專利名稱：：Hla-a,b基因分型用pcr引物及其使用方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及核酸測序
技術(shù)領域：
，特別是PCR測序
技術(shù)領域：
。特別地，本發(fā)明提供了用于HLA-A，B(第二代測序法)基因分型的PCR引物。另一方面，本發(fā)明的方法涉及DNA序列的分型方法，特別是HLA基因高分辨率分型方法。
背景技術(shù)：
：人類白細胞抗原，S卩HLA(humanleukocyteantigen，HLA)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性最高的基因系統(tǒng)之一，它是調(diào)控人體特異性免疫應答和決定疾病易感性個體差異的主要基因系統(tǒng)，與同種異體器官移植的排斥反應密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，移植時，供受雙方的HLA相關基因匹配程度越高，分辨率越高，移植物的存活時間越長。目前國際標準的HLA基因分型技術(shù)包括PCR_SSP(序列特異引物聚合酶鏈式反應)，PCR-SSO(聚合酶鏈式反應寡核苷酸探針雜交)和PCR-SBT(聚合酶鏈式反應產(chǎn)物直接測序分型)。HLA-SSP的原理是設計出一整套等位基因組特異性引物，借助PCR技術(shù)獲得HLA型別特異的擴增產(chǎn)物，通過電泳分析決定HLA型別。HLA-SSO的原理是設計HLA型別特異的寡核苷酸序列作為探針，把PCR產(chǎn)物標記，以PCR產(chǎn)物(待檢測基因DNA)與探針雜交。通過檢測熒光信號判斷HLA型別。HLA-SSP和HLA-SSO的檢測信號均是模擬信號，分辨率只能到達中低水平且都不能檢測新的等位基因。HLA-SBT是一種通過對HLA基因的相關區(qū)域(HLA-A/B基因分型一般同時擴增2，3，4外顯子用于分型，其PCR產(chǎn)物長度都在Ikb以上)PCR擴增后的DNA產(chǎn)物直接進行Sanger法測序(毛細管微電泳)，測定核酸序列，從而判斷HLA基因型別的高分辨分型方法，其具有直觀、高分辨且能檢測新的等位基因的特點。HLA-SBT整個實驗流程復雜、通量低和實驗成本高等缺點使其很難應用于大規(guī)模HLA高分辨分型項目?；谝訧lluminaGA(IIlumina公司的GenomeAnalyzer測序儀)禾口Roche454(Roche公司)為代表的第二代測序法(以下簡稱新測序技術(shù))的HLA-SBT也是一種通過對PCR擴增后的DNA產(chǎn)物直接測定核酸序列，從而判斷HLA基因型別的高分辨分型方法，其除了原有直觀、高分辨且能檢測新等位基因的特點外，還具有單分子測序特點。其結(jié)合PCR-index/barcode技術(shù)，通過在PCR引物的5，末端添加引物標簽(primerindex)序列合成標簽引物，可在PCR過程中對每個樣本引入獨特的引物標簽，使樣本在利用第二代DNA測序技術(shù)檢測過程中，除PCR環(huán)節(jié)必須逐個樣本處理外，其它實驗環(huán)節(jié)可把多個樣本混在一起同時處理，最終每個樣本的檢測結(jié)果可以通過其獨特的引物標簽序列找回；使該方法具有成本低，通量大和可同時檢測大量樣本的多個不同基因位點的特點。但與第一代測序技術(shù)(以Sanger法測序原理為基礎的測序技術(shù))相比，能用于新測序技術(shù)測序文庫制備的DNA長度不能太長(IlliminaGA的最大適用長度為700bp)，再加上新測序技術(shù)讀長普遍偏短，當前IlluminaGA雙向讀長只能達到200bp，原用于HLA-SBT方法的PCR引物不再適用。結(jié)合HLA新測序技術(shù)的特點，PCR產(chǎn)物的長度不宜超過700bp。
