本發(fā)明涉及一種DNA分子遺傳標(biāo)記及其用途，特別是涉及一組小熊貓基因的微衛(wèi)星引物。
背景技術(shù)：
：小熊貓作為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，同時(shí)也被列在《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約附錄I》中，因此小熊貓的保護(hù)需要引起高度的重視。目前小熊貓生境破碎化，濫捕濫獵時(shí)有發(fā)生，并且棲息地有向高山退化的趨勢。小熊貓的研究和保護(hù)對(duì)于研究地球地質(zhì)演變和動(dòng)物系統(tǒng)進(jìn)化具有重要意義。目前對(duì)于小熊貓的研究已經(jīng)積累了大量的成果，國內(nèi)外科研工作者對(duì)小熊貓的研究主要集中在小熊貓的食性、行為、亞種分化、分布和疾病等方面，而在親子鑒定這一方面還未見到系統(tǒng)的研究。本研究應(yīng)用微衛(wèi)星DNA，屬于共顯性遺傳標(biāo)記，在人和動(dòng)物的研究中應(yīng)用廣發(fā)，目前在國內(nèi)外已經(jīng)是發(fā)展的較為成熟的一項(xiàng)分子生物學(xué)的技術(shù)。本研究旨在清楚的整理成都大熊貓繁育研究基地的圈養(yǎng)小熊貓種群的譜系關(guān)系，為了更準(zhǔn)確的進(jìn)行小熊貓譜系的分析，我們需要更多的微衛(wèi)星座位。本研究也通過微衛(wèi)星這一研究方法，對(duì)該小熊貓種群進(jìn)行了親權(quán)關(guān)系分析，從而構(gòu)建了該種群的譜系關(guān)系圖。微衛(wèi)星基因座位是廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記方法，微衛(wèi)星(SimpleSequenceRepeat,SSR)是在原核生物和真核生物基因組中廣泛存在的隨機(jī)短片斷重復(fù)序列,在編碼區(qū)和非編碼區(qū)均有分布,重復(fù)單位1～6個(gè)堿基不等,如(CA)n、(ACC)n等，重復(fù)次數(shù)一般在5-60bp之間，而且微衛(wèi)星的片段長度多居于100-400bp之間。微衛(wèi)星是目前使用最為廣泛的分子標(biāo)記之一，這是由于微衛(wèi)星的變化類型多，具有高度的多態(tài)性，這種多態(tài)性主要表現(xiàn)在重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)有差異，即微衛(wèi)星長度的差異。微衛(wèi)星技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于野生動(dòng)物遺傳多樣性的研究及其等位基因數(shù)目的估算中。研究顯示重復(fù)單位越短越容易產(chǎn)生滑鏈現(xiàn)象，也就是說兩堿基重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)較三堿基、四堿基或更多的堿基更容易滑鏈，因此選取三堿基重復(fù)、四堿基重復(fù)、五堿基重復(fù)和六堿基重復(fù)的合適序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。為了更準(zhǔn)確的進(jìn)行小熊貓譜系的分析，進(jìn)行親子鑒定，以及完善小熊貓譜系，我們需要更多的微衛(wèi)星座位。因此開發(fā)小熊貓微衛(wèi)星座位，將有助于小熊貓的保護(hù)，實(shí)現(xiàn)小熊貓種群的復(fù)壯最終達(dá)到再引入，意義深遠(yuǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一組小熊貓基因的微衛(wèi)星引物，該組微衛(wèi)星引物能擴(kuò)增出具有較高多態(tài)性且重復(fù)性好的核苷酸序列，該組微衛(wèi)星引物所擴(kuò)增核苷酸序列的堿基重復(fù)數(shù)為3-6個(gè)，能夠較好的克服因堿基重復(fù)數(shù)少，使微衛(wèi)星序列在PCR擴(kuò)增過程中出現(xiàn)的滑鏈現(xiàn)象；該組微衛(wèi)星引物穩(wěn)定性高，多態(tài)信息含量豐富，能夠通過該組引物進(jìn)行小熊貓遺傳多樣性的研究、對(duì)小熊貓種質(zhì)進(jìn)行評(píng)估及基因圖譜構(gòu)建，從而可以為小熊貓譜系管理提供鑒定手段和解決小熊貓種群管理混亂等問題。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一組小熊貓基因的微衛(wèi)星引物，能擴(kuò)增出具有較高多態(tài)性且重復(fù)性好的微衛(wèi)星序列，所述的微衛(wèi)星引物為：。該組引物是針對(duì)三堿基至六堿基重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物，能夠較好的避免引物在擴(kuò)增的時(shí)候出現(xiàn)滑鏈的現(xiàn)象，穩(wěn)定性高，具有良好的多態(tài)性，通過這組25對(duì)小熊貓微衛(wèi)星引物，獲得多態(tài)性含量較高，重復(fù)性好的小熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)，建立了這些標(biāo)記相應(yīng)的基因分型技術(shù)，并可實(shí)現(xiàn)小熊貓的親子鑒定。