學(xué)模型擬合，劑量_反應(yīng)曲線相關(guān) 系數(shù)(r)的絕對值應(yīng)不低于0.9900。經(jīng)檢測兩個批號的試劑盒，其線性r值分別為1.000、 0. 999。5、干擾性試驗在已知濃度的臨床標(biāo)本1#、2#、3#中加入250mg/dL血紅蛋白、500mg/dL甘油三酯、 10mg/dL膽紅素，以本試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果如下表表1 試劑盒批號=2OO7Ol2I (單位μ g/dl) 表2試劑盒批號20070123 (單位μ g/dl) 由上述結(jié)果可知，500mg/dL甘油三酯和10mg/dL膽紅素對本產(chǎn)品無明顯干擾，但 250mg/dL血紅蛋白對本產(chǎn)品檢測結(jié)果影響超過10%，因此盡量避免樣本嚴(yán)重溶血。實施例8比較試驗試劑采用解離劑ANS(lmg/ml)、發(fā)光抗體試劑(150 μ g/ml)、生物素標(biāo)記抗體試 劑(ι μ g/ml)及親和素包被的感光微粒試劑(40 μ g/ml)。以西門子公司T4試劑盒為參照進(jìn)行了質(zhì)量水平比較，所用樣本為實施例5中的靈 敏度參考品，結(jié)果如圖4所示。由圖4所示的結(jié)果可知，本試劑盒檢測結(jié)果與西門子結(jié)果相關(guān)性r = 0. 937，且該 試劑盒成本底、靈敏度高、精密性好、檢測范圍寬、操作簡便、省時，適合于向臨床推廣實施例9試劑盒的組配將實施例1-4中按照各種方法制備的的三種試劑以及解離劑ANS分別獨立包裝， 組配后獲得基本試劑盒?？捎糜诙繖z測樣品中T4的濃度。
權(quán)利要求
一種四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，包括四碘甲狀腺素檢測微粒、生物素標(biāo)記的抗四碘甲狀腺素抗體和解離劑；其中四碘甲狀腺素檢測微粒為三碘甲腺原氨酸包被的發(fā)光微粒，解離劑為8-苯胺基-1-萘磺酸銨溶液、柳硫汞溶液、水楊酸鈉溶液或者三氯醋酸鈉溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述四碘甲狀腺素 檢測微粒中，發(fā)光微粒的粒徑范圍為100-400nm。
3.如權(quán)利要求2所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述發(fā)光微粒的粒 徑范圍為I50-300nm。
4.如權(quán)利要求1所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述四碘甲狀腺素 檢測微粒中，發(fā)光微粒的表面官能團選自羧基或醛基。
5.如權(quán)利要求1所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述四碘甲狀腺素 檢測微粒中，發(fā)光微粒的發(fā)光量為150，000-350，000光子數(shù)/100 μ g發(fā)光微粒。
6.如權(quán)利要求1權(quán)利要求所述四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述四碘甲 狀腺素檢測微粒中，發(fā)光微粒與三碘甲腺原氨酸的質(zhì)量比例為10 (0.01-0.05)。
7.如權(quán)利要求6所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述發(fā)光微粒與三 碘甲腺原氨酸的質(zhì)量比例為10 0.02。
8.如權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于， 所述四碘甲狀腺素檢測微粒由如下方法制得1)混合將發(fā)光微粒與三碘甲腺原氨酸混合于緩沖液中；2)反應(yīng)加入緩沖液配制的EDAC溶液混合并反應(yīng)；3)往步驟2)獲得的反應(yīng)液中加入緩沖液配制的BSA溶液混勻并反應(yīng)；4)清洗產(chǎn)物，獲得三碘甲腺原氨酸包被的發(fā)光微粒。
9.如權(quán)利要求8所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述緩沖液為MES緩 沖液或磷酸緩沖液。
10.如權(quán)利要求8所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述步驟a的混合 液中，發(fā)光微粒的濃度為10-40mg/ml。
11.如權(quán)利要求8所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述步驟d的清洗 的方式為離心法清洗。
12.如權(quán)利要求1所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素標(biāo)記的 抗四碘甲狀腺素抗體中，生物素與抗四碘甲狀腺素抗體的分子比例為(10-50) 1。
13.如權(quán)利要求12所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素標(biāo)記 的抗四碘甲狀腺素抗體中，生物素與抗四碘甲狀腺素抗體的分子比例為30 1。
14.如權(quán)利要求1所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述解離劑為8-苯 胺基-1-萘磺酸銨的水溶液。
15.如權(quán)利要求14所述的的三碘甲腺原氨酸的檢測試劑盒，其特征在于，所述8-苯胺 基-1-萘磺酸銨的水溶液中，8-苯胺基-1-萘磺酸銨的質(zhì)量體積濃度為0. 5-1. 5mg/ml。
16.如權(quán)利要求1-7或9-15中任一權(quán)利要求所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特 征在于，該試劑盒中還包括親和素包被的感光微粒。
17.如權(quán)利要求16所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質(zhì)量比例為1 (3-10)。
18.如權(quán)利要求17所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述親和素包被 的感光微粒中，親和素與感光微粒的質(zhì)量比例為1 5。
19.如權(quán)利要求16所述四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述四碘甲狀腺素 檢測微粒、生物素標(biāo)記的抗四碘甲狀腺素抗體、解離劑和親和素包被的感光微粒分別獨立 包裝，且三碘甲腺原氨酸包被的發(fā)光微粒、生物素標(biāo)記的抗四碘甲狀腺素抗體和親和素包 被的感光微粒均為混懸液。
