本發(fā)明涉及葡萄白腐病防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其生防菌劑和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：葡萄白腐病在全國葡萄產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，是葡萄的主要病害之一。葡萄白腐病主要為害果穗，也可侵染枝蔓和葉片。初在穗軸和果梗上產(chǎn)生水浸狀、不規(guī)則的斑點(diǎn)，擴(kuò)大后終至組織腐敗壞死，果粒發(fā)病，多在基部開始，初呈淺褐色斑，迅速擴(kuò)展至整個(gè)果粒，后期果粒腐爛、脫落。葉片受害多從葉尖、葉緣開始，初形成褐色、水浸狀斑，后期病組織上出現(xiàn)灰白色小粒點(diǎn)。葡萄白腐病是由白腐盾殼霉(coniothyriumdiplodiella)侵染引起的，無性生殖產(chǎn)生分生孢子，分生孢子褐色、單胞，半透明、光滑、卵形，一端稍尖或鈍圓，另一端平截，內(nèi)含一至多個(gè)油球。目前，葡萄白腐病的防治多采用農(nóng)業(yè)措施與藥劑防治相結(jié)合的策略，生物防治研究較少。生物防治是利用有益的生物或其代謝產(chǎn)物防治有害生物的方法，對(duì)人畜安全、對(duì)環(huán)境和果品沒有污染，對(duì)有害生物不產(chǎn)生抗性。葡萄不論作為鮮食還是加工，綠色無公害是非常必要的。芽孢桿菌以其繁殖速度快、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)勢逐漸成為生物防治的熱點(diǎn)。已報(bào)道過的關(guān)于葡萄白腐病生物防治的微生物主要有枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌等。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌是一類極具優(yōu)勢生防潛力的菌株。有研究報(bào)道，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌可以防治由炭疽菌屬(colletotrichum)、絲核菌屬(rhizoctonia)等引起的病害。并研究發(fā)現(xiàn)該菌有促進(jìn)植物生長的作用。但尚未見甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對(duì)由白腐盾殼霉(coniothyriumdiplodiella)引起的葡萄白腐病防治的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明就是針對(duì)上述存在的缺陷而提供一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其生防菌劑和應(yīng)用。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于葡萄白腐病的生物防治研究欠缺，提出的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌gsbm05，對(duì)多種植物病原菌具有廣譜抗性，對(duì)葡萄白腐病、葡萄炭疽病等多種病害具有良好的防治效果。對(duì)葡萄植株安全，大規(guī)模生產(chǎn)成本低，操作方便，防治效果穩(wěn)定，能有效解決葡萄病害農(nóng)藥防治所帶來的農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染問題。對(duì)葡萄病害的生物防治方面具有巨大的應(yīng)用潛力，為研制和開發(fā)微生物農(nóng)藥提供了新資源。本發(fā)明的一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其生防菌劑和應(yīng)用技術(shù)方案為，本發(fā)明公開了一株防治葡萄白腐病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株。該菌株保藏名稱為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌gsbm05，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期：2017年1月10日，保藏編號(hào)：13556。所述的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對(duì)葡萄植株安全。所述的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在防治葡萄白腐病、葡萄炭疽病、葡萄穗軸褐枯病菌、葡萄枝枯病菌、楊樹水泡潰瘍病菌、楊樹腐爛病菌方面的應(yīng)用。尤其是在防治葡萄白腐病方面的應(yīng)用優(yōu)勢明顯。將甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicusgsbm05制備成生防菌劑。