本發(fā)明涉及基因診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種kcnq1ot1基因、ahif基因及其引物的應(yīng)用以及用于診斷冠心病的試劑盒。

背景技術(shù)：

目前，心血管疾病(高血壓、冠心病、充血性心力衰竭、中風(fēng)等)仍然是人類(lèi)健康的頭號(hào)殺手。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界范圍內(nèi)每年有一千七百萬(wàn)人死于心血管疾病。雖然已有一些預(yù)防及初步治療心血管疾病的措施，但是從根本上預(yù)防和治愈心血管疾病仍然是醫(yī)學(xué)與生物學(xué)的重大難題。因此，尋找心血管疾病的標(biāo)志物并對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)已成為心血管疾病早期診斷和治療的緊迫任務(wù)。

大量的研究表明，非編碼核酸(non-codingrna)在心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到非常重要作用，是預(yù)防和治療的潛在靶點(diǎn)。非編碼核酸包括microrna和lncrna等，非編碼核酸的研究對(duì)于這些重大疾病具有非常重要的意義。非編碼核酸參與心臟和血管的發(fā)育，其異常表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、心力衰竭、心律失常、先天性心臟病及高血壓等疾病密切相關(guān)。非編碼核酸在各種心血管疾病中有特定的表達(dá)譜。

與常規(guī)的蛋白類(lèi)多糖類(lèi)標(biāo)記物診斷相比，用非編碼核酸進(jìn)行疾病診斷具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、診斷窗口期短(在發(fā)病潛伏期或早期即可做出診斷)，且可進(jìn)行定量檢測(cè)，既可用于診斷，又能進(jìn)行病情及療效評(píng)估等顯著優(yōu)點(diǎn)。但是，非編碼核酸在心臟疾病的診斷中的應(yīng)用尚有不足，仍然需要進(jìn)一步的探索和研究。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供kcnq1ot1基因的應(yīng)用，本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供kcnq1ot1基因的引物的應(yīng)用，本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供ahif基因的應(yīng)用，本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供ahif基因的引物的應(yīng)用，本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供用于診斷冠心病的試劑盒，以緩解現(xiàn)有技術(shù)中非編碼核酸在冠心病的診斷中研究不足的現(xiàn)狀。

本發(fā)明提供了kcnq1ot1基因在制備用于診斷冠心病的試劑盒中的應(yīng)用。

另外，本發(fā)明還提供了用于特異性檢測(cè)kcnq1ot1基因的引物在制備用于診斷冠心病的試劑盒中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述用于特異性檢測(cè)kcnq1ot1基因的引物為：

kcnq1ot1-f：5’-atagtagttggagacttca-3’(seqidno.2)；

kcnq1ot1-r：5’-actgtatattcaatgttggt-3’(seqidno.3)。

另外，本發(fā)明還提供了一種用于診斷冠心病的試劑盒，所述試劑盒包括kcnq1ot1基因的引物，所述kcnq1ot1基因的引物為：

kcnq1ot1-f：5’-atagtagttggagacttca-3’(seqidno.2)；

kcnq1ot1-r：5’-actgtatattcaatgttggt-3’(seqidno.3)。

另外，本發(fā)明還提供了ahif基因在制備用于診斷冠心病的試劑盒中的應(yīng)用，所述ahif基因具有如seqidno.4所示的序列。

另外，本發(fā)明還提供了用于特異性檢測(cè)ahif基因的引物在制備用于診斷冠心病的試劑盒中的應(yīng)用，所述ahif基因具有如seqidno.4所示的序列。

進(jìn)一步的，所述用于特異性檢測(cè)ahif基因的引物為：

ahif-f：5’-ggtctgccatctattactt-3’(seqidno.5)；

ahif-r：5’-tctcagcattatagtcacaa-3’(seqidno.6)。

另外，本發(fā)明還提供了一種用于診斷冠心病的試劑盒，所述試劑盒包括ahif基因的引物，所述ahif基因的引物為：

ahif-f：5’-ggtctgccatctattactt-3’(seqidno.5)；

ahif-r：5’-tctcagcattatagtcacaa-3’(seqidno.6)。

另外，本發(fā)明還提供了一種用于診斷冠心病的試劑盒，所述試劑盒包括kcnq1ot1基因的引物和ahif基因的引物，

所述kcnq1ot1基因的引物為：

kcnq1ot1-f：5’-atagtagttggagacttca-3’(seqidno.2)；

kcnq1ot1-r：5’-actgtatattcaatgttggt-3’(seqidno.3)；

所述ahif基因的引物為：

ahif-f：5’-ggtctgccatctattactt-3’(seqidno.5)；

ahif-r：5’-tctcagcattatagtcacaa-3’(seqidno.6)。

進(jìn)一步的，應(yīng)用所述kcnq1ot1基因的引物和所述ahif基因的引物，進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)條件為：模板變性條件為95℃，3分鐘，然后按每個(gè)循環(huán)95℃，5秒，55℃，35秒，共40個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)之后延伸時(shí)間為50秒，取出置于4℃保存。