所述微衛(wèi)星引物的PCR反應(yīng)條件為：該組引物是針對(duì)三堿基至六堿基重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物，能夠較好的避免引物在擴(kuò)增的時(shí)候出現(xiàn)滑鏈的現(xiàn)象，穩(wěn)定性高，具有良好多態(tài)性，通過這組25對(duì)小熊貓微衛(wèi)星引物，獲得多態(tài)性含量較高，重復(fù)性好的小熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)，建立了這些標(biāo)記相應(yīng)的基因分型技術(shù)，并可實(shí)現(xiàn)小熊貓的親子鑒定。所述微衛(wèi)星位點(diǎn)核心序列的參數(shù)為：。該組引物是針對(duì)三堿基至六堿基重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物，能夠較好的避免引物在擴(kuò)增的時(shí)候出現(xiàn)滑鏈的現(xiàn)象，穩(wěn)定性高，具有良好的多態(tài)性，通過這組25對(duì)小熊貓微衛(wèi)星引物，獲得多態(tài)性含量較高，重復(fù)性好的小熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)，建立了這些標(biāo)記相應(yīng)的基因分型技術(shù)，并可實(shí)現(xiàn)小熊貓的親子鑒定。本發(fā)明中微衛(wèi)星引物獲得方法的進(jìn)一步闡述：(1)提取一只小熊貓的DNA；(2)用二代測序技術(shù)對(duì)該小熊貓的DNA進(jìn)行全基因組測序，獲得含有微衛(wèi)星重復(fù)位點(diǎn)的核苷酸序列；(3)在以上含有微衛(wèi)星重復(fù)位點(diǎn)的核苷酸序列中選取若干，通過軟件Primer5.0設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，得到微衛(wèi)星引物及對(duì)應(yīng)的引物指標(biāo)參數(shù)，并把多個(gè)引物構(gòu)建成小熊貓微衛(wèi)星引物數(shù)據(jù)庫；(4)對(duì)該微衛(wèi)星引物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選得到多態(tài)性高，重復(fù)性好的引物。提取小熊貓DNA提取方法和過程如下：用滅菌的剪刀于2ml的EP管中將大約500uL血凝塊剪碎；依次加入等體積的裂解緩沖液，所述裂解緩沖液中含TNE(1X)、20％體積的SDS(10％)和30uL的蛋白酶K(20mg/ml),混合均勻，置于水浴箱中振蕩，55℃消化過夜；溶液冷卻至室溫，加入等體積的Tris-飽和酚，在恒溫振蕩箱中振蕩8-12h，12000rpm離心10分鐘，將上清液移至另一離心管；加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)混合液，振蕩箱中振蕩2～3h后，取出12000r/min離心10min，取上清液；加入等體積的氯仿，上下顛倒數(shù)分鐘后，12000r/min離心10min，再次轉(zhuǎn)移上清液；加入2倍體積的冰乙醇，-20℃放置30min，12000r/min離心5min，棄上清；75％酒精洗滌沉淀2-3次，最后100％乙醇洗滌，于室溫下風(fēng)干DNA；加入適量的TE緩沖液溶解沉淀，儲(chǔ)存于4℃或-20℃?zhèn)溆?。用二代測序技術(shù)Roche454平臺(tái)，對(duì)小熊貓進(jìn)行基因組部分SSR標(biāo)記測序，得到大量含有微衛(wèi)星座位的DNA序列信息。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選，得到近8萬個(gè)微衛(wèi)星重復(fù)片段，其中4萬多為單堿基重復(fù)，3萬多二堿基重復(fù)序列，三堿基重復(fù)序列近4千條，四堿基重復(fù)序列5千多條，五堿基重復(fù)系列611條，六堿基重復(fù)序列87條。通過對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行軟件分析，進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選。這種篩選方法的優(yōu)點(diǎn)是，從基因組序列中尋找微衛(wèi)星位點(diǎn)，范圍廣，信息量大，能得到大量的微衛(wèi)星位點(diǎn)，同時(shí)節(jié)約大量的時(shí)間與成本。其次，該方法所獲得的微衛(wèi)星座位對(duì)于自身物種具有良好的適用性，能很好的分析該物種的遺傳多樣性，利于對(duì)于該物種展開大規(guī)模的研究。由于微衛(wèi)星多分布在基因組中的非編碼區(qū)域，突變率較高。除了小熊貓，對(duì)于很多物種來說，都可以采用該方法來找到自己的微衛(wèi)星座位。本發(fā)明在得到的8萬個(gè)微衛(wèi)星序列中選取了部分三堿基以上重復(fù)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了467對(duì)引物序列，其中三堿基56對(duì)，四堿基365對(duì)，五堿基34對(duì)，六堿基12對(duì)。從以上467對(duì)引物中篩選出穩(wěn)定且富有多態(tài)性的引物，通過小熊貓微衛(wèi)星引物，獲得多態(tài)性含量較高的小熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)，建立了這些標(biāo)記相應(yīng)的基因分型技術(shù)，并可實(shí)現(xiàn)小熊貓的親子鑒定。