專利名稱：一種直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制劑領(lǐng)域，尤其是一種直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
直投式發(fā)酵劑是指一系列高度濃縮和標(biāo)準(zhǔn)化的冷凍干燥發(fā)酵劑菌種，可直接加入熱處理的原料進(jìn)行發(fā)酵，而無需對(duì)其進(jìn)行活化、擴(kuò)培等其他預(yù)處理工作。目前直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的應(yīng)用國內(nèi)外未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種操作簡單、活菌含量很高， 活力高，接種量小的直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑及其制備方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下一種直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備方法，包括枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)、枯草芽孢桿菌高密度放大培養(yǎng)、菌體濃縮、加入保護(hù)劑、冷凍干燥法制備菌體發(fā)酵劑，最后得到直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑，所述枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)及高密度放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基重量百分比為蔗糖2，豆粕1，磷酸二氫鉀0. 1，硫酸鎂0. 05，加水至100%, ρΗ7· 0-7. 2，冷凍干燥法制備菌體發(fā)酵劑濃縮條件為離心轉(zhuǎn)速5000r/min，離心lOmin，離心溫度為4°C，所采用的保護(hù)劑為含有5%麥芽糊精、4%蔗糖、0. 8%海藻糖和0. 2%吐溫的水溶液。而且，所述枯草芽孢桿菌的名稱為TK-1，分類名稱Bacillus subtilis，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4731，保藏日期2011年4月2日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。而且，所述種子培養(yǎng)條件為37士 1°C進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為20h。而且，所述直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑中枯草芽孢桿菌的存活率為95. 3%，活菌數(shù)為 2. 69X1010cfu/go而且，所述直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑按1%。的接種量應(yīng)用于液態(tài)發(fā)酵，最高活菌數(shù)為 1. 03X1010cfu/mLo而且，直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑按1%。的接種量應(yīng)用于固態(tài)發(fā)酵，最高活菌數(shù)為 0. 985X 1010cfu/go一種直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑，其特征在于包括凍干保護(hù)劑和枯草芽孢桿菌， 所述凍干保護(hù)劑為5%麥芽糊精、4%蔗糖、0. 8%海藻糖、0. 2%吐溫。而且，所述枯草芽孢桿菌的名稱為TK-1，分類名稱Bacillus subtilis，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4731，保藏日期2011年4月2日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明中枯草芽孢桿菌TK-I菌株通過補(bǔ)料分批發(fā)酵高密度放大培養(yǎng)后，采用冷凍干燥法制備菌體發(fā)酵劑，用本方法生產(chǎn)的直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的存活率為 95.3%，活菌數(shù)為2. 69X101(lCfU/g，按照1%。的接種量便可達(dá)到理想的液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵效^ ο2、本發(fā)明首次采用冷凍干燥法制備直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑，與原液態(tài)種子接種相比，發(fā)酵劑接種量小，直接使用，節(jié)約勞動(dòng)力，縮短生產(chǎn)周期，又可有效地防止菌種污染及退化；保存管理方便，產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)勢。3、本發(fā)明確定了枯草芽孢桿菌在濃縮過程中采用離心轉(zhuǎn)速5000r/min，4°C下離心 lOmin，離心得率為98. 83%。4、本發(fā)明確定了菌體冷凍干燥過程中保護(hù)劑為5%麥芽糊精、4%蔗糖、0. 