本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及海島棉跨膜蛋白基因、引物及其應用。

背景技術：

棉花是重要的經(jīng)濟作物之一，棉纖維是主要的紡織工業(yè)原料。隨著可耕地面積的減少和環(huán)境的惡化，棉花生產(chǎn)受到多種生物和非生物因子的影響，尤其是枯、黃萎病的頻繁發(fā)生給我國棉花生產(chǎn)造成重大損失。通過傳統(tǒng)的育種方法已經(jīng)很難滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)需求，所以通過基因工程的方法來改良現(xiàn)有品種將是今后育種的主要方法。前人研究結果顯示，棉花黃萎病的抗性機制涉及到多種信號通路和物質(zhì)。在已經(jīng)獲得的研究結果表明，萜醛類化合物和苯丙素類化合物參與棉花對黃萎病的抗性過程。萜醛類化合物是植物體內(nèi)的一類抗毒素，植物受病菌侵染后，萜醛類化合物能夠快速遷移到受真菌感染并形成生殖芽的木質(zhì)部導管中，然后分散到這些薄壁組織的生殖芽，形成較強的抗病性(maceetal.，1978；tanetal.，2000；luoetal.，2001；xuetal.，2004)。研究表明當棉花發(fā)育過程中受到黃萎病菌侵染兩天后導管就完全堵塞，萜醛類化合物在18h內(nèi)就可以檢測到(memphisetal.，1990)。苯丙素類化合物一般具有苯酚結構，是酚性物質(zhì)，包括香豆素、木脂素和木質(zhì)素類、黃酮類等。naoumkina等(2010)結果表明植物體內(nèi)的苯丙素類化合物在抗病過程中起關鍵作用。在研究棉花對黃萎病的抗性過程中，也證明了苯丙素類化合物的作用(duberyandsmit，1997；pomaretal.，2004；gayosoetal.，2010)。xu等(2011)研究表明木質(zhì)素代謝在棉花對黃萎病的抗性過程中起關鍵作用，木質(zhì)素的合成會導致細胞壁加厚，提高棉花對黃萎病的抗性。

棉花對黃萎病的抗性機制涉及多種信號通路。已經(jīng)獲得的結果顯示，至少活性氧、水楊酸、茉莉酸、乙烯、油菜素內(nèi)酯，精胺和camalexin(johanssonetal.，2006；gaoetal.，2013；moetal.，2015，2016)等信號途徑參與棉花對黃萎病的抗性過程。這雖然與不同研究者使用的材料和研究方法不同有關系，但更重要的是因為棉花對黃萎病抗性機制的復雜性。為探究棉花對黃萎病的抗病機制，許多研究者克隆了大量與植物抗黃萎病相關的基因。其中番茄中的ve1基因是目前克隆的最著名的抗黃萎病基因(kawchuketal.，2001；fradinetal.，2011)，但是研究顯示該基因?qū)γ藁ǖ狞S萎病沒有抗性，這表明棉花對黃萎病的抗病機制與番茄存在較大差別(劉琳琳等，2014)。棉花中也克隆了一些ve相關基因，轉基因棉花對黃萎病表現(xiàn)出不同程度的抗性，但是其抗病機制的深入發(fā)掘還沒有相關報道(zhangetal.，2011；zhangetal.，2012)。除了ve基因，研究者還從棉花基因組中克隆了大量其它與抗黃萎病相關的基因，包括gbcad1、gbssi2(gaoetal.，2013)、gbrlk(zhaoetal.，2015)、gbstk(zhangeta1.，2013)、gbtlp1(munisetal.，2010)、gberf1-like(guoetal.，2016)、ghpao(moetal.，2015)、ghsamdc(moetal.，2016)和gbvdr5(yangetal.，2015)等。同時，部分研究者還證明一些外源基因也能提高棉花對黃萎病的抗性，如gafps(wangetal.，2015)、hpalxoo(miaoetal.，2010)、nad1(gasparetal.，2014)、p35(tianetal.，2010)、和hcm1(zhangetal.，2016)。上述研究還處于試驗階段，僅僅得到了對黃萎病有抗性的工程植株，但還沒有通過轉基因方法培育出抗性品種的報道，其在生產(chǎn)上的可利用性有待進一步深入探究。