進(jìn)一步的所述中微衛(wèi)星引物的篩選的具體步驟為：步驟一，引物預(yù)處理：引物預(yù)處理：將裝有合成好的引物的EP管，加入適量的超純水配成濃度為50pmol/μL的混合體，混勻后，放于-30℃的冰箱，備用；步驟二，初步篩選能夠進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物：將隨機(jī)選取的1個(gè)小熊貓個(gè)體的DNA，作為模板，DNA濃度為50ng/μL，利用合成的微衛(wèi)星引物進(jìn)行PCR篩選；反應(yīng)體系為：在10uL體系中，DNA40ng，引物30pmol，10olmol為：1.0μL，25mMMg2+0.8-1.5μL，dNTP0.2μL(10mM)，Taq0.2μl(MBI)，加超純水至10μL；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；94℃變性15s,Tm值退火15s,72℃延伸30s,共10個(gè)循環(huán)；89℃變性15s,Tm值退火15s,72℃延伸30s,循環(huán)20次，最后72℃延伸30min,4℃保存，挑選出進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物；步驟三，用瓊脂糖電泳檢測步驟二中引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物：PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，從電泳圖片上判定PCR產(chǎn)物的大小以及引物的適用性；步驟四，對(duì)擴(kuò)增效果清楚的引物，分成兩組，分別加上熒光標(biāo)記6-FAM、HEX；步驟四，再次對(duì)熒光標(biāo)記后的引物進(jìn)行篩選；反應(yīng)體系為：在10uL體系中，DNA50ng，Taq聚合酶0.2μl，20μM引物0.2ul，25mMMg2+0.6/0.8ul，10mMdNTP0.2ul,1.0uL10×buffer；反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10min；94℃變性15s,Tm值退火15s,72℃延伸30s,共10個(gè)循環(huán)；89℃變性15s,Tm值退火15s,72℃延伸30s,循環(huán)20次，最后72℃延伸30min,4℃保存。步驟五，用瓊脂糖電泳檢測步驟四中引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物：PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，從電泳圖片上判定PCR產(chǎn)物的大小以及引物的適用性；步驟六，選用6只小熊貓個(gè)體，采用步驟五種篩選出來的微衛(wèi)星引物，按步驟四種的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物送公司進(jìn)行分型檢測，從分型圖上判定引物適用性。經(jīng)過篩選后的引物穩(wěn)定性高，具有多態(tài)性，通過篩選后的微衛(wèi)星引物，獲得多態(tài)性含量較高的小熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)，建立了這些標(biāo)記相應(yīng)的基因分型技術(shù)，并可實(shí)現(xiàn)小熊貓的親子鑒定及個(gè)體鑒定。綜上所述，本發(fā)明的有益效果是：(1)設(shè)計(jì)了25對(duì)小熊貓微衛(wèi)星引物，該組引物是針對(duì)三堿基至六堿基重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物，能夠較好的避免引物在擴(kuò)增的時(shí)候出現(xiàn)滑鏈的現(xiàn)象，穩(wěn)定性高，具有良好多態(tài)性，通過這組25對(duì)小熊貓微衛(wèi)星引物，獲得多態(tài)性含量較高的小熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)，建立了這些標(biāo)記相應(yīng)的基因分型技術(shù)，并可用于進(jìn)行小熊貓的親子鑒定及個(gè)體鑒定，便于小熊貓圈養(yǎng)種群的管理。(2)該25對(duì)小熊貓微衛(wèi)星引物，可用于分析小熊貓的遺傳多樣性、估計(jì)野外種群數(shù)目，及在小熊貓進(jìn)行分子進(jìn)化研究方面為其分類提出新的分子生物學(xué)依據(jù)，對(duì)于圈養(yǎng)小熊貓，還可以利用大量微衛(wèi)星研究結(jié)果來建立現(xiàn)代遺傳管理檔案、進(jìn)行親子鑒定、構(gòu)建清晰的遺傳學(xué)家譜，為小熊貓的保護(hù)做出相應(yīng)貢獻(xiàn)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不僅限于此。按照酚—氯仿抽提法進(jìn)行提取DNA,使用了25對(duì)微衛(wèi)星引物，見下表。反應(yīng)條件為：總體系為10uL，DNA50ng，1/1.5UTaq聚合酶0.2uL)，20μM引物0.2ul，0.6/0.8mMMg2+，0.2mMdNTPMIX,1.0uL10×buffer。反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性10min；94℃變性15s，Tm值15s,72℃延伸30s,共10個(gè)循環(huán)；89℃變性15s,Tm值15s,72℃延伸30s,共20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸30min,4℃保存。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次以上，以保證結(jié)果的一致性。微衛(wèi)星引物信息2014年用以上引物對(duì)成都大熊貓繁育研究基地現(xiàn)有種群(除建群者)共103只個(gè)體進(jìn)行親子關(guān)系鑒定(僅2012年-2014年生的60只小熊貓有親子關(guān)系記錄)。