專利名稱：以磁性微粒為固相載體檢測游離甲狀腺素的試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及臨床免疫檢測技術，尤其是涉及一種以磁性微粒為固相載體檢測游離 甲狀腺素的試劑盒，本發(fā)明還涉及該試劑盒的制備方法。
背景技術：
甲狀腺素(T4)是由甲狀腺濾泡上皮細胞合成和分泌的甲狀腺激素，其結構由一 個酪氨酸殘基和一個酚環(huán)組成，與三碘甲腺原氨酸(T3)的區(qū)別僅在于多一個碘原子。正常 人平均每日的T4分泌量為90士9 μ g，約為甲狀腺內貯存量的1%。T4進入血液循環(huán)后約 99. 96 %與結合蛋白結合，其中約60 %與TBG結合，30 %與TBPA結合，其余與白蛋白結合。 結合T4與游離T4之間呈可逆的平衡狀態(tài)。結合狀態(tài)的甲狀腺素不能發(fā)揮其生理功能，而 只有游離T4方能進入靶細胞與T4受體結合并發(fā)揮其生理功能。甲狀腺外T4的循環(huán)總量 為900 μ g，半衰期為7天。T4是具有生物活性的甲狀腺激素，能促進糖、脂肪、蛋白質代謝， 產生能量和熱，并促進生長發(fā)育。近年來有人認為T4是T3的前激素，是其儲備形式。血清 中總的T4稱為總T4 (TT4)，游離部分的T4稱為游離T4 (fT4)。由于fT4的測定不受血清結合蛋白含量的影響，因此是反映甲狀腺功能的靈敏指 標。檢測血清中呈游離狀態(tài)的甲狀腺素，最能直接反映甲狀腺功能狀態(tài)，并且不受血中甲狀 腺素結合球蛋白濃度和結合力改變及其它含碘雜質的影響，其敏感性和特異性均明顯超過 總T4。各種原因所致的甲低病例中，fT4均顯著低于正常范圍。但妊娠36周以后fT4呈 正常生理性降低；而亞急性甲狀腺炎和慢性淋巴性甲狀腺炎早期、甲狀腺素不敏感綜合癥 以及大量服用甲狀腺激素后fT4亦增高。非甲狀腺疾病在病情嚴重時總T4降低，但fT4不 降低。對孕婦等常合并有TBG變化的甲亢病人，fT4的測定尤為重要。臍帶血fT4的測定， 是早期診斷新生兒甲低的一個可靠性指標。甲狀腺素為小分子物質，免疫分析采用競爭法測定，在測定游離甲狀腺素時，酶標 記抗原會和待測物一樣與血清中的蛋白結合，使參與免疫反映的標記物減少，從而導致測 定結果錯誤。游離甲狀腺素的測定，關鍵在于盡可能避免標記物與蛋白的結合。酶聯免疫 分析法測定游離激素的主要方法有(1)包被抗T4抗體，標記T4抗原法，如上文所述酶標 記抗原會和待測物一樣與血清中的蛋白結合，特別是當血清中結合蛋白異常時，往往導致 測定結果的錯誤；(2)包被T4抗體，標記T4的抗原類似物(一般為T3)，雖然較方法(1) 有較大的進步，但仍然有其弊端，特別是在類似物結合蛋白濃度異常時，往往導致錯誤的結 果；(3)包被抗原類似物(T3)，標記抗T4抗體法，將抗原類似物連接在固相載體上，進一步 減少了與血清中結合蛋白的結合，降低了干擾，測定結果較方法(2)更為準確可靠。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用包被抗原類似物的衍生物的方法快速、靈敏、準確的以磁性微粒為固相載體檢測游離甲狀腺素的試劑盒，本發(fā)明還提供該試劑盒的制備方法。為實現上述目的，本發(fā)明可采取下述技術方案本發(fā)明所述的以磁性微粒為固相載體檢測游離甲狀腺素的試劑盒，包括偶聯有三 碘甲狀腺原氨酸-明膠復合物的磁微?；鞈乙?；游離甲狀腺素系列校準品；辣根過氧化物 酶標記的抗甲狀腺素抗體溶液；發(fā)光底物A液和B液和濃縮洗液。