發(fā)明內(nèi)容鑒于現(xiàn)有新測序技術(shù)對DNA模板長度的要求和新測序技術(shù)讀長偏短的事實，原用于HLA-SBT方法的PCR引物不再適用以新測序技術(shù)為基礎的HLA高分辨分型方法。本發(fā)明設計了一套全新的分別單獨擴增HLA-A，B基因的2，3，4號外顯子的特異性和保守性良好的PCR引物，且PCR產(chǎn)物長度不大于700bp，特別適用于IlluminaGA(當前IlluminaGA適用的最大DNA長度為700bp)。本發(fā)明所提供的一套PCR引物可用于對受試者(特別是人)進行大規(guī)模、高通量和低成本的HLA基因分型。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，從IMGT/HLA因特網(wǎng)站點(http//www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)下載所有最新HLA-A/B基因序列，然后保存到本地磁盤中做為HLA-A數(shù)據(jù)集；同時下載所有最新非HLA-A的HLA-I類基因序列做為比較數(shù)據(jù)集。將兩數(shù)據(jù)集進行比較，在2，3，4號外顯子兩端和內(nèi)部尋找各基因位點保守和特異序列，并將設計的PCR引物序列與人類全基因組序列進行同源性比較。由于HLA-A/B基因與同屬于HLA-I類分子的其它基因具有很高的序列相似性，在設計PCR引物時盡量保證引物3’末端特異，確保引物擴增HLA-A/B基因的特異性。同時使PCR產(chǎn)物的長度小于700bp，且正反引物的退火溫度基本保持一致。將滿足設計要求的多對候選HLA-A/B引物用于擴增少數(shù)具有HLA-A/B常見血清型的模板DNA，從中篩選出保守性和特異性最好的，分別用于擴增2，3，4號外顯子的6對HLA-A/B的PCR引物。用篩選出的6對PCR引物為基礎引物，并以此設計95套標簽引物分別擴增95個具有HLA-A/B常見血清型的DNA模板(該部分模板的HLA型別包括所有常見HLA-A/B的血清型)。所有PCR產(chǎn)物等量混合后用IlluminaGAPair-End100測序，組裝后的測序結(jié)果通過分型與原分型結(jié)果比較來驗證PCR引物的保守性和特異性。本發(fā)明設計的HLA-A，B位點引物，即分別用于擴增2，3，4號外顯子的6對HLA-A/B的PCR引物見表1。表1HLA-A，B位點PCR引物本發(fā)明一方面提供了一套用于HLA_A，B基因分型的PCR引物，其特征在于所述PCR引物如表1所示。本發(fā)明另一方面提供了表1所示的PCR引物的用于測序的方法，其包括提供樣品，特別是是血樣，所述血樣優(yōu)選地來自哺乳動物，特別是人；擴增使用所述PCR引物用于擴增血樣來源的DNA從而得到PCR產(chǎn)物，并對PCR產(chǎn)物進行純化；測序?qū)λ鯬CR產(chǎn)物進行測序，測序方法可以是Sanger測序法，或者可以是第二代測序法(例如HiSeq2000、IlluminaGA和Roche454)本發(fā)明另一方面提供了表1所示的PCR引物用于HLA基因分型的用途，其特征在于使用上述的PCR引物，根據(jù)上述方法得到的測序結(jié)果進行組裝和比對分析，并將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的標準序列進行比較，得到HLA基因分型結(jié)果。另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于進行HLA基因分型的試劑盒，所述試劑盒中包括本發(fā)明的PCR引物。本發(fā)明另一方面中，提供了一種HLA分型的方法，其包括1)提供η個樣品，η為大于等于1的整數(shù)，所述樣品優(yōu)選地來自哺乳動物，更優(yōu)選是人，特別是人的血樣；2)將待分析的η個樣品分成m個小組，m為整數(shù)且η彡m彡1；3)擴增對于每一個樣品，使用一對標簽引物，在存在來自該樣品的模板時，在適于擴增目的核酸的條件下進行PCR擴增，其中，每一對標簽引物由包含引物標簽的正向標簽引物和反向標簽引物(均可以是簡并引物)構(gòu)成，其中正向標簽引物和反向標簽引物所包含的引物標簽可以相同或者不同；不同樣品所用標簽引物對中的引物標簽彼此不同；4)混合將各樣品的PCR擴增產(chǎn)物混合在一起，獲得PCR產(chǎn)物文庫；5)打斷將所得的PCR產(chǎn)物文庫進行不完全打斷；6)建庫結(jié)合文庫接頭標簽技術(shù)，將打斷后的PCR產(chǎn)物文庫構(gòu)建PCR-Free測序文庫，回收位于所用測序儀最大讀長長度到所用測序儀適用的最長DNA長度范圍之間的所有DNA條帶，可以對文庫添加不同的文庫接頭(adapter)以區(qū)分不同的PCR-Free測序文庫；7)測序?qū)⒒厥盏腄NA混合物利用二代測序技術(shù)，優(yōu)選的是Pair-End技術(shù)(例如IlluminaGA)進行測序，獲得打斷后的DNA的序列；8)拼接基于各個文庫不同的文庫接頭序列和每個樣品獨特的引物標簽將獲得的測序結(jié)果與樣品一一對應，利用比對程序(例如Blast，BWA程序)把各個測序序列定位到PCR產(chǎn)物的相應DNA參考序列上，通過序列重疊和連鎖關系，從打斷后的DNA的序列拼接出完整的目的核酸。