本發(fā)明所克隆的是海島棉跨膜蛋白基因(gbtmem214)。在過去的十幾年內(nèi)，許多學者利用各種方法克隆了許多海島棉的抗病基因，通過轉基因驗證能夠提高陸地棉對黃萎病的抗性，部分屬于跨膜蛋白，如水稻抗白葉枯病基因xa21(songetal.，1995)，水稻抗稻瘟病基因pi-d2(chenetal.，2006)，擬南芥的fls2基因(robatzeketal.，2006)，番茄抗黃萎病基因ve1(fradinetal.，2011)等?？缒さ鞍资谴嬖谟谏锬ど系囊活愄厥獾鞍?，處于細胞與外界的交界部位，介導細胞與外界之間的信號傳導，感受植物病原信號、參與抗逆性反應，在生物體生命活動中不可或缺。在植物抗病過程中，跨膜蛋白的可以識別和接受病原信號物，激活胞內(nèi)反應，將胞外信號轉導到胞內(nèi)，誘導防御反應(maetal.，2005)?？缒さ鞍?transmembraneprotein，tmem)家族是人類功能基因組時代的主要研究對象，植物中還沒有相關報道。綜合動物tmem現(xiàn)有的功能相關的報道文章，發(fā)現(xiàn)其多與細胞間、細胞內(nèi)的信號傳導、免疫相關疾病以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等相關，并且對這類蛋白進行了分型以及蛋白家族的確立，如ms4a家族、anoctamin家族等(katohetal.，2004；christopheretal.，2006)。tmem參與多項生理過程，如構成質(zhì)膜的離子通道、活化信號轉導通路、介導細胞趨化、黏附、凋亡、自噬作用等。但對家族成員功能報道的文獻甚少，表明對其研究仍處于初級階段，也為該領域研究提供了廣泛空間(gregersenetal.，2014；leeetal.，2017)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一個海島棉跨膜蛋白基因gbtmem214，所述基因能顯著提高棉花對黃萎病抗性。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種擴增上述基因的引物對，利用其能夠大大提高棉花抗病育種的選擇效率及育種速度。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術方案：

一個海島棉跨膜蛋白基因gbtmem214，其dna分子是如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列或能夠與序列表中seqidno.1所示的dna序列雜交的核苷酸序列。所述海島棉跨膜蛋白基因gbtmem214來自于海島棉海7124，位于棉花染色體組的d4號染色體。

上述海島棉跨膜蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)，它是seqidno.2所示的氨基酸序列。

其中，序列中的seqidno.1由2315個堿基組成，自5’端第1位堿基為轉錄起始位點，至第2289位堿基為轉錄終止位點，完整編碼框為2289個堿基，編碼762個氨基酸，分子量為85kd，等電點為9.5。該蛋白具有1個duf2359結構域，5個lowcomplexity區(qū)域。

本發(fā)明還公開了用于擴增權利要求1所述的海島棉跨膜蛋白基因的引物對，也就是與上述海島棉跨膜蛋白基因連鎖的分子標記引物對，所述引物對的正向引物的序列如seqidno.3所示，反向引物的序列如seqidno.4所示。

以海島棉品種h7124的dna為模板，擴增獲得gbtmem214基因的基因組序列，然后提取海島棉品種h7124接菌后不同時期的根部組織rna，反轉錄獲得cdna為模板，使用f：atggttcacaatgagcagaag，r：tgaagtttatgagatggggaaga引物對，擴增獲得海島棉海7124的跨膜蛋白基因gbtmem214序列。

含有上述海島棉跨膜蛋白基因的分子標記引物對的試劑盒，也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的一個重要的目的就是提供一種海島棉跨膜蛋白基因、其表達載體或者宿主細胞在獲得具有抗黃萎病的轉基因植株中的應用。其中，最主要的作用是在棉花抗黃萎病育種過程中的作用。