8%海藻糖、0. 2%吐溫，最終枯草芽孢桿菌凍干存活率為93%，活菌數(shù)為2. 69X 101(lCfU/g。5、采用本發(fā)明方法制備的直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑按1%。的接種量應(yīng)用于液態(tài)發(fā)酵，最高活菌數(shù)為ι. 03X IOltlCfuAiL,采用本發(fā)明方法制備的直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑按1%。的接種量應(yīng)用于固態(tài)發(fā)酵，最高活菌數(shù)為0. 985X101(lCfU/g。6、本發(fā)明制備的枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑具有以下優(yōu)點(diǎn)活菌含量很高，活力高，因而接種量??；能直接使用，避免了繁冗的擴(kuò)大培養(yǎng)過程，既節(jié)約勞動(dòng)力，縮短生產(chǎn)周期，又可有效地防止菌種污染及退化；保存管理方便；易于控制生產(chǎn)工藝，產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定；經(jīng)簡單復(fù)水處理后可直接作為種子菌株應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明進(jìn)行菌體收集時(shí)間對(duì)發(fā)酵劑活菌數(shù)的影響；圖2為凍干保護(hù)劑對(duì)發(fā)酵劑活菌數(shù)的影響，注1號(hào)10%麥芽糊精；2號(hào)10%蔗糖；3號(hào)10%海藻糖；4號(hào)10%吐溫；5號(hào)5%麥芽糖+5%蔗糖；6號(hào)5%麥芽糊精+4%蔗糖 +0. 8 %海藻糖+0. 2 %吐溫；7號(hào)5 %麥芽糊精+4 %蔗糖+1 %吐溫；8號(hào)5 %麥芽糊精+4 %蔗糖+1%海藻糖；圖3為枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑與發(fā)酵液接種在液態(tài)培養(yǎng)基的效果比較。圖4為枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑與發(fā)酵液接種在固態(tài)培養(yǎng)基的效果比較。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。1.菌體的種子液制備將甘油管凍藏的菌種接到裝有液體種子培養(yǎng)基的試管中，在溫度為37°C、轉(zhuǎn)速為 150r/min的條件下培養(yǎng)。其中液體種子培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨10g，Nacl 10g，酵母浸粉5g，pH7. O 7. 2， 在搖床中培養(yǎng)，其溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為150r/min。3.菌體的高密度放大培養(yǎng)以5 %的接種量將枯草芽孢桿菌接種于200L罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量160L，于 37士 1°C培養(yǎng)20h。采用蠕動(dòng)泵添加2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，使之維持在6. 8左右，發(fā)酵采用靜置補(bǔ)料分批發(fā)酵，補(bǔ)料后進(jìn)行輕微攪拌，添加0. 3%的豆油作消泡劑。
4.菌種收集菌種收集是整個(gè)工藝關(guān)鍵的一步，目前較為合適的方法是采用高速離心機(jī)進(jìn)行離心分離然后進(jìn)行真空冷凍干燥，它可以完全適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)要求，所以大都采用離心和真空干燥冷凍干燥的辦法。5.菌體保護(hù)劑的選擇在收集了大量的枯草芽孢桿菌菌體后必須添加菌種保護(hù)劑以使枯草芽孢桿菌免受外界有害因素的損傷。添加保護(hù)劑可以有效地提高枯草芽孢桿菌的存活率、存活時(shí)間、以及保持枯草芽孢桿菌原有的特性。6.冷凍干燥將收集的菌體與保護(hù)劑進(jìn)行充分混合后進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍溫度控制在_20°C -30°C，預(yù)凍時(shí)間隨菌體量表面積而定，干燥溫度大都在-20°C -30°C之間，干燥后的發(fā)酵劑水分含量低于3%為宜。7.測定活菌數(shù)—般采用平板計(jì)數(shù)法，操作步驟為稱取制備好的發(fā)酵劑lg，溶于9ml的無菌生理鹽水中，搖勻后用移液槍取Iml的菌液加進(jìn)另一個(gè)9ml的無菌生理鹽水中，進(jìn)行稀釋，依次做十倍梯度稀釋。稀釋完后，用移液槍分別取合適的稀釋度Iml打進(jìn)平板，倒入培養(yǎng)基混勻，依次做三個(gè)平行，放進(jìn)38 V培養(yǎng)箱倒置靜置培養(yǎng)。8.發(fā)酵劑的包裝發(fā)酵劑活菌數(shù)需大于101(lCfU/g，最終粉末制劑產(chǎn)品必須進(jìn)行真空封口包裝，并于低溫保藏，保質(zhì)期大約為la。以下是對(duì)直投式枯草芽孢桿菌制備劑的生產(chǎn)方法的一些參數(shù)的確定，以及一些培養(yǎng)條件的優(yōu)化。