一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌生防菌劑，所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌生防菌劑包括甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌發(fā)酵液或發(fā)酵液濾液，發(fā)酵液濾液的制備步驟如下：(1)活化菌株：將保存好的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌gsbm05于na培養(yǎng)基中劃線并置于28℃培養(yǎng)箱中24h；(2)制備種子液：挑取na培養(yǎng)基上的gsbm05單菌落接種到nb液體培養(yǎng)基中，28℃下180r/min震蕩培養(yǎng)24h；(3)制備發(fā)酵液：按體積比以5％接種量將步驟(2)中制備的gsbm05種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基初始ph為6.5、發(fā)酵溫度為28℃、震蕩頻率為150r/min、發(fā)酵時(shí)間為60h；經(jīng)平板計(jì)數(shù)，菌液濃度大于2.0×1010cfu/ml；(4)制備發(fā)酵液濾液：將步驟(3)中制備得到的gsbm05發(fā)酵液在10000r/min下離心20min，取上清液，經(jīng)直徑為0.22um的微孔濾膜過濾得到發(fā)酵濾液。所述步驟(3)中微生物菌劑的發(fā)酵培養(yǎng)基為：淀粉20g/l、大豆餅粉5g/l、酵母提取物20g/l、nacl5g/l、caco32g/l，初始ph6.5。所述的一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌gsbm05微生物菌劑在防治鮮食葡萄白腐病上的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicusgsbm05，該菌株對(duì)葡萄白腐病菌有強(qiáng)烈的抑制作用，對(duì)多種植物病原菌具有廣譜抗性，對(duì)葡萄植株安全，大規(guī)模生產(chǎn)成本低，操作方便，防治效果穩(wěn)定，能有效解決葡萄病害農(nóng)藥防治所帶來的農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染問題。對(duì)葡萄病害的生物防治方面具有巨大的應(yīng)用潛力，為研制和開發(fā)微生物農(nóng)藥提供了新資源。附圖說明：圖1所示為本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌bacillusmethylotrophicusgsbm05在nb培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；圖2所示為葡萄白腐病菌空白對(duì)照培養(yǎng)與菌株gsbm05發(fā)酵濾液培養(yǎng)照片。具體實(shí)施方式：為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實(shí)例來詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明并不局限于此。實(shí)施例1試驗(yàn)方法1.培養(yǎng)基na培養(yǎng)基：牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，葡萄糖2.5g，瓊脂15g，調(diào)節(jié)ph值至7.0，定容1l。121℃滅菌20min，用于gsbm05菌株斜面培養(yǎng)與活化；nb培養(yǎng)基：不加瓊脂的na培養(yǎng)基，用于gsbm05菌株種子液培養(yǎng)；pda培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml，用于真菌培養(yǎng)及抑菌試驗(yàn)。2.菌株gsbm05種子液的制備菌株gsbm05于na培養(yǎng)基活化后接于裝有100mlnb培養(yǎng)液的250ml三角瓶中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)24h。3.甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌gsbm05的鑒定3.1形態(tài)學(xué)鑒定在nb培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d，菌落圓形，乳白色，邊緣不整齊，表面突起，半濕潤，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，菌落漸變土黃色，外緣褶皺明顯。圖說明書附圖圖1所示。顯微鏡下觀察，菌體呈短桿狀，革蘭氏染色陽性。3.2生理生化鑒定如表1所示：表1通過生理生化指標(biāo)的測定，gsbm05為好氧菌，厭氧條件下生長微弱；在含有7％和10％nacl的液體培養(yǎng)基均不生長；不能利用檸檬酸鹽及硝酸鹽，可以水解淀粉和明膠，vp實(shí)驗(yàn)陽性，接觸酶實(shí)驗(yàn)陽性。能利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖作為碳源。3.3分子生物學(xué)鑒定采用天根細(xì)菌基因組dna小量制備試劑盒提取dna，用引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；1492r：5’-ctacggctaccttgttacga-3’進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物用天根dna凝膠回收試劑盒回收后，委托上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行測序，將所得到的的16srdna序列用ncbiblast程序與ncbiribosomalrnasequence數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。