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，在上文所述的方法中，所述結(jié)合文庫接頭標簽技術(shù)，將打斷后的PCR產(chǎn)物文庫構(gòu)建PCR-Free測序文庫是指使用m種文庫接頭給4)中得到的m個PCR產(chǎn)物文庫加上接頭，其中每一個PCR產(chǎn)物文庫使用一種不同的文庫接頭，從而構(gòu)建m個接頭標簽測序文庫；將m個接頭標簽測序文庫等摩爾混合在一起構(gòu)建混合接頭標簽測序文庫。其中連接文庫接頭的方法是指不通過PCR程序直接采用DNA連接酶進行連接。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，在上文所述的方法中，每一對引物標簽與PCR引物對組合成一對標簽引物，正反PCR引物的5’端分別具有(或者任選通過連接序列連接)正向引物標簽和反向引物標簽。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，在上文所述的方法中，所述PCR引物是用于擴增HLA的特定基因的PCR引物，優(yōu)選是用于擴增HLA-A/B2，3,4號外顯子和HLA-DRB12號外顯子的PCR引物，優(yōu)選的所述PCR引物如表3所示。本發(fā)明所提供的一套用于HLA基因分型的PCR引物，其中1)6對PCR引物擴增HLA-A、B兩位點2，3,4號外顯子的序列，PCR產(chǎn)物長度均在700bp以內(nèi)。2)引物保守性良好和特異性良好。圖1為1號樣本HLA-A/B/DRB1相應外顯子PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，從電泳圖上看，PCR產(chǎn)物為一系列片段大小300bp-500bp的單一條帶，其中泳道M是分子量標記物(DL2000,Takara公司)，泳道1-7為1號樣本的HLA-A/B/DRB1各外顯子(A2、A3、A4、B2、B3、B4、DRB1-2)PCR擴增產(chǎn)物，陰性對照(N)無擴增條帶。其它樣品的結(jié)果與此類似。圖2為HLA-Mix打斷后DNA電泳情況(割膠前后)，割膠區(qū)域為450_750bp區(qū)域。其中泳道M是分子量標記物(NEB-50bpDNALadder)，泳道1是割膠前HLA-Mix的電泳情況，泳道2是割膠后HLA-Mix的膠圖。圖31號樣本一致性(consensus)序列構(gòu)建程序截圖，示例說明了根據(jù)引物標簽和DNA片段之間的重疊關系拼接出PCR產(chǎn)物的完整序列。關于HLA分型命名的查詢可見于http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/align.html。從左側(cè)結(jié)果輸出欄里面我們看到了A*02:03:01A女11:01:01的所有編碼序列的結(jié)果，其中2號外顯子的序列與1號模板原已知結(jié)果相同。具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明的實施例中，采用本發(fā)明的PCR引物和HLA-DRB12號外顯子的PCR引物，對95例已知HLA常見基因型別的血樣進行HLA-A/B/DRB1位點PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)IlluminaGAPair-EndlOO測序，測序結(jié)果經(jīng)過組裝和比對分析得到樣品的分型結(jié)果。6實施例1樣本提取使用KingFisher自動提取儀(美國Thermo公司)從95份已知HLA-SBT分型結(jié)果的血樣(中國造血干細胞捐獻者資料庫(以下稱“中華骨髓庫”))中提取DNA。主要步驟如下取出6個Kingfisher自動提取儀配套的深孔板及1個淺孔板，根據(jù)說明書分別加入一定量配套的試劑并做好標記，將所有已加好試劑的孔板按要求置于相應的位置，選定程序“Bioeasy_200ulBloodDNA_KF.msz”程序，按下“star”執(zhí)行該程序進行核酸提取。