本發(fā)明涉及的跨膜蛋白基因gbtmem214，受棉花黃萎病菌菌株bp2的誘導后表達量顯著升高，將gbtmem214基因沉默，海島棉海7124對棉花黃萎病菌株bp2的抗性顯著降低，構建gbtmem214基因的過表達載體，轉化擬南芥，轉基因擬南芥對黃萎病菌株bp2的抗性顯著提高?？梢岳帽景l(fā)明基因構建各種植物表達載體，可以提高黃萎病相關寄主植物的抗病性狀或利用本發(fā)明基因改良棉花對黃萎病的抗性。

含有上述基因的表達載體、重組載體、重組菌株或轉基因細胞系，都在本發(fā)明的保護范圍。

包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通過合適的表達體系在外源宿主中表達以提高黃萎病相關寄主植物的抗病性。

包含本發(fā)明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物學活性。

包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因可以在異源宿主中表達并通過dna芯片技術了解它們在宿主代謝鏈中的功能。

包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列編碼的蛋白以及可以合成在功能上與gbtmem214相同或類似的核苷酸序列和蛋白。

包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因可以通過遺傳重組來構建重組質(zhì)粒以獲得新型生物合成途徑，也可以通過插入、置換、缺失或失活進而獲得新型生物合成途徑。

包含本發(fā)明所提供的非核糖體肽合成酶可以通過缺失、插入或失活來自于相同或不同的非核糖體肽合成酶系統(tǒng)的一個或多個非核糖體肽合成酶結構域、模塊或基因而產(chǎn)生新的聚肽化合物。

包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用來構建非核糖體肽合成酶庫或非核糖體肽合成酶衍生庫或組合庫。

本基因還可用在基因工程、蛋白表達、酶催化反應等方面，也可用于尋找和發(fā)現(xiàn)用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物或基因以擴大gbtmem214基因的來源范圍，具有較高的應用前景。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明獲得gbtmem214基因是一個全新的能賦予植物對黃萎病抗性的基因，該基因在植物中的功能鮮有報道。在不同抗、感棉花品種中，該基因的編碼區(qū)和接菌后表達模式存在顯著差異，將gbtmem214基因構建過表達載體，導入擬南芥，轉基因擬南芥抗病性顯著提高。因此，gbtmem214基因的克隆可以豐富抗病基因資源，為棉花抗黃萎病育種提供有效的新工具。

(2)本發(fā)明獲得的gbtmem214基因可以進一步解析棉花抗黃萎病的分子機制。gbtmem214基因是否參與抗病相關的信號途徑，其上游和下游基因分別是什么，與其互作的蛋白是什么，所以通過對該基因做進一步研究，可以在理論上擴展棉花抗黃萎病機制的認識。

(3)本發(fā)明所提供的1對分子標記引物與本發(fā)明涉及的跨膜蛋白基因gbtmem214連鎖，利用其能夠提高海島棉gbtmem214基因向陸地棉轉育的效率和速度，能夠加快棉花抗病培育的進程。

附圖說明

圖1是本發(fā)明涉及的跨膜蛋白基因gbtmem214在不同棉種接種黃萎病菌后的表達模式。

圖2是利用vigs沉默海島棉中跨膜蛋白基因gbtmem214，海島棉對黃萎病的抗性顯著降低。a：注射空載體陰性對照ptrv2：00、陽性對照ptrv2-gbcla1和沒注射的棉花植株14天后的表型觀察；b：注射空載體陰性對照ptrv2：00和陽性對照ptrv2-gbcla1；c：注射ptrv2：00和ptrv2-gbtmem214棉花幼苗對黃萎病菌的抗性分析；d：rt-pcr驗證注射ptrv2：00和ptrv2-gbtmem214的棉花幼苗中gbtmem214基因的表達情況；e：接種黃萎病菌21天后棉花幼苗的病級指數(shù)統(tǒng)計；標準差計算為3次重復，每次20棵幼苗所得，**：p＜0.01。

圖3是構建跨膜蛋白基因gbtmem214的過表達載體，轉化擬南芥后代的分子檢測。a：轉基因擬南芥基因特異引物、nptii的pcr檢測；b：轉基因擬南芥目標基因表達分析；