使用本發(fā)明提供的kcnq1ot1基因和ahif基因進(jìn)行冠心病的診斷，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、診斷窗口期短的特點(diǎn)，在發(fā)病潛伏期或早期即可做出診斷，且可進(jìn)行快速有效的定量檢測(cè)，既可用于診斷，又能進(jìn)行病情及療效監(jiān)測(cè)。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為kcnq1ot1基因qpt-pcr定量分析圖；

圖2為ahif基因qpt-pcr定量分析圖；

圖3為kcnq1ot1基因在非cad的心臟疾病患者基因qpt-pcr定量分析圖；

圖4為ahif基因在非cad的心臟疾病患者基因qpt-pcr定量分析圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

盡管目前已有很多針對(duì)冠心病的研究，也發(fā)現(xiàn)了一些與冠心病相關(guān)的lncrna，但用于診斷的lncrna需要具有一定的特異性和靈敏性，因此，對(duì)于用于診斷冠心病的lncrna的相關(guān)研究，仍有不足。

發(fā)明人為解決上述技術(shù)問(wèn)題，提出了本發(fā)明的方案。

本發(fā)明涉及的kcnq1ot1基因在ncbi的version編號(hào)為nr_002728.3，kcnq1ot1基因的長(zhǎng)度為91671bp。鑒于kcnq1ot1基因序列過(guò)長(zhǎng)，在本申請(qǐng)中，截取了kcnq1ot1基因的部分片段作為代表，kcnq1ot1基因的部分片段如seqidno.1所示。

seqidno.1所示序列作為kcnq1ot1基因的代表，也具有kcnq1ot1基因在本申請(qǐng)中的作用。即，seqidno.1所示序列也能夠用于制備用于診斷冠心病的試劑盒；用于特異性檢測(cè)seqidno.1所示序列的引物，也能夠用于制備用于診斷冠心病的試劑盒。

本發(fā)明涉及的kcnq1ot1基因的引物，應(yīng)當(dāng)理解為能夠特異性檢測(cè)kcnq1ot1基因的所有引物，不僅包括能夠檢測(cè)kcnq1ot1基因全序列的引物，還包括能夠檢測(cè)kcnq1ot1基因部分片段的引物。其中，seqidno.2和seqidno.3所示的引物序列是檢測(cè)效果較好的kcnq1ot1基因的引物，而不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)kcnq1ot1基因的引物的限制。

本發(fā)明涉及的ahif基因的引物，應(yīng)當(dāng)理解為能夠特異性檢測(cè)ahif基因的所有引物，不僅包括能夠檢測(cè)ahif基因全序列的引物，還包括能夠檢測(cè)ahif基因部分片段的引物。其中，seqidno.5和seqidno.6所示的引物序列是檢測(cè)效果較好的ahif基因的引物，而不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)ahif基因的引物的限制。

本發(fā)明涉及的試劑盒，除了包括kcnq1ot1基因的引物，或者ahif基因的引物，或者kcnq1ot1基因的引物和ahif基因的引物之外，還可以包括用于qrt-pcr反應(yīng)的其他相關(guān)試劑；優(yōu)選的，還可以包括用于rna提取的相關(guān)試劑。

本發(fā)明涉及的cad(coronaryatheroscleroticheartdisease,cad)為冠心病。

除非另有說(shuō)明，以下實(shí)施例中涉及的操作方法為常規(guī)的方法，涉及的試劑為常規(guī)的市售試劑。

實(shí)施例1kcnq1ot1基因和ahif基因的篩選

1.初步篩選與冠心病密切相關(guān)的lncrna

廣泛查閱文獻(xiàn)及l(fā)ncrna相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，從中初步篩選出與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病密切相關(guān)的lncrna(至少篩選出30個(gè)關(guān)鍵性lncrna)。

2.初步鑒定lncrna與冠心病的相關(guān)性

收集臨床樣本及建立病例排除標(biāo)準(zhǔn)。選擇病例：接受冠脈造影的cad及對(duì)照組患者，病人的相關(guān)臨床資料完整。

根據(jù)篩選出的目的lncrna，實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)基因表達(dá)量范圍指標(biāo)：采用實(shí)時(shí)定量pcr方法在cad病人和對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)樣本里驗(yàn)證關(guān)鍵性lncrna顯著性表達(dá)差異及特征曲線(xiàn)(roc)和曲線(xiàn)下面積(auc)等方法來(lái)評(píng)估血漿中l(wèi)ncrna作為cad檢測(cè)的新型診斷工具的可行性。