程序結(jié)束后收集plateElution中的IOOul左右的洗脫產(chǎn)物即為提取的DNA。實施例2通過合成在5’末端具有不同引物標簽的PCR引物制作不同的PCR標簽引物，這樣不同的PCR標簽引物可以用于不同的樣本，所述PCR引物是針對HLA-A/B的2，3，4號外顯子以及HLA-DRB12號外顯子的PCR引物。其后通過PCR反應在PCR產(chǎn)物兩端引入引物標簽，從而特異地標記了來自不同樣本的PCR產(chǎn)物。以95套PCR標簽引物來分別擴增95份DNA樣本，每套PCR標簽引物由一對雙向弓I物標簽(表2)和用于擴增HLA-A/B的2，3，4號外顯子以及HLA-DRB12號外顯子的PCR引物(表3)組成，其中每個正向PCR引物的5’末端上連接一對引物標簽的正向引物標簽，而反向PCR引物的5’末端上連接一對引物標簽的反向引物標簽。引物標簽在引物合成時直接添加在PCR引物的5’末端。把實施例1的樣本提取步驟中所得的95份DNA，依次編號1_95，PCR反應在96孔板中進行，共7板，編號分別為HLA-P-A2、HLA-P-A3、HLA-P-A4、HLA-P-B2、HLA-P-B3、HLA-P-B4以及HLA-P-DRBl-2(A2/3/4、B2/B3/B4、DRB1-2表示擴增的位點)，板內(nèi)設置一個不添加模板的陰性對照，陰性對照所用引物與模板1的對應引物相同。實驗的同時，記錄下每對引物標簽對應的樣本編號信息。表2，引物標簽的相關信息表3，未添加引物標簽前用于擴增HLA-A/B/DRB1相應外顯子的PCR引物引物編號引物序列引物用途產(chǎn)物長度A-F2CCTCTGYGGGGAGAAGCAA擴HLA-A基因2號外顯子480bpA-R2ATCTCGGACCCGGAGACTGA-F3CGGGGCCAGGTTCTCACAC擴HLA-A基因3號外顯子410bpA-R3GGYGATATTCTAGTGTTGGTCCCAAD2-F1,D2-F2,D2-F3，D2-F4，D2-F5，D2-F6，D2-F7為擴增HLA-DRB12號外顯子的正向引物，D2-R為擴增HLA-DRB12號外顯子的反向引物。HLA-A/B/DRB1的PCR程序如下96"C2min95°C30s—60°C30s—72°C20s(32cycles)15°C⑴HLA-A/B的PCR反應體系如下HLA-DRBl的PCR反應體系如下其中PInf-A/B/D2-F1/2/3/4/5/6/7表示引物5’末端帶有第η號正向引物標簽序列(表1)的HLA-A/B/DRB1的F引物，PInf-A/B/D2-R2/3/4表示引物5’末端帶有第η號反向引物標簽序列的HLA-A/B/DRB1的R引物(此處η<95)，其它依次類推。且每個樣本對應特定的一套PCR引物(PInf-A/B/D2-F1/2/3/4/5/6/7，PInf_A/B/D2_R2鋪)。PCR反應在Bio-Rad公司的PTC-200PCR儀上運行。PCR完成后，取2ulPCR產(chǎn)物經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖1顯示了1號樣本HLA-A/B/DRB1相應外顯子PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，DNA分子標記為DL2000(Takara公司)，膠圖上有一系列片段大小為300bp_500bp單一條帶，表明1號樣本的HLA-A/B/DRB1各外顯子(A2、A3、A4、B2、B3、B4、DRB1_2)PCR擴增成功，陰性對照(N)無擴增條帶。其它樣品的結(jié)果與此類似實施例3PCR產(chǎn)物混合和純化從96孔板HLA-P-A2剩余的PCR產(chǎn)物中(陰性對照除外)各取20ul混合在一個3ml的EP管中，標記為HLA-A2-Mix，對其它6個96孔板進行同樣的操作，分別標記為HLA-A3-Mix,HLA-A4-Mix,HLA_B2_Mix、HLA_B3_Mix、HLA-B4-Mix和HLA_D2_Mix，震蕩混勻，從HLA-A2-Mix、HLA_A3_Mix、HLA_A4_Mix、HLA_B2_Mix、HLA_B3_Mix、HLA_B4_Mix和HLA-D2-Mix中各取200ul混合在一個3ml的EP管中，標記為HLA-Miχ，從HLA-Mix中取500ulDNA混合物經(jīng)QiagenDNAPurificationkit(QIAGEN公司)過柱純化(具體純化步驟詳見說明書)，純化所得的200ulDNA，經(jīng)Nanodrop8000(ThermoFisherScientific公司)測定HLA-MixDNA濃度為48ng/ul。