圖4是跨膜蛋白基因gbtmem214擬南芥對黃萎病的抗性顯著提高。a：轉基因擬南芥抗病性鑒定；b：轉基因擬南芥接種黃萎病菌bp221天后病指。

圖5是本發(fā)明1對分子標記引物gbtmem214-f1/r1(seqidno.3和seqidno.4)在海島棉和陸地棉基因組中擴增結果；a：gbtmem214-f1/r1在海島棉和陸地棉基因組中擴增結果，箭頭所示為海島中擴增的目的條帶；b：gbtmem214-f2/r1在海島棉和陸地棉基因組中擴增結果作為對照。

具體實施方式

下面將通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。提供這些實施例是為了能夠更透徹地理解本發(fā)明，并且能夠?qū)⒈景l(fā)明的范圍完整的傳達給本領域的技術人員。

如在通篇說明書及權利要求當中所提及的“包含”或“包括”為一開放式用語，故應解釋成“包含但不限定于”。說明書后續(xù)描述為實施本發(fā)明的較佳實施方式，然所述描述乃以說明書的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護范圍當視所附權利要求所界定者為準。

1.試驗材料

本實驗所用的陸地棉蘇棉8號以及海島棉品種h7124由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院引進，多年嚴格自交繁殖保純。本發(fā)明所述的陸地棉導入系蘇研vr025是本研究室經(jīng)過多年選育的一個抗病材料(該材料在公開號為cn105713976a的發(fā)明專利，發(fā)明名稱為“能提高陸地棉黃萎病抗性的海島棉染色體片段及分子標記”中公開)，是一個以陸地棉蘇棉8號為背景，攜帶海島棉海7124染色體片段，經(jīng)過2年病圃及溫室抗病鑒定，其對黃萎病的抗性顯著高于陸地棉蘇棉8號。擬南芥品種為哥倫比亞型，易感黃萎病。本發(fā)明所使用的材料均能從市場上購買或者按照現(xiàn)有技術公開的方法獲得，本實驗所用方法如無特殊說明，都為常規(guī)方法。所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

2.試驗方法

2.1抗病相關qtl的定位及候選基因分析

利用分布在棉花26條染色體上的3100對ssr引物，對蘇棉8號和蘇vr025進行全基因組掃描，篩選到多態(tài)標記nau3392，nau3392，nau3791，cgr6409，jespr220，nau5294，nau7290。利用已經(jīng)公布的棉花d基因組序列和引物序列，將該導入片段錨定在d4染色體上。根據(jù)棉花二倍體d基因組雷蒙德氏棉的基因組數(shù)據(jù)庫，提取目標區(qū)段序列，開發(fā)ssr標記。ssrs信息挖掘通過ssrlocatori程序包來完成。ssrs的查找標準為：二核苷酸重復次數(shù)≥9；三核苷酸重復次數(shù)≥6；四核苷酸重復次數(shù)≥5；五核苷酸重復次數(shù)≥4；六核苷酸重復次數(shù)≥3；復合型的ssr整體長度不小于24bp。ssrs標記的引物通過primer3程序設計完成。引物設計的主要參數(shù)為：引物長度18-20bp，最佳為20bp；pcr產(chǎn)物長度100-280bp；tm值55-65℃，最適60℃；gc含量為45％-65％，最適50％。南京金思特生物技術有限公司完成所有引物的合成。

利用包含1100個單株的f2(蘇vr025×蘇棉8號)群體構建連鎖群，連鎖群包含49個標記，共覆蓋11.1cm。同時在溫室中對f2∶3接種非落葉性bp2黃萎病菌，利用復合區(qū)間作圖法定位抗病基因或抗病qtl?？共¤b定進行3次，在標記cgr6409-zhx30之間都檢測到qtl，平均解釋表型變異為16.38％，lod值在3.2-8.8之間(表1)。