直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑制備條件的篩選1.枯草芽孢桿菌菌種收集時(shí)間的確定細(xì)菌生長分別經(jīng)歷了延滯期、對(duì)數(shù)生長期、平衡期和衰退期，在不同時(shí)期，生長情況不同，分別對(duì)其取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。篩選實(shí)例一液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖2g，豆粕lg，磷酸氫二鉀0. Ig,硫酸鎂0. 05g, pH7. 0 7. 2 接種與培養(yǎng)條件接種量5% (v/w)，培養(yǎng)溫度37士 1°C，培養(yǎng)時(shí)間18h。測得的活菌數(shù)為 3. 01X1010cfu/mL·篩選實(shí)例二液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖2g，豆粕lg，磷酸二氫鉀0. Ig,硫酸鎂0. 05g, pH7. 0 7. 2 接種與培養(yǎng)條件接種量5% (v/w)，培養(yǎng)溫度37士 1°C，培養(yǎng)時(shí)間20h。測得的活菌數(shù)為 3. 43X1010cfu/mL·篩選實(shí)例三液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖2g，豆粕lg，磷酸二氫鉀0. Ig,硫酸鎂0. 05g, pH7. 0 7. 2接種與培養(yǎng)條件接種量5% (v/w)，培養(yǎng)溫度37士 1°C，培養(yǎng)時(shí)間22h。測得的活菌數(shù)為 3. 36X1010cfu/mL·結(jié)果
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液態(tài)種子發(fā)酵液的最適培養(yǎng)時(shí)間為20h(見附圖1)。2.液體菌劑收集時(shí)的離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間的確定將增菌培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌通過離心機(jī)收集的液體菌劑，離心時(shí)的轉(zhuǎn)數(shù)和時(shí)間對(duì)菌體的影響較大，同等條件下，隨著離心轉(zhuǎn)數(shù)的增加，離心后菌的存活率降低，篩選實(shí)例1將發(fā)酵好的菌體液，在4000r/min的條件下，離心lOmin，離心前活菌數(shù) 3. 43X101QCfu/ml，離心后沉降液中活菌數(shù)為3. 25X 101(lCfu/ml，離心后沉降液菌體存活率為 94. 75%。篩選實(shí)例2將發(fā)酵好的菌體液，在4000r/min的條件下，離心15min，離心前活菌數(shù) 3. 43X101QCfu/ml，離心后沉降液中活菌數(shù)為3. 34X 101(lCfu/ml，離心后沉降液菌體存活率為 97. 38%。篩選實(shí)例3將發(fā)酵好的菌體液，在5000r/min的條件下，離心lOmin，離心前活菌數(shù) 3. 43X101QCfu/ml，離心后沉降液中活菌數(shù)為3. 39X 101(lCfu/ml，離心后沉降液菌體存活率為 98. 83%。結(jié)果離心的最適條件為5000r/min，離心時(shí)間為IOmin (見表1)。3.凍干保護(hù)劑的確定以下提及的保護(hù)劑的濃度均為對(duì)應(yīng)物質(zhì)的水溶液的重量百分比濃度。將菌體與滅好的凍干保護(hù)劑混勻后，使其完全凍結(jié)，然后進(jìn)行真空冷凍干燥。須對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)凍，本研究預(yù)凍的溫度_25°C -30°C，預(yù)凍時(shí)間4hr，凍結(jié)厚度為0. 5mm,再進(jìn)行冷凍干燥，條件為冷井溫度_30°C、板溫50°C、凍干時(shí)間20h。篩選實(shí)例1將菌體與凍干保護(hù)劑按一定比例混合，條件如上述，凍干保護(hù)劑成分為10%麥芽糊精，測得冷凍存活率為51. 3 %，凍干存活率為46. 1%，凍干粉活菌數(shù)為0. 83X1010cfu/go篩選實(shí)例2將菌體與凍干保護(hù)劑按一定比例混合，條件如上述，凍干劑保護(hù)成分為5%麥芽糊精、4%蔗糖、海藻糖，測得冷凍存活率為90. 1%，凍干存活率88.7%，凍干粉活菌數(shù)為 1. 22X1010cfu/go篩選實(shí)例3將菌體與凍干保護(hù)劑按一定比例混合，條件如上述，凍干劑保護(hù)成分為5%麥芽糊精、4%蔗糖、0.8%海藻糖、0.2%吐溫，測得冷凍存活率為89.6%，凍干存活率為 88.4%，凍干粉活菌數(shù)為2. 69X1010cfu/go結(jié)果應(yīng)采用的凍干劑保護(hù)成分為5%麥芽糊精、4%蔗糖、0.8%海藻糖、0.2%吐溫 (見附圖2)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)采用此方法生產(chǎn)直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑，此發(fā)酵劑含菌量高，活力強(qiáng)，活菌數(shù)達(dá)到2. 69X101QCfU/g。4.枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑在液態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用