實施例4PCR產(chǎn)物的打斷，以及IlluminaGAPCR-Free測序文庫的構(gòu)建1.DNA打斷從純化后的HLA-Mix中取總量5ug的DNA用CovarismicroTubewithAFAfiberandSnap-Cap在CovarisS2(Covaris公司)上打斷。打斷條件如下頻率掃描(frequencysweeping)112.打斷后純化將HLA-Mix的所有打斷產(chǎn)物用QIAquickPCRPurificationKit回收純化，分別溶于37.5ul的EB(QIAGENElutionBuffer)中；3.末端修復反應對打斷后純化的HLA-Mix進行DNA末端修復反應，體系如下(試劑均購自Enzymatics公司)反應條件為Thermomixer(Eppendorf公司)20°C溫浴30mino反應產(chǎn)物經(jīng)QIAquickPCRPurificationKit回收純化，溶于34μ1的^(QIAGENElutionBuffer)中。4.3，末端加A反應上一步回收DNA的3’末端加A反應，體系如下(試劑均購自Enzymatics公司)反應條件為Thermomixer37°C溫浴30min。反應產(chǎn)物經(jīng)MiniElutePCRPurificationKit(QIAGEN公司)回收純化，溶于13μ1的EB溶液(QIAGENElutionBuffer)中。5.連接IlluminaGAPCR-Free文庫接頭(adaptor)術(shù)語“PCR-Free文庫接頭(adapter)”是指經(jīng)設計的一段堿基，其主要作用是輔助固定DNA分子在測序芯片上以及提供通用測序引物的結(jié)合位點，PCR-Free文庫接頭可以通過DNA連接酶將其直接連接至測序文庫中的DNA片段兩端，接頭的導入過程因為沒有PCR的參與，因此稱作PCR-Free文庫接頭。加A后的產(chǎn)物連接IlluminaGAPCR-Free文庫接頭，體系如下(試劑均購自Illumina公司)反應條件為Thermomixer20°C溫浴15min。反應產(chǎn)物經(jīng)AmpureBeads(BeckmanCoulterGenomics)純化后溶于50ul去離子水，經(jīng)熒光定量PCR(QPCR)檢測到DNA濃度結(jié)果如下6.割膠回收取30μLHLA-Mix用2%低熔點瓊脂糖膠進行回收。電泳條件為100V，IOOmin0DNAmarker為NEB公司的50bpDNAmarker。割膠回收450_750bp長度范圍的DNA片段(附圖2)。膠回收產(chǎn)物經(jīng)QIAquickPCRPurificationKit(QIAGEN公司)回收純化，純化后體積為32ul，經(jīng)熒光定量PCR(QPCR)檢測到DNA濃度結(jié)果為10.16nM。實施例5IlluminaGA測序根據(jù)QPCR檢測結(jié)果，取IOpmolDNA用IlluminaGAΡΕ-100程序測序，具體操作流程詳見IlluminaGA操作說明書(IlluminaGAIIx)。實施例6結(jié)果分析IlluminaGA產(chǎn)出的測序結(jié)果是一系列DNA序列，通過查找測序結(jié)果中的正反引物標簽序列和引物序列，建立各個引物標簽對應樣本HLA-A/B/DRB1各外顯子PCR產(chǎn)物測序結(jié)果的數(shù)據(jù)庫。通過BWA(Burrows-WheelerAligner)把各外顯子的測序結(jié)果定位在相應外顯子的參考序列上(參考序列來源http://WWW.ebi.ac.uk/imgt/hla/)同時，構(gòu)建各個數(shù)據(jù)庫的一致性(consensus)序列，再對數(shù)據(jù)庫中DNA序列進行篩選和測序錯誤校正。校正后的DNA序列通過序列重疊(overlap)和連鎖(Pair-End連鎖)關系可組裝成HLA-A/B/DRBl各外顯子相應的序列。所得DNA序列利用與IMGTHLA專業(yè)數(shù)據(jù)庫中HLA-A/B/DRB1相應各外顯子的序列數(shù)據(jù)庫比對，序列比對結(jié)果100%匹配的即為對應樣本的HLA-A/B/DRB1基因型別?？蓞⒖紙D3示例說明的1號樣品的HLA-A位點的2號外顯子一致性序列構(gòu)建程序的截圖。