20.如權(quán)利要求19所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述混懸液的溶 劑選自HEPES緩沖體系或Tris緩沖體系。
21.如權(quán)利要求20所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，四碘甲狀腺素檢 測微?；鞈乙旱娜軇閜H8. 0的成分為HEPES、NaCl和EDTA_Na-2H20的HEPES緩沖液。
22.如權(quán)利要求20所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，生物素標(biāo)記的抗 四碘甲狀腺素抗體混懸液的溶劑為PH8. 0的成分為Tris、NaCl和EDTA_Na-2H20的Tris緩 沖液。
23.如權(quán)利要求20所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，親和素包被的感 光微?；鞈乙旱娜軇槌煞譃镠EPES、NaCl和EDTA_Na-2H20的HEPES緩沖液。
24.如權(quán)利要求19所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述混懸液中還 包括蛋白保護(hù)劑、防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑或防腐劑中的一種或多種。
25.如權(quán)利要求24所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述蛋白保護(hù)劑 為BSA，防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑為Tween20，防腐劑為慶大霉素和Proclin 300。
26.如權(quán)利要求19所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還 包括多種濃度已知的四碘甲狀腺素溶液，不同濃度的四碘甲狀腺素溶液分別獨立包裝。
27.如權(quán)利要求1-26中任一權(quán)利要求所述四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，包 括下列步驟1)在反應(yīng)孔中加入樣品，再依次加入T3包被的發(fā)光微粒、解離劑和生物素標(biāo)記的抗T4 抗體，獲得初始反應(yīng)溶液，混合反應(yīng)；2)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應(yīng)溶液進(jìn)行反應(yīng)；3)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測量每個反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號值。
28.如權(quán)利要求27所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述 步驟3)的激發(fā)光光源波長范圍為600-700nm。
29.如權(quán)利要求28所述的四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述 激發(fā)光光源的功率范圍為5-lOOmw。
30.如權(quán)利要求29所述四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述激 發(fā)光光源波長范圍為640-680nm，激發(fā)光光源的功率范圍為40_60w。
31.如權(quán)利要求27所述四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步 驟2)和3)的反應(yīng)條件為37°C溫育10-30分鐘。
32.如權(quán)利要求31所述四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步 驟2)的反應(yīng)條件為37°C溫育20分鐘，步驟3)的反應(yīng)條件為37°C溫育15分鐘。
33.如權(quán)利要求27所述四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，混懸液中，四碘甲狀腺素檢測微粒的濃度為50-200μ g/ml，生物素標(biāo)記的抗四碘甲狀腺素抗體的 濃度為0. 5-1. 5 μ g/ml，親和素包被的感光微粒的濃度為10-100 μ g/ml。
34.如權(quán)利要求33所述四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，混懸液 中，四碘甲狀腺素檢測微粒的濃度為150 μ g/ml，生物素標(biāo)記的抗四碘甲狀腺素抗體的濃度 為1 μ g/ml，親和素包被的感光微粒的濃度為40 μ g/ml。
35.如權(quán)利要求27所述四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，初始反 應(yīng)溶液的體積為60-100 μ 1 ；最終反應(yīng)溶液的體積為120-275 μ 1。
36.如權(quán)利要求35所述四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，初始反 應(yīng)溶液的體積為100 μ 1，最終反應(yīng)溶液的體積為275 μ 1。
37.如權(quán)利要求27所述四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，還包括 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中四碘甲狀腺素的含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及甲狀腺疾病的輔助診斷試劑盒，公開了一種四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，包括四碘甲狀腺素檢測微粒、生物素標(biāo)記的抗四碘甲狀腺素抗體和解離劑；其中三碘甲腺原氨酸檢測微粒為二碘甲腺氨酸包被的發(fā)光微粒，解離劑為8-苯胺基-1-萘磺酸銨。本發(fā)明還公開了上述三碘甲腺原氨酸檢測試劑盒的使用方法。本發(fā)明的試劑盒，可以與其它血清和臨床信息聯(lián)合用于甲狀腺疾病的輔助診斷及相關(guān)病人治療效果的監(jiān)測。
文檔編號C09K11/02GK101865916SQ20091004930
公開日2010年10月20日 申請日期2009年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日
發(fā)明者王海蛟, 趙衛(wèi)國, 陳晨輝 申請人:博陽生物科技(上海)有限公司