表1利用復合區(qū)間作圖法(cim)在3次獨立重復實驗中檢測到的與抗黃萎病相關的qtl

根據(jù)棉花基因組測序結果，分析海島棉品種新海21和陸地棉品種tm-1的目標區(qū)段序列，對目標區(qū)段序列進行預測。棉花二倍體d基因組雷蒙德氏棉(g.raimondii)的基因組數(shù)據(jù)庫來源于http：//www.phytozome.net；棉花四倍體aadd基因組tm-1的基因組數(shù)據(jù)庫來源于http：//mascotton.njau.edu.cn，新海21的基因組數(shù)據(jù)庫來源于http：//www.chgc.sh.cn。利用blast2go，基于tblastx對基因進行注釋。

在標記cgr6409-zhx30區(qū)段中，海島棉品種新海21共包含36個基因。通過比對陸地棉tm-1和海島棉新海21目標區(qū)段基因，12個基因在tm-1和新海21中存在差異(表2)。其中6個基因?qū)儆诤u棉新海21特有的基因，基因注釋分別為chaperoneproteindnaj-related，refsrpp-likeproteinat1g67360，cytochromep45078a5-like，sodiumtransporterhtk1-like，sodiumtransporterhtk1-like和histoneh1。6個基因的orf長度存在差異，基因注釋分別為pre-mrna-splicingfactoratp-dependentrnahelicasedhx16，ranbp2nzfzincfinger-likesupeffamilyproteinisoformpartial，alpha-ketoglutarate-dependentdioxygenasealkb，duf493familyprotein，b-ziptranscriptionisoform2和gbtmem214。

2.2候選基因表達分析

為了檢測預測基因與黃萎病菌脅迫的相關性，本研究以蘇vr025、海7124和蘇棉8號棉花三葉期幼苗為材料，接種黃萎病菌bp2，處理時間為0h、24h、48h、96h和144h，同時，以水處理相同時期作為對照。取1μg總rna，按照takara反轉錄試劑盒說明書操作。合成第一鏈cdna。將反轉錄產(chǎn)物稀釋10倍后取1μl進行qrt-pcr。以1對專一性擴增真核生物組成型表達基因ef1α(genbank登錄號af120093)的引物進行平行pcr反應作為內(nèi)對照，其引物序列為f：agaccaccaagtactactgcac，r：ccaccaatcttgtacacatcc。實時熒光定量pcr利用abiprism7500型熒光定量pcr儀(abi，usa)操作，方法為sybrgreeni染料方法。反應體系為20μl，cdna，1μl；primerf(10μm)，1μl；primerr(10μm)，1μl；sybrgreenimix，10μl，補水至20μl。程序為：95℃，10min；95℃，10s，退火：58℃，20s；72℃，30s；40個cycles；72℃，10min，最后運行溶解程序。目的基因的相對表達量＝2^-δδδct，δδδct＝[(ct目的基因-ct內(nèi)參基因)指定時間的處理-(ct目的基因-ct內(nèi)參基因)0h]v.d-[(ct目的基因-ct內(nèi)參基因)指定時間的處理-(ct目的基因-ct內(nèi)參基因)0h]ck。根據(jù)前人報道，結合go分析結果，我們選擇7個基因進行定量qrt-pcr分析，分別是chaperoneproteindnaj-related，refsrpp-likeproteinatlg67360，cytochromep45078a5-like，histoneh1，ranbp2nzfzincfinger-likesuperfamilyproteinisoformpartial，b-ziptranscriptionisoform2和gbtmem214。其中gbtmem214基因使用的引物為f：ggtgctgctgttgtaactccc，r：tgaagtttatgagatggggaaga。結果顯示，6個基因能夠?qū)S萎病產(chǎn)生響應，其中b-ziptranscriptionisoform2和ranbp2nzfzincfinger-likesuperfamilyproteinisoform1在2個陸地棉中對黃萎病有響應；chaperoneproteindnai-related和histoneh1-like在蘇棉8號接種黃萎病菌表達量存在變化；在蘇vr025、海7124和蘇棉8號中都有上調(diào)的基因有2個，分別為cytochromep45078a5-like和gbtmem214，其中對于基因cytochromep45078a5-1ike，在3個棉種中表達模式相似，都在接菌后96h開始上調(diào)，在蘇vr025、海7124和蘇棉8號中分別上調(diào)3.6，2.6和7.7倍，隨后表達量迅速下降。對于gbtmem214，在蘇vr025和海7124中，接菌后24h即開始上調(diào)4.4和13.1倍，達到最大值，在48h迅速下降。在蘇棉8號中，該基因在接菌后144h才開始上調(diào)，且上調(diào)倍數(shù)只有2.3(圖1)。本研究結果表明，gbtmem214基因的表達模式在抗(蘇vr025和海7124)、感(蘇棉8號)品系中存在顯著差異，可能賦予蘇vr025對黃萎病的抗性。