2012年-2014年生小熊貓親子鑒定結(jié)果該本發(fā)明的小熊貓微衛(wèi)星引物對(duì)成都大熊貓繁育研究基地的小熊貓進(jìn)行了親子鑒定，鑒定結(jié)果非常準(zhǔn)確，可以糾正現(xiàn)有譜系中存在的錯(cuò)誤。用以上引物對(duì)熊貓基地除建群者外的43只成年小熊貓及2012年-2014年生的60只小熊貓進(jìn)行了父母親鑒定，共獲得了99只個(gè)體的父/母親信息(其中成年個(gè)體39只)。用以上引物對(duì)成都大熊貓繁育研究基地的4只小熊貓個(gè)體(原來體內(nèi)的電子芯片失效，身份不清)進(jìn)行個(gè)體鑒定。個(gè)體編號(hào)鑒定吻合個(gè)體編號(hào)吻合比率A032100％B091100％C112100％D016100％用以上引物對(duì)成都大熊貓繁育研究基地注射電子芯片后又失效的4只小熊貓個(gè)體進(jìn)行個(gè)體鑒定，數(shù)據(jù)完全吻合，鑒定結(jié)果非常準(zhǔn)確，可以對(duì)小熊貓進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。SEQUENCELISTING<110>成都大熊貓繁育研究基地張亮沈富軍楊智張文平劉玉良侯蓉張志和<120>一組小熊貓基因的微衛(wèi)星引物<130>1<140>56<141>2016-04-21<160>50<170>PatentInversion3.3<210>1<211>16<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>1ttttcctcccataacc16<210>2<211>18<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>2tttgaatagggcaagata18<210>3<211>18<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>3ccaaaccaagattccctc18<210>4<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>4cttatgctctttctcctcct20<210>5<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>5ccaaatctccgaccatccaa20<210>6<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>6gctaacgagccatcgaccct20<210>7<211>23<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>7agtgtctgaaaaatggagatgaa23<210>8<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>8ttaccaggtccaagaagcac20<210>9<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>9tgattcaaggttccctatgt20<210>10<211>24<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>10aagaaagtggttagtttaaatgtt24<210>11<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>11ggggccttgtctaattctgt20<210>12<211>19<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>12tcactcctggtgctggtct19<210>13<211>24<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>13actctactatgattctgcctattt24<210>14<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>14tgaaggttatctcagggttt20<210>15<211>19<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>15tgagggcatttgatttacc19<210>16<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>16agagtgaactggaatgggag20<210>17<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>17gactcttggtttcagggttc20<210>18<211>23<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>18tctacactggaccatttttgata23<210>19<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>19tgcggtgtattcaggtaagc20<210>20<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>20tctttgaaccctcagccact20<210>21<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>21tccaaaataatggtaaagcc20<210>22<