所述游離甲狀腺素系列校準品以去甲狀腺素血清或分析緩沖液為校準品基質，加 入甲狀腺素純品配制而成。所述抗甲狀腺素抗體為鼠抗甲狀腺素單克隆抗體。所述發(fā)光底物A液由Iuminol 0. 15mM、羥基香豆素0. 59mM、沒食子酸0. 35mM、pH 9. 4的Tris-Hcl緩沖液0. 2M組成；發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶0. 85mM、吐溫-200. 8% ν/ν、二乙烯三胺五乙酸0. 5mM、維生素C 0. 12mM、pH 6. 5的乙酸-乙酸鹽緩沖液0. 2M組成。所述濃縮洗液由0. IM磷酸鹽緩沖液和10Z0 Tween-20組成。本發(fā)明以磁性微粒為固相載體檢測游離甲狀腺素的試劑盒的制備方法，包括下述 步驟第一步，偶聯有三碘甲狀腺原氨酸-明膠復合物的磁微?；鞈乙旱闹苽?。三碘甲狀腺原氨酸-明膠復合物的制備將5mg三碘甲狀腺原氨酸溶于Iml 二甲 基甲酰胺中，加入2ml 45%的明膠溶液，震蕩混勻，然后加入1. 5mg碳二亞胺，隨后將0. 5ml 50mg/ml碳二亞胺溶液加入，反應于室溫振蕩條件下；在0. 05MPH7. 4磷酸鹽緩沖液中充分 透析，透析完畢加入等比例甘油，儲存于-20°C備用；偶聯有三碘甲狀腺原氨酸_明膠復合物的磁微?；鞈乙旱闹苽淙〈判晕⒘?，用 0.02M PH7. 6磷酸鹽緩沖溶液清洗；將濃度25%的戊二醛按體積比1 10溶解到含有上 述帶有磁性微粒的磷酸鹽緩沖溶液中，室溫振蕩反應后，用0. 02M PH7. 6磷酸鹽緩沖溶液 清洗，去除多余的戊二醛；按照IOOul 0. 02M PH7. 6磷酸鹽緩沖溶液/3mg磁微粒的比例加 入0. 02M PH7. 6磷酸鹽緩沖溶液，按照5-20ul/3mg磁微粒之比例加入上述三碘甲狀腺原氨 酸-明膠復合物，室溫振蕩反應；用PH7. 4-7. 6，含牛血清白蛋白(W/V)，0. 01%-0. 02% 的疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液洗滌3-5次，每次室溫振蕩5-15分鐘；用pH 7. 4-7. 6，含1 %牛血 清白蛋白(W/V) ,0.01%-0. 02%的疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液將甲狀腺素牛血清白蛋白衍生 物的磁微?；鞈乙合♂屩?. 5-lmg/ml的工作液；第二步，游離甲狀腺素系列校準品的制備用去甲狀腺素人血清稀釋甲狀腺素高值抗原溶液，配制標定后的系列濃度為 0pmol/L、5pmol/L、10pmol/L、25pmol/L、50pmol/L、100pmol/L ；第三步，辣根過氧化物酶標記的抗甲狀腺素抗體溶液的制備采用過碘酸鈉法將抗甲狀腺素抗體與辣根過氧化物酶共價偶聯在一起，制備成辣 根過氧化物酶標記的抗甲狀腺素抗體，使用時用緩沖液稀釋至工作濃度配制而成；第四步，發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液的配制發(fā)光底物A液由Iuminol 0. 15mM、羥基香豆素0. 59mM、沒食子酸0. 35mM、pH 9. 4 的Tris-Hcl緩沖液0. 2M配制而成；發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶0. 85mM、吐溫-200. 8% ν/ν、二乙烯三胺五乙酸0. 5mM、維生素C 0. 12mM、pH 6. 5的乙酸-乙酸鹽緩沖液0. 2M配制