表2tm-1和新海21在目標區(qū)段存在差異的基因信息

2.3gbtmem214基因的序列分析及亞細胞定位

根據(jù)gbtmem214基因的基因組序列，設計特異引物，以海島棉海7124的dna為模板，擴增獲得基因組序列。提取海島棉海7124接種黃萎病菌的根部rna，以反轉錄獲得的cdna為模板，擴增獲得海島棉海7124中的gbtmem214基因的開放讀碼框。結果顯示，gbtmem214基因在海島棉海7124基因組序列長度是7515bp?；虻膐rf長度為2289bp(seqidno.1)。通過對海島棉海7124中gbtmem214基因序列進一步分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼762個氨基酸(seqidno.2)，分子量為85kd，等電點為9.5。該蛋白具有1個duf2359結構域，5個lowcomplexity區(qū)域。

2.4gbtmem214基因抗病性分析

在本發(fā)明中，我們使用下述兩種方法分析gbtmem214基因?qū)γ藁S萎病的抗性。

一是利用病毒介導的基因沉默方法，驗證gbtmem214基因沉默后棉花對黃萎病的抗性。病毒介導的基因沉默所用到的載體分別是ptrv1和ptrv2，并且用棉花白化基因(ghcla1)作為對照(王心宇等，2014)。以gbtmem214基因的3’端設計引物，擴增415bp的片段并亞克隆至ptrv2載體上。挑取陽性的ptrv1、ptrv2(陰性對照)和ptrv2：cla1(陽性對照)以及含有gbtmem214基因的ptrv2質(zhì)粒農(nóng)桿菌gv3101單菌落，培養(yǎng)至菌液od600為0.5左右。4,000rpm室溫離心10分鐘收集菌體細胞，以適當體積的重懸液(10mmmgcl2，10mmmes以及200μm已酰丁香酮)重懸至終濃度為2.0，室溫下將重懸液置靜置3h，將trv1和trv2的恢復液，按體積比為1∶1比例混勻。待棉花幼苗兩片子葉完全展開后進行農(nóng)桿菌的接種實驗。采用葉片針筒注射法將菌液注射至子葉。分別利用ptrv1/ptrv2和ptrv1/ptrv2：cla1作為沉默處理的陰性對照和陽性對照。待注射trv：cla1的棉花幼苗出現(xiàn)白化表型時，檢測沉默gbtmem214基因的棉花體內(nèi)gbtmem214基因的表達情況，以棉花ef-1α作為內(nèi)參基因。同時，接種黃萎病菌，并調(diào)查沉默后棉花的抗病情況。結果顯示，接種黃萎病菌28天后，沉默gbtmem214基因后植株病情指數(shù)達到75.9(ptrv2：gbtmem214)，顯著高于空載體對照(ptrv2：00，21.7)和沒有注射的h7124(ck，20.3)(圖2)。