3.驗(yàn)證關(guān)鍵的lncrna在冠心病中的準(zhǔn)確性及特異性診斷

收集cad及非cad心臟疾病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)樣本：抽取待檢測(cè)病人外周血5ml置于edta-抗凝管內(nèi)，利用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞。

樣本cdna模板獲得：將分離的人pbmc細(xì)胞以trizol方法提取rna，反轉(zhuǎn)錄合成cdna模板。

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)對(duì)照組與cad組pbmc中基因表達(dá)差異，以及cad與非cad心臟疾病患者pbmc中基因表達(dá)水平比較，從而驗(yàn)證關(guān)鍵的lncrna作為診斷cad的準(zhǔn)確性及特異性。

從中篩選出了2個(gè)關(guān)鍵性lncrna可特異性診斷出冠心病，分別為kcnq1ot1和ahif。

實(shí)施例2kcnq1ot1基因和ahif基因的引物確定

作為診斷用的引物探針必須具有結(jié)合和表達(dá)的特異性，穩(wěn)定存在性、實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)均可獲得一致結(jié)果。用引物探針對(duì)正常和病理樣本進(jìn)行rt-pcr，對(duì)比其表達(dá)變化情況(是否可以顯著判斷其表達(dá)差異)及其重復(fù)性(試驗(yàn)過(guò)程是否穩(wěn)定)，從而判斷其是否可以快速準(zhǔn)確的進(jìn)行診斷。綜上，本實(shí)施例選用探針的標(biāo)準(zhǔn)是：

(1)在相應(yīng)的對(duì)照組樣本中可以檢測(cè)到顯著的表達(dá)差異，便于清晰明了的分析。

(2)樣本間的表達(dá)差異經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)重復(fù)均呈現(xiàn)穩(wěn)定的數(shù)值，不出現(xiàn)大幅度變化，否則將影響診斷的精確度。

(3)探針本身的特異性好，在自身基因組中不存在錯(cuò)配。

(4)具有通用的退火溫度(55-60度)，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程，便于批量實(shí)驗(yàn)。

基于以上原則，本實(shí)施例確定了kcnq1ot1基因的引物，具體序列為：

kcnq1ot1-f：5’-atagtagttggagacttca-3’(seqidno.2)

kcnq1ot1-r：5’-actgtatattcaatgttggt-3’(seqidno.3)

以及ahif基因的引物，具體序列為：

ahif-f：5’-ggtctgccatctattactt-3’(seqidno.5)；

ahif-r：5’-tctcagcattatagtcacaa-3’(seqidno.6)。

實(shí)施例3診斷冠心病的試劑盒

本實(shí)施例提供的試劑盒包括kcnq1ot1基因的引物，具體序列為：

kcnq1ot1-f：5’-atagtagttggagacttca-3’(seqidno.2)

kcnq1ot1-r：5’-actgtatattcaatgttggt-3’(seqidno.3)

實(shí)施例4診斷冠心病的試劑盒

本實(shí)施例提供的試劑盒包括ahif基因的引物，具體序列為：

ahif-f：5’-ggtctgccatctattactt-3’(seqidno.5)；

ahif-r：5’-tctcagcattatagtcacaa-3’(seqidno.6)。

實(shí)施例5診斷冠心病的試劑盒

本實(shí)施例提供的試劑盒包括：kcnq1ot1基因的引物，和ahif基因的引物。

其中，kcnq1ot1基因的引物為：

kcnq1ot1-f：5’-atagtagttggagacttca-3’(seqidno.2)

kcnq1ot1-r：5’-actgtatattcaatgttggt-3’(seqidno.3)

ahif基因的引物為：

ahif-f：5’-ggtctgccatctattactt-3’(seqidno.5)；

ahif-r：5’-tctcagcattatagtcacaa-3’(seqidno.6)。

實(shí)施例6診斷冠心病的試劑盒的使用方法

本實(shí)施例提供了包括實(shí)施例2、3和4在內(nèi)的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

步驟(a)，待檢測(cè)病人外周血單個(gè)核細(xì)胞模板dna的提?。撼槿〈龣z測(cè)病人外周血5ml置于edta-抗凝管內(nèi)，利用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞。trizol方法提取rna，反轉(zhuǎn)錄合成cdna模板。