所有95個樣本，得到的分型結(jié)果與原已知分型結(jié)果完全相符，其中1-32號樣本的具體結(jié)果如下樣本編號原HLA-A/B/DRB1型別0107]1A^f0203A^f1101B^t3802B^t4801DRBl>t1454DRBl>t15010108]2A^f0101A^f3001B^t0801B^t1302DRBl>t0301DRBl>t07010109]3A^f0101A^f0201B^t1511B^t4701DRBl>t1302DRBl>t15010110]4A^f2408A^f2601B^t4001B^t5101DRBl>k0404DRBl>k09010111]5A^f0101A^f2402B^t5401B^t5502DRBl>k0405DRBl>k09010112]6A^f0101A^f0302B^t1511B^t3701DRBl>t1001DRBl>t14540113]7A^f1101A^f3001B^t1302B^t1518DRBl>k0404DRBl>t07010114]8A^f0101A^f0201B^t3503B^t8101DRBl>t1101DRBl>t15010115]9A^f0206A^f3101B^t2707B^t4002DRBl>t0301DRBl>t13020116]10A^f0101A^f6601B^t3701B^t4901DRBl>t1001DRBl>t13020117]11A^f0101A^f0301B^t3501B^t5201DRBl>t0101DRBl>t15020118]12A^f1101A^f1101B^t1501B^t1505DRBl>k0406DRBl>t15010119]13A^f0101A^f1102B^t0702B^t1502DRBl>k0901DRBl>t15010120]14A^f0101A^f0201B^t5201B^t6701DRBl>t1502DRBl>k16020121]15A^f0101A^f0205B^t1517B^t5001DRBl>t0701DRBl>t15010122]16A^f0101A^f1101B^t3701B^t4002DRBl>t1001DRBl>t12020123]17A^f2407A^f3201B^t3505B^t4001DRBl>t0301DRBl>k04050124]18A^f1101A^f2402B^t1301B^t3501DRBl>k1602DRBl>k16020125]19A^f1101A^f1101B^t4002B^t5512DRBl>k0405DRBl>t15010126]20A^f0211A^f2402B^t4001B^t4006DRBl>t1101DRBl>t15010127]21A^f0101A^f0206B^t5101B^t5701DRBl>t0701DRBl>t12010128]22A^f0101A^f2901B^t0705B^t1501DRBl>k0405DRBl>t07010129]23A^f0101A^f0207B^t3701B^t4601DRBl>k0403DRBl>t10010130]24A^f2485A^f3001B^t1302B^t5502DRBl>t0701DRBl>t15010131]25A^f1101A^f3101B^t0706B^t5101DRBl>t1202DRBl>t14050132]26A^f0101A^f1101B^t4601B^t5701DRBl>t0701DRBl>k08030133]27A^f0101A^f0201B^t1518B^t3701DRBl>k0401DRBl>t15010134]28A^f0101A^f2402B^t3701B^t4601DRBl>k0901DRBl>t10010135]29A^f2601A^f6601B^t4040B^t4102DRBl>t1201DRBl>t15010136]30A^f0201A^f2902B^t1302B^t4501DRBl>t0301DRBl>t12020137]31A^f0101A^f1103B^t1501B^t5701DRBl>t0701DRBl>t1501140138]32Aλ·1101A^f2601B^t3503B~k3801DRBl~k1103DRBl>t14040139]樣本編號測得的IA-A/B/DRB1型別0140]1Aλ·0203A^f1101B^t3802B*4801DRBl*1454DRBl>t15010141]2Aλ·0101A^f3001B^t