二是利用轉基因擬南芥驗證gbtmem214基因?qū)γ藁S萎病的抗性。構建gbtmem214基因的過表達載體，使用的植物表達載體為35s-pcambia2301-nors，設計攜帶xmai和saci酶切位點的引物，擴增回收目的片段，與pmd-19(sample)載體連接，轉化top10感受態(tài)，測序，獲得序列正確的陽性克隆，酶切攜帶目的基因的克隆載體和植物表達載體，分別回收2.3kb和13kb的目的片段，使用t4連接酶連接，轉化top10感受態(tài)，獲得陽性克隆，即為含有camv35s啟動子和目的基因gbtmem214片段的重組載體，命名為pcambia2301-35s-gbtmem214。利用凍融法將重組載體轉化農(nóng)桿菌gv3101，利用花浸染法轉化擬南芥，種子混收。消毒后，在包含濃度為50mg/l卡那霉素的ms培養(yǎng)基上篩選，獲得陽性植株移栽到營養(yǎng)基質(zhì)中生長。取葉片提取dna和rna，檢測目標基因是否成功轉入和表達。最終，通過pcr檢測，共獲得5株轉gbtmem214基因的株系(圖3)。連續(xù)自交2代，獲得純合株系，選擇3個株系(t1、t2和t7)進行抗黃萎病鑒定。結果顯示，接種黃萎病菌bp2后的21天，轉基因擬南芥株系t1、t2和t7的病指分別為21.5％、15.8％和12.8％，而非轉基因?qū)φ盏牟≈笧?5.9％(圖4)。以上結果表明gbtmem214基因能夠賦予受體植物對黃萎病的抗性。

本發(fā)明所用黃萎病菌為bp2，可以通過市場購買，也可以通過以下方法培養(yǎng)，其培養(yǎng)方法為：25℃下，將大麗輪枝菌bp2涂布于固體土豆培養(yǎng)基(馬鈴薯200g、瓊脂17g、蔗糖20g、蒸餾水1000ml)表面，兩周后轉移到液體土豆培養(yǎng)基(馬鈴薯200g、蔗糖20g、蒸餾水1000ml)中，室溫下振蕩培養(yǎng)5天，過濾培養(yǎng)的病菌溶液，利用血球計數(shù)板測病菌孢子濃度，將濃度稀釋至5×10⁷個孢子/ml。

本發(fā)明黃萎病發(fā)病級數(shù)調(diào)查按照以下標準進行，0級：植株健康，無病葉，生長正常；1級：植株四分之一以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；2級：植株四分之一以上，二分之一以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；3級：植株二分之一以上，四分之三以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；4級：植株四分之三以上葉片發(fā)病，或植株枯死。根據(jù)調(diào)查的結果計算各株系的病情指數(shù)(di)。

di＝[∑(ni×i)/(n×4)]×100；i＝0～4，ni＝plantnumberofreactioni

2.5標記開發(fā)

以海島棉海7124和陸地棉蘇棉8號基因組dna為模板，根據(jù)gbtmem214基因序列設計引物，分別為f：atggttcacaatgagcagaag，r：tgaagtttatgagatggggaaga。擴增獲得gbtmem214基因在海島棉海7124和陸地棉蘇棉8號中的基因組序列，比對后根據(jù)序列差異設計ssr引物，分別是gbtmem214-f1：atttgatcctttcaattttg(seqidno.3)，gbtmem214-r1：gagattaacatggtaaataac(seqidno.4)。隨后，利用12份棉花種質(zhì)對該引物進行驗證，12份棉花種質(zhì)包括3份海島棉，分別是海島棉海7124，新海21，pima90-53，9份陸地棉，分別是蘇棉8號，泗棉3號，tm-1，中植棉2號，泗抗1號、冀棉19，冀棉21，中棉18和中棉20。該引物可以在海島棉基因組中擴增到361bp片段，在陸地棉中沒有擴增目的條帶。因為本研究的條帶是‘有’和‘無’的差異，所以本發(fā)明以gbtmem214基因組序列的相同位置設計1對引物作為對照，排除dna質(zhì)量的影響。引物為gbtmem214-f2：caaatttgaaattagctaattg，gbtmem214-r1：tgaagtttatgagatggggaaga(圖5)。結果表明，利用gbtmem214-fl/r1可以有效區(qū)分海島棉和陸地棉中的gbtmem214基因，為海島棉中gbtmem214基因向陸地棉轉育提供一個有效的分子輔助選擇標記。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

sequencelisting

<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學院

<120>海島棉跨膜蛋白基因、引物及其應用

<130>2017

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