5而成。第五步，濃縮洗液的制備濃縮洗液由0. IM磷酸鹽緩沖液和1 % Tween-20配制而成。本發(fā)明的優(yōu)點在于采用的磁微粒化學發(fā)光法結合了磁微粒固相偶聯技術，在酶聯 免疫分析的基礎上結合化學發(fā)光信號放大技術，是利用辣根過氧化物酶催化發(fā)光底物，則 發(fā)光底物發(fā)生化學反應并釋放出大量的能量，產生激發(fā)態(tài)中間體。這種激發(fā)態(tài)中間體，當其 回到穩(wěn)定的基態(tài)時，可同時發(fā)射出光子，利用發(fā)光信號測量儀器即可測量出光量子產額，該 光量子產額與樣品中的待測物質的量成比例關系，由此可以建立校準曲線并計算出樣品中 待測物質的含量。磁性微粒是由超順磁性納米粒子，包括磁性金屬如Fe、Co、Ni或其金屬 氧化物等，與高分子或無機材料等形成的一種膠態(tài)液體復合物，可通過表面的功能基團進 行各種表面的功能化修飾；在外加磁場的作用下通過吸附、清洗、解吸等操作快速移動和分 離，具有磁性分離簡便、親和吸附高特異性以及巨大表面積等優(yōu)點。本發(fā)明檢測試劑盒反應 時間僅需15分鐘，分析總耗時不超過30分鐘，方便快速，既適用于半自動大通量檢測，也適 用于全自動檢測系統使用。
具體實施例方式本發(fā)明所述的以磁性微粒為固相載體檢測游離甲狀腺素的試劑盒，包括偶聯有甲 狀腺素的類似物的衍生物的磁微?；鞈乙海龃盼⒘Ｉ吓悸撚腥饧谞钕僭彼醎明膠 復合物；以去甲狀腺素血清或分析緩沖液為校準品基質，加入甲狀腺素純品配制而成的游 離甲狀腺素系列校準品；辣根過氧化物酶標記的抗甲狀腺素抗體溶液，抗甲狀腺素抗體為 鼠抗甲狀腺素單克隆抗體；由Iuminol 0. 15mM、羥基香豆素0. 59mM、沒食子酸0. 35mM、pH 9. 4的Tris-Hcl緩沖液0. 2M組成的發(fā)光底物A液和由氨基酸氧化酶0. 85mM、吐溫-200. 8% ν/ν、二乙烯三胺五乙酸0. 5mM、維生素C 0. 12mM、pH 6. 5的乙酸-乙酸鹽緩沖液0. 2M組成 的發(fā)光底物B液；以及由0. IM磷酸鹽緩沖液，Tween-20組成的濃縮洗液。本發(fā)明以磁性微粒為固相載體檢測游離甲狀腺素的試劑盒的制備方法，包括下述 步驟第一步，偶聯有三碘甲狀腺原氨酸_明膠復合物的磁微?；鞈乙旱闹苽淙饧谞钕僭彼?明膠復合物的制備將5mg三碘甲狀腺原氨酸溶于Iml 二甲 基甲酰胺中，加入2ml 45%的明膠溶液，震蕩混勻，然后加入1. 5mg碳二亞胺，隨后將0. 5ml 50mg/ml碳二亞胺溶液(溶于0. 05M醋酸-醋酸鈉溶液)分3次加入，每次間隔1小時，最 后一次加入碳二亞胺溶液后繼續(xù)反應2小時；在0. 05M PH7. 4磷酸鹽緩沖液中充分透析，透 析完畢加入等比例甘油，儲存于-20°C備用；偶聯有三碘甲狀腺原氨酸_明膠復合物的磁微?；鞈乙旱闹苽淙〈判晕⒘?，用 0. 02M PH7. 6磷酸鹽緩沖溶液清洗3 5次；將濃度25%的戊二醛按體積比1 10溶解到 含有上述帶有磁性微粒的磷酸鹽緩沖溶液中，室溫振蕩反應15 60分鐘；用0. 02M PH7. 6 磷酸鹽緩沖溶液清洗兩次，去除多余的戊二醛；按照IOOul 0. 02MPH7. 6磷酸鹽緩沖溶液 /3mg磁微粒的比例加入0. 02M PH7. 