步驟(b)，聚合酶鏈反應(yīng)：

反應(yīng)體系：

反應(yīng)條件：模板變性條件為95℃，3分鐘，然后按每個(gè)循環(huán)95℃，5秒，55℃，35秒，共40個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)之后延伸時(shí)間為50秒，取出置于4℃保存。

另外，本發(fā)明還提供了應(yīng)用了以上實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)，以更充分的說(shuō)明本發(fā)明的效果，具體介紹如下。

應(yīng)用實(shí)施例5提供的試劑盒，以及實(shí)施例6提供的方法，對(duì)對(duì)照組和cad患者進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1為kcnq1ot1基因qpt-pcr定量分析圖，其中，對(duì)照組為正常對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中相對(duì)kcnq1ot1基因含量；cad為cad患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中相對(duì)kcnq1ot1基因含量。由圖1可以看出，cad患者外周血中kcnq1ot1基因的含量顯著低于對(duì)照組，因此，可以作為判斷病人是否患有冠心病的依據(jù)。

圖2為ahif基因qpt-pcr定量分析圖，其中，對(duì)照組為正常對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中相對(duì)ahif基因含量；cad為cad患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中相對(duì)ahif基因含量。由圖2可以看出，cad患者外周血中ahif基因的含量顯著高于對(duì)照組，因此，可以作為判斷病人是否患有冠心病的依據(jù)。

另外，還應(yīng)用實(shí)施例5提供的試劑盒，以及實(shí)施例6提供的方法，對(duì)非cad患者進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3為kcnq1ot1基因在非cad的心臟疾病患者基因qpt-pcr定量分析圖，其中，對(duì)照組為正常對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中相對(duì)kcnq1ot1基因含量；cad為cad患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中相對(duì)kcnq1ot1基因含量；瓣膜病組為瓣膜病(非cad的其他類(lèi)心臟疾病)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中相對(duì)kcnq1ot1基因含量。由圖3可以看出，cad患者外周血中kcnq1ot1基因的含量顯著低于對(duì)照組，但在瓣膜病患者外周血中kcnq1ot1基因的含量與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此，kcnq1ot1基因可作為判斷特異性檢測(cè)冠心病的依據(jù)。

圖4為ahif基因在非cad的心臟疾病患者基因qpt-pcr定量分析圖，其中，對(duì)照組為正常對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中相對(duì)ahif基因含量；cad為cad患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中相對(duì)kcnq1ot1基因含量；瓣膜病組為瓣膜病(非cad的其他類(lèi)心臟疾病)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中相對(duì)ahif基因含量。由圖4可以看出，cad患者外周血中ahif基因的含量顯著高于對(duì)照組，但在瓣膜病患者外周血中ahif基因的含量與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此，ahif基因可作為判斷特異性檢測(cè)冠心病的依據(jù)。

而且，kcnq1ot1基因和ahif基因的檢測(cè)結(jié)果相互結(jié)合，可進(jìn)一步提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

使用本發(fā)明提供的kcnq1ot1基因和ahif基因進(jìn)行冠心病的診斷，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、診斷窗口期短的特點(diǎn)，在發(fā)病潛伏期或早期即可做出診斷，且可進(jìn)行快速有效的定量檢測(cè)，既可用于診斷，又能進(jìn)行病情及療效監(jiān)測(cè)。本發(fā)明提供的診斷試劑盒，將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)冠心病診斷的行業(yè)空白。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。

sequencelisting

<110>青島大學(xué)

<120>kcnq1ot1基因、ahif基因及其引物的應(yīng)用以及用于診斷冠心病的試劑盒

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>5000

<212>dna

<213>人（homosapiens）

<400>1

agaaaaattttaaaaggaattctggagatatggaagttgtacatgcttgcaggagagatc60

agagaggtttcctgctatctacttatccttggctgactgtgagaccttttgcaagcagac120

agtaaaatacaggacagagttataaagtgcctgaactttgaatgtcccaacccacacata180

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actgcaggagaacacagactctgcagaatccatgcagagaaggcatacacaagcgagcaa420

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tctacgatatattatctaaagtaagtttttaacaaaaaaaatgagatatgcaaagaaaca540

gaaaattgtgacccttgaacaagaataatgagcaataaataggaattatctctgaagggc600

cccaaatgttagggcgcgatttcaaagtaagtattataactatgttcaaagaaccaaaag660

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tagagatagaaattagaaaccaaatagaaattctgtagttgtgaaatataataacttagg780

tgaaaaactcactagtgcggctaagcaaatttgacctggcagaagaaagaatcaatgaac840

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ggaccagttttgtggaagacaatttttccacagccagttgggggaggctttagttagatt1020

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