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>22caactcaactacatcgcctc20<210>23<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>23tccatgtaagcctccaaact20<210>24<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>24agaaccaaatgtctccacgt20<210>25<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>25aatgtcaaggaagaacccaa20<210>26<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>26ttcactgctcaccgtttcta20<210>27<211>21<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>27gaagggaggaaccatagtcag21<210>28<211>23<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>28ttgattgaggtgctgtagtgtta23<210>29<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>29gttccctgtagtttcatccc20<210>30<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>30tttgtttgccattgtattcc20<210>31<211>21<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>31ccaccatctgttagggagtag21<210>32<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>32ccttgatttgttggagcatt20<210>33<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>33aacctctgtcctcctccatc20<210>34<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>34gcacaatggtttaggctttt20<210>35<211>24<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>35tagggttcaagctcttacttagtc24<210>36<211>23<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>36agcaaactgttctaccacttctc23<210>37<211>18<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>37tgtttgtgcctggcttta18<210>38<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>38agtggtttatgggagaagtt20<210>39<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>39ttcatgtccttttggattgc20<210>40<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>40cctcttttacctctgcctcc20<210>41<211>18<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>41agggtctgagggcgtttc18<210>42<211>21<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>42tcttgactccaacctctttcg21<210>43<211>21<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>43ttcccaactttcttctctttc21<210>44<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>44aaccaacccagtgacatctt20<210>45<211>21<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>45agagtatctcggaaactgaaa21<210>46<211>18<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>46gcattagggcaaggattt18<210>47<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>47gctggctgattattcataga20<210>48<211>19<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>48tatggtgcttgaaatggaa19<210>49<211>20<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>49aagttgaaatgcccgagttg20<210>50<211>24<212>DNA<213>Ailurusfulgens<400>50ttgctggtagttgtagtaatggtg24當(dāng)前第1頁1 2 3