6磷酸鹽緩沖溶液，按照5_20ul/3mg磁微粒之比例加 入上述三碘甲狀腺原氨酸-明膠復合物，室溫振蕩反應1 3小時；用pH7. 4-7. 6，含牛 血清白蛋白(W/V)，0. 01% -0. 02%的疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液洗滌3 5次，每次室溫振蕩5-15分鐘；用pH 7. 4-7. 6，含牛血清白蛋白(W/V)，0. 01 %-0. 02%的疊氮鈉的磷酸鹽 緩沖液將甲狀腺素牛血清白蛋白衍生物的磁微?；鞈乙合♂屩?. 5 lmg/ml的工作液；第二步，游離甲狀腺素系列校準品的制備用去甲狀腺素人血清稀釋甲狀腺素高值抗原溶液，配制標定后的系列濃度為 0pmol/L、5pmol/L、10pmol/L、25pmol/L、50pmol/L、100pmol/L ；第三步，辣根過氧化物酶標記的抗甲狀腺素抗體溶液的制備采用過碘酸鈉法將抗甲狀腺素抗體與辣根過氧化物酶共價偶聯在一起，制備成辣 根過氧化物酶標記的抗甲狀腺素抗體，使用時用緩沖液稀釋至工作濃度配制而成；具體方 法為稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于1. 2ml三蒸水中，加入新鮮配制的0. 05mol/L過 碘酸鈉溶液0. 5ml，室溫振蕩30分鐘；然后用醋酸-醋酸鈉緩沖液于4°C透析過夜，加入Img 鼠抗甲狀腺素單克隆抗體，室溫振蕩反應3小時；用4mg/ml的硼氫化鈉0. 2ml進行還原；經 0. 02mol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液透析過夜后，離心去除沉淀，上清液即為酶標記物，等比 例加入甘油，儲存于_20°C備用；辣根過氧化酶標記的抗甲狀腺素抗體工作溶液是用含
牛血清白蛋白的0.05M Tris-HCl緩沖液稀釋配制而成，稀釋比例為1 10000-1 20000 ；第四步，發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液的配制發(fā)光底物A液由Iuminol 0. 15mM、羥基香豆素0. 59mM、沒食子酸0. 35mM、pH 9. 4 的Tris-Hcl緩沖液0. 2M配制而成；發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶0. 85mM、吐溫-200. 8% ν/ν、二乙烯三胺五乙酸0. 5mM、維生素C 0. 12mM、pH 6. 5的乙酸-乙酸鹽緩沖液0. 2M配制 而成。第五步，濃縮洗液的制備濃縮洗液由0. IM磷酸鹽緩沖液和1 % Tween-20配制而成。本發(fā)明試劑盒的使用操作程序如下一、實驗準備1.取1瓶濃縮洗液按標簽上標識的稀釋要求稀釋備用。2.將恒溫箱或恒溫水浴鍋溫度調至37°C，待溫度穩(wěn)定后使用。3.將磁微?；鞈乙撼浞只靹蛑翢o肉眼可見沉淀。二、實驗操作1.取出一定量的反應容器，編號。前6孔依次加入50μ 1校準品，其余孔依次加入 50 μ 1樣本。2.搖勻磁微?；鞈乙海靠追謩e加入20 μ 1。3.每孔分別加入酶結合物100 μ 1。4.將反應容器內溶液混合均勻，37°C溫育15分鐘。5.使用磁分離及洗滌設備，將反應容器中磁微粒用洗液洗滌5次。6.將洗滌后的反應容器充分振蕩使磁微粒散開。7.每孔加入發(fā)光底物A和發(fā)光底物B各50 μ 1，混勻后避光室溫反應5分鐘。8.化學發(fā)光檢測儀檢測發(fā)光強度。三、本發(fā)明試劑盒在用于游離甲狀腺素測定時的性能指標可達到如下狀態(tài)分析靈敏度——最低檢出量低于2. 5pmol/L ；