從分析結(jié)果看，gsbm05與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌km659226.1基因序列的同源性最近，同源率在99％以上，該測序結(jié)果與生理生化鑒定相吻合，確定gsbm05菌屬于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌gsbm05基因序列片段：4.gsbm05對(duì)病原菌的拮抗作用4.1gsbm05菌劑的制備發(fā)酵培養(yǎng)基為：淀粉20g/l、大豆餅粉5g/l、酵母提取物20g/l、nacl5g/l、caco32g/l，初始ph6.5。微生物菌劑的制備方法，制備步驟如下：1)活化菌株：將保存好的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌gsbm05于na培養(yǎng)基中劃線并置于28℃培養(yǎng)箱中24h；2)制備種子液：挑取na培養(yǎng)基上的gsbm05單菌落接種到nb液體培養(yǎng)基中，28℃下180r/min震蕩培養(yǎng)24h；3)制備發(fā)酵液：按體積比以5％接種量將步驟2)中制備的gsbm05種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基初始ph為6.5、發(fā)酵溫度為28℃、震蕩頻率為150r/min、發(fā)酵時(shí)間為60h。經(jīng)平板計(jì)數(shù)，菌液濃度大于2.0×1010cfu/ml；4)制備發(fā)酵液濾液：將步驟3)中制備得到的gsbm05發(fā)酵液在10000r/min下離心20min，取上清液，經(jīng)直徑為0.22um的微孔濾膜過濾得到發(fā)酵濾液。4.2gsbm05菌劑對(duì)葡萄白腐病的抑菌活性4.2.1gsbm05菌劑對(duì)葡萄白腐病菌菌絲生長的影響(1)gsbm05發(fā)酵液對(duì)葡萄白腐病菌菌絲生長的影響采用對(duì)峙培養(yǎng)法：在pda平板中心接種葡萄白腐病菌，將8mm無菌濾紙片蘸取發(fā)酵液后對(duì)稱貼在距離病原菌菌餅2.5cm處，25℃培養(yǎng)，3d后觀察并記錄病原菌生長直徑并計(jì)算抑菌率。(2)gsbm05發(fā)酵濾液對(duì)葡萄白腐病菌菌絲生長的影響采用菌落生長速率法：將獲得的發(fā)酵液與pda培養(yǎng)基按1:10體積比混合制作pda平板，在平板中央接直徑為0.5cm的指示菌菌碟，25℃下培養(yǎng)，定期檢查并測定菌落生長直徑，并計(jì)算抑菌率。生長抑制率＝(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對(duì)照組菌落直徑×100％如說明書附圖圖2所示，菌株gsbm05發(fā)酵液及發(fā)酵濾液均對(duì)葡萄白腐病菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑菌作用，抑菌率分別達(dá)到75％及87.5％。4.2.2gsbm05菌劑對(duì)葡萄白腐病菌孢子萌發(fā)的影響在無菌條件下，用1％葡萄糖溶液配制成孢子懸浮液，將孢子懸浮液與發(fā)酵液和發(fā)酵濾液分別按照1:1體積混合，采用凹玻片懸滴法進(jìn)行分生孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)皿保濕，以未加發(fā)酵液的孢子懸浮液為對(duì)照，28℃培養(yǎng)12h，調(diào)查孢子萌發(fā)率。孢子萌發(fā)率＝孢子萌發(fā)數(shù)/未萌發(fā)孢子數(shù)×100％12h后，對(duì)照萌發(fā)率為90％，添加了發(fā)酵液與發(fā)酵濾液的孢子萌發(fā)率為8％、10％。均有效地抑制了孢子萌發(fā)，抑制率分別為91％、89％。4.2.3gsbm05發(fā)酵液對(duì)真菌的抑菌譜測定將葡萄炭疽病菌、葡萄穗軸褐枯病菌、葡萄枝枯病菌、楊樹水泡潰瘍病菌、楊樹腐爛病菌在pda培養(yǎng)基上活化備用，采用菌落生長速率法：將獲得的發(fā)酵液與pda培養(yǎng)基按1:10體積比混合制作pda平板，在平板中央接直徑為0.5cm的上述病原菌的菌碟，25℃下培養(yǎng)，定期檢查并測定菌落生長直徑，并計(jì)算抑菌率。結(jié)果如表2所示，菌株gsbm05對(duì)5種供試植物病原真菌均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制效果，抑菌率均在50％以上，說明菌株gsbm05具有廣譜的抑菌能力，可用于多種病害的生物防治。表24.3gsbm05菌劑對(duì)葡萄白腐病的防治作用4.3.1葡萄果實(shí)和葉片預(yù)處理：選取外觀整齊、無病蟲害、無外傷的果實(shí)和葉片，先用自來水沖洗干凈，然后用75％酒精噴灑消毒，2min后用無菌濾紙擦干。將葉片和果實(shí)放入鋪有無菌濾紙的直徑為100mm的培養(yǎng)皿中，加入無菌水保濕，每個(gè)處理葉片和果實(shí)各8個(gè)，重復(fù)3次。4.3.2接種液制備：葡萄白腐病菌在pda平板上28℃培養(yǎng)，待充分產(chǎn)孢后，加無菌1％葡萄糖溶液10ml，用無菌棉簽洗下孢子和菌絲體，經(jīng)無菌脫脂棉過濾，除去菌絲體，再用無菌1％葡萄糖溶液配成懸浮液，將孢子含量調(diào)到10×10倍視野含80-100個(gè)孢子。分別取葡萄白腐病菌的孢子懸浮液1ml、0.5ml、2ml與1mlgsbm05發(fā)酵液加入到離心管中混勻，并標(biāo)號(hào)為a、b、c，分別取葡萄白腐病菌的孢子懸浮液1ml、0.5ml、2ml與1mlgsbm05發(fā)酵濾液加入到離心管中混勻，并標(biāo)號(hào)為d、e、f，以只接種gsbm05的發(fā)酵液、發(fā)酵濾液、葡萄白腐病菌、無菌水為對(duì)照，并分別標(biāo)號(hào)為g、h、i、j。