0801B*1302DRBl*0301DRBl>t07010142]3Aλ·0101A^f0201B^t1511B*4701DRBl*1302DRBl>t15010143]4Aλ·2408A^f2601B^t4001B*5101DRBl*0404DRBl>k09010144]5Aλ·0101A^f2402B^t5401B*5502DRBl*0405DRBl>k09010145]6Aλ·0101A^f0302B^t1511B*3701DRBl*1001DRBl>t14540146]7Aλ·1101A^f3001B^t1302B*1518DRBl*0404DRBl>t07010147]8Aλ·0101A^f0201B^t3503B*8101DRBl*1101DRBl>t15010148]9Aλ·0206A^f3101B^t2707B*4002DRBl*0301DRBl>t13020149]10Aλ·0101A^f6601B^t3701B*4901DRBl*1001DRBl>t13020150]11Aλ·0101A^f0301B^t3501B*5201DRBl*0101DRBl>t15020151]12Aλ·1101A^f1101B^t1501B*1505DRBl*0406DRBl>t15010152]13Aλ·0101A^f1102B^t0702B*1502DRBl*0901DRBl>t15010153]14Aλ·0101A^f0201B^t5201B*6701DRBl*1502DRBl>k16020154]15Aλ·0101A^f0205B^t1517B*5001DRBl*0701DRBl>t15010155]16Aλ·0101A^f1101B^t3701B*4002DRBl*1001DRBl>t12020156]17Aλ·2407A^f3201B^t3505B*4001DRBl*0301DRBl>k04050157]18Aλ·1101A^f2402B^t1301B*3501DRBl*1602DRBl>k16020158]19Aλ·1101A^f1101B^t4002B*5512DRBl*0405DRBl>t15010159]20Aλ·0211A^f2402B^t4001B*4006DRBl*1101DRBl>t15010160]21Aλ·0101A^f0206B^t5101B*5701DRBl*0701DRBl>t12010161]22Aλ·0101A^f2901B^t0705B*1501DRBl*0405DRBl>t07010162]23Aλ·0101A^f0207B^t3701B*4601DRBl*0403DRBl>t10010163]24Aλ·2485A^f3001B^t1302B*5502DRBl*0701DRBl>t15010164]25Aλ·1101A^f3101B^t0706B*5101DRBl*1202DRBl>t14050165]26Aλ·0101A^f1101B^t4601B*5701DRBl*0701DRBl>k08030166]27Aλ·0101A^f0201B^t1518B*3701DRBl*0401DRBl>t15010167]28Aλ·0101A^f2402B^t3701B*4601DRBl*0901DRBl>t10010168]29Aλ·2601A^f6601B^t4040B*4102DRBl*1201DRBl>t15010169]30Aλ·0201A^f2902B^t1302B*4501DRBl*0301DRBl>t12020170]31Aλ·0101A^f1103B^t1501B*5701DRBl*0701DRBl>t15010171]32Aλ·1101A^f2601B^t3503B*3801DRBl*1103DRBl>t14040172]注:HLA-DRBl型別中的DRBl*1201不排除DRBl*1206/1210/1217的可能性DRBl女1454不排除DRBl女1401的可能性，因為上述等位基因在HLA-DRB12號外顯子的序列完全相同。盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細的描述，本領域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。參考文獻[1].http//www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats,html[2].TiercyJM.MolecularbasisofHLApolymorphismamplicationsinclinicaltransplantation.