7
校準曲線范圍——0-100pmol/L ；精密性一分析內精密度平均4. 40% (η = 10)，分析間精密度5. 58% (η = 3), 遠高于國家標準，表明本試劑盒在檢測實驗中具有良好的重復性；穩(wěn)定性一將試劑盒放置于37°C環(huán)境下考查加速穩(wěn)定性10天，試劑盒性能無明 顯改變。實驗表明，使用本試劑盒檢測游離甲狀腺素具有如下優(yōu)點1.檢測速度快，穩(wěn)定、無放射性污染等，在沒有磁場存在的情況下，磁性微粒懸浮 在液體中，使得抗原抗體反應類似于均相反應；磁性微粒在外加磁場的作用下可方便地分 離，洗滌快速。。2.磁性微粒做為免疫學載體，可明顯提高檢測的精密性、穩(wěn)定性。磁性微粒的粒徑 達到納米級，使得包被固相接近于液相狀態(tài)，相對微孔板式，減少了包被，封閉等多個影響 精密性的操作步驟，分析精密性和穩(wěn)定性得到極大的提升。3.本試劑盒組成簡單，操作方便，結果穩(wěn)定可靠，相對市面上的酶聯免疫試劑盒和 板式化學發(fā)光試劑盒，反應時間僅為其1/8-1/4的時間，但試劑性能和操作簡便性卻不輸 于這些試劑盒。
權利要求
一種以磁性微粒為固相載體檢測游離甲狀腺素的試劑盒，其特征在于它包括偶聯有三碘甲狀腺原氨酸 明膠復合物的磁微?；鞈乙?；游離甲狀腺素系列校準品；辣根過氧化物酶標記的抗甲狀腺素抗體溶液；發(fā)光底物A液和B液和濃縮洗液。
2.根據權利要求1所述的以磁性微粒為固相載體檢測游離甲狀腺素的試劑盒，其特征 在于所述游離甲狀腺素系列校準品以去甲狀腺素血清或分析緩沖液為校準品基質，加入 甲狀腺素純品配制而成。
3.根據權利要求1所述的以磁性微粒為固相載體檢測游離甲狀腺素的試劑盒，其特征 在于所述抗甲狀腺素抗體為鼠抗甲狀腺素單克隆抗體。
4.根據權利要求1所述的以磁性微粒為固相載體檢測游離甲狀腺素的試劑盒，其特征 在于所述發(fā)光底物A液由luminol 0. 15mM、羥基香豆素0. 59mM、沒食子酸0. 35mM、pH 9. 4 的Tris-Hcl緩沖液0. 2M組成；發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶0. 85mM、吐溫-200. 8% v/v、 二乙烯三胺五乙酸0. 5mM、維生素C 0. 12mM、pH 6. 5的乙酸-乙酸鹽緩沖液0. 2M組成。
5.根據權利要求1所述的以磁性微粒為固相載體檢測游離甲狀腺素的試劑盒，其特征 在于所述濃縮洗液由0. 1M磷酸鹽緩沖液和Tween-20組成。
6.根據權利要求1所述的以磁性微粒為固相載體檢測游離甲狀腺素的試劑盒的制備 方法，其特征在于包括下述步驟第一步，偶聯有三碘甲狀腺原氨酸_明膠復合物的磁微?；鞈乙旱闹苽淙饧谞钕僭彼?明膠復合物的制備將5mg三碘甲狀腺原氨酸溶于1ml 二甲基 甲酰胺中，加入2ml 45%的明膠溶液，震蕩混勻，然后加入1. 5mg碳二亞胺，隨后將0. 5ml 50mg/ml碳二亞胺溶液加入，反應于室溫振蕩條件下；在0. 05MPH7. 4磷酸鹽緩沖液中充分 透析，透析完畢加入等比例甘油，儲存于-20°C備用；偶聯有三碘甲狀腺原氨酸-明膠復合物的磁微?；鞈乙旱闹苽淙〈判晕⒘?，用0. 02M PH7. 