4.3.3病原菌接種：用消毒接種針在每個(gè)果實(shí)上刺傷一個(gè)1mm左右的傷口，葉片刺傷4-5個(gè)傷口，在傷口處分別接種50ula、b、c、d、e、f、g、h、i、j接種液，28℃保濕培養(yǎng)，3d后進(jìn)行病情調(diào)查并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。室內(nèi)離體組織試驗(yàn)病級(jí)分類按表3標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。表3葡萄白腐病果實(shí)病斑分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)病斑直徑分級(jí)代表值0001.00～5.99i16.00～10.99ii211.00～15.99iii316.00～19.99iv4＞20.00v5表4葡萄白腐病葉片分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)代表值無病斑00病斑占葉片面積25％以下i1病斑占葉片面積25％-50％ii2病斑占葉片面積50％-75％iii3病斑占葉片面積75％以上iv4表5gsbm05菌劑對(duì)葡萄離體果實(shí)的防治效果測定表6gsbm05菌劑對(duì)葡萄離體葉片的防治效果測定由表5、表6可知，gsbm05菌劑對(duì)葡萄白腐病菌侵染后的葡萄葉片和果實(shí)均有較好的抑制效果，病斑直徑和面積明顯小于只接種葡萄白腐病菌的對(duì)照組。單獨(dú)接種發(fā)酵液和發(fā)酵濾液對(duì)葡萄果實(shí)和葉片也沒有影響，說明，gsbm05菌劑對(duì)葡萄沒有毒性，并且可以抑制病原菌的生長，可有效控制病原菌的侵染。序列表sequencelisting<110>山東省葡萄研究院<120>一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其生防菌劑和應(yīng)用<130>無<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工合成<400>1agagtttgatcctggctcag20<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成<400>2ctacggctaccttgttacga20<210>3<211>1425<212>dna<213>bacillusmethylotrophicus<400>3tcggcggctggctcctaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggt60gtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgat120tactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacaga180tttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacg240tgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtt300tgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttg360cgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcacca420cctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaaga480cctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggc540ccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaat600gcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacgg660cgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcag720ttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcacc780gctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccc840tccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttac900gcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagt960tagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgtt1020cttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctcc1080gtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggcc1140gtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttgg1200tgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccga1260agccaccttttatgtctgaaccatgcggttcaaacaaccatccggtattagccccggttt1320cccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgct1380aacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgactgcatgtat1425當(dāng)前第1頁12