[J].TransplImmunol,2002,9:173-180.[3].C.Antoine,S.Miiller,A.Cant,etal.Long-termsurvivalandtransplantationofhaemopoieticstemcellsforimmunodeficiencies:reportoftheEuropeanexperience.1968-99.[J].TheLancet，2003，9357:553_560·[4].H.A.Erlich，G.Opelz，J.Hansen，etal.HLADNATypingandTransplantation.[J]·Immunity，2001，14:347_356.[5].LilloR,BalasA,VicarioJL,etal.TwonewHLAclassallele,DPBl女02014，bysequence-basedtyping.[J].TissueAntigens，2002，59:47_48·[6].A.Dormoy，N.Froelich.Leisenbach，etal.Mono-allelicamplificationofexons2~4usingallelegroup-specificprimersforsequence-basedtyping(SBT)oftheHLA-A,-Band~Cgenes!Preparationandvalidationofready-to-usepre-SBTmini-kits.[J].TissueAntigens，2003，62:201_216·[7].ElaineR.Mardis.Theimpactofnext-generationsequencingtechnologyongenetics.[J].TrendsinGenetics.2008，24:133_14L[8].ChristianHoffmannl，NanaMinkahl，JeremyLeipzig.DNAbarcodingandpyrosequencingtoidentifyrareHIVdrugresistancemutations.[J].NucleicAcidsResearch，2007，1-8[9].SayerD,WhidborneR,BrestovacB.HLA-DRBlDNAsequencingbasedtyping:anapproachsuitableforhighthroughputtypingincludingunrelatedbonemarrowregistrydonors.[J].TissueAntigens.2001,57(1):46_54。1權(quán)利要求一套用于HLAA，B基因分型的PCR引物，其特征在于所述PCR引物如表1所示，優(yōu)選地所述分析是基于測序法，包括第二代測序法，和Sanger法。2.權(quán)利要求1所述的PCR引物的用于測序的方法，其包括提供樣品，特別是血樣，所述血樣優(yōu)選地來自哺乳動物，特別是人；擴增使用所述PCR引物用于擴增血樣來源的DNA從而得到PCR產(chǎn)物，并對PCR產(chǎn)物進行純化；測序?qū)λ鯬CR產(chǎn)物進行測序，測序方法可以是Sanger測序法，或者可以是第二代測序法(例如HiSeq2000、IlluminaGA和Roche454)。3.權(quán)利要求1所述的PCR引物用于HLA基因分型的用途，其特征在于使用權(quán)利要求1所述的PCR引物，根據(jù)權(quán)利要求2的方法得到的結(jié)果進行組裝和比對分析，并將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的標準序列進行比較，得到HLA基因分型結(jié)果。4.一種用于進行HLA基因分型的試劑盒，所述試劑盒中包括權(quán)利要求1所述的PCR引物。全文摘要本發(fā)明提供了用于HLA-A，B基因分型的PCR引物，已經(jīng)所述PCR引物基于測序方法用于HLA基因分析的方法。文檔編號C12Q1/68GK101921842SQ20101021372公開日2010年12月22日申請日期2010年6月30日優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日發(fā)明者劉瑩,張彩芬,李劍,陳仕平申請人:深圳華大基因科技有限公司