6磷酸鹽緩沖溶液清洗；將濃度25%的戊二醛按體積比1 10溶解到含有上述帶有 磁性微粒的磷酸鹽緩沖溶液中，室溫振蕩反應后，用0. 02M PH7. 6磷酸鹽緩沖溶液清洗，去 除多余的戊二醛；按照lOOul 0. 02M PH7. 6磷酸鹽緩沖溶液/3mg磁微粒的比例加入0. 02M PH7. 6磷酸鹽緩沖溶液，按照5-20ul/3mg磁微粒之比例加入上述三碘甲狀腺原氨酸-明 膠復合物，室溫振蕩反應；用PH7. 4-7. 6，含牛血清白蛋白，0. 01% -0. 02%的疊氮鈉的 磷酸鹽緩沖液洗滌3-5次，每次室溫振蕩5-15分鐘；用pH 7. 4-7. 6，含牛血清白蛋白， 0. 01% -0. 02%的疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液將偶聯有三碘甲狀腺原氨酸-明膠復合物的磁微 ?；鞈乙合♂屩?. 5-lmg/ml的工作液；第二步，游離甲狀腺素系列校準品的制備用去甲狀腺素人血清稀釋甲狀腺素高值抗原溶液，配制標定后的系列濃度為Opmol/L、 5pmol/L、10pmol/L、25pmol/L、50pmol/L、100pmol/L ；第三步，辣根過氧化物酶標記的抗甲狀腺素抗體溶液的制備采用過碘酸鈉法將抗甲狀腺素抗體與辣根過氧化物酶共價偶聯在一起，制備成辣根過 氧化物酶標記的抗甲狀腺素抗體，使用時用緩沖液稀釋至工作濃度配制而成；第四步，發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液的配制發(fā)光底物A液由luminol 0. 15mM、羥基香豆素0. 59mM、沒食子酸0. 35mM、pH 9. 4的 Tris-Hcl緩沖液0. 2M配制而成；發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶0. 85mM、吐溫-200. 8% v/V、二乙烯三胺五乙酸0. 5mM、維生素C 0. 12mM、pH 6. 5的乙酸-乙酸鹽緩沖液0· 2M配制而成。 第五步，濃縮洗液的制備濃縮洗液由0. IM磷酸鹽緩沖液和Tween- 20配制而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以磁性微粒為固相載體檢測游離甲狀腺素的試劑盒，包括偶聯有三碘甲狀腺原氨酸-明膠復合物的磁微?；鞈乙海挥坞x甲狀腺素系列校準品；辣根過氧化物酶標記的抗甲狀腺素抗體溶液；發(fā)光底物A液和B液和濃縮洗液。本發(fā)明還公開了該試劑盒的制備方法。本發(fā)明的優(yōu)點在于采用磁微?；瘜W發(fā)光法結合了磁微粒固相偶聯技術，無磁場存在時，磁性微粒懸浮在液體中，抗原抗體反應類似于均相反應；磁性微粒在外加磁場的作用下方便分離，洗滌快速，做為免疫學載體，可提高檢測的精密性、穩(wěn)定性。本試劑盒組成簡單，操作方便，結果穩(wěn)定可靠，相對市面上的酶聯免疫試劑盒和板式化學發(fā)光試劑盒，反應時間僅為其1/8-1/4的時間。
文檔編號G01N33/535GK101949945SQ20101024306
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權日2010年8月3日
發(fā)明者付光宇, 吳學煒, 渠海, 苗擁軍, 陳曉玲, 靳增明, 項立紅, 馬建軍 申請人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司