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篩選實(shí)例1將枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑加入已滅菌的0. 85%生理鹽水中，常溫復(fù)水20min，然后按0.1%的接種量接入滅過菌的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，組成(％)蔗糖2，豆粕1，磷酸氫二鉀 0. 1，硫酸鎂0. 05，pH7.0 7.2，在37°C條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)18h，測活菌數(shù)，測得活菌數(shù)為 9. 96X 109cfu/mL。篩選實(shí)例2將經(jīng)液體活化后的枯草芽孢桿菌按5%的接種量接入滅過菌的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基， 組成(％)蔗糖2，豆粕1，磷酸氫二鉀0. 1，硫酸鎂0.05，pH7.0 7.2，在37°C條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)18h，測活菌數(shù)。測得活菌數(shù)為8.53 X 109cfu/mL。結(jié)果使用直投式地衣芽胞桿菌發(fā)酵劑按接種量0. 與接種量5%液體接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)比，最高活菌數(shù)分別為1. 03X 101(lCfu/mL和0. 903X 109Cfu/mL(附圖3)。明顯降低接種量，并可達(dá)到更好的發(fā)酵效果。五、直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用篩選實(shí)例1將枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑加入已滅菌的0. 85%生理鹽水中，常溫復(fù)水20min，然后按0. 的接種接入滅過菌的以豆粕為主的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，組成豆粕麩皮玉米粉 =3:1: 1，在37°C恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)18h，測活菌數(shù)。測得活菌數(shù)為8.21 X 109cfu/g。篩選實(shí)例2將經(jīng)液體活化后的枯草芽孢桿菌按5% (v/w)的接種量接入滅過菌的以豆粕為主的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，組成豆粕麩皮玉米粉=3 1 1，在37°C恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng) 18h，測活菌數(shù)。測得活菌數(shù)為7.4X 109cfu/g。結(jié)果使用直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑按接種量0. 與接種量5%液體接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)比，最高活菌數(shù)分別為9. 85X 109cfu/g和8. 43X 109cfu/g(附圖4)。發(fā)酵劑接種后菌體存在約12h的遲滯期，而后生長快速，最終發(fā)酵效果理想，可明顯降低接種量。結(jié)論通過對(duì)直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑生產(chǎn)工藝的研究，枯草芽孢桿菌濃縮采用最終枯草芽孢桿菌存活率達(dá)93.2%，發(fā)酵劑的活菌數(shù)為2. 69X101(lCfU/g，按1%。的接種量便可達(dá)到理想的液態(tài)或固態(tài)發(fā)酵效果，最高活菌數(shù)分別為1. 03X1010cfu/mL,9. 85X 109cfu/g。表1本發(fā)明離心時(shí)間與轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵劑活菌數(shù)的影響
權(quán)利要求
1.一種直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于包括枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)、枯草芽孢桿菌高密度放大培養(yǎng)、菌體濃縮、加入保護(hù)劑、冷凍干燥法制備菌體發(fā)酵劑，最后得到直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑，所述枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)及高密度放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基重量百分比為蔗糖2，豆粕1，磷酸二氫鉀0. 1，硫酸鎂0. 05，加水至100%，PH 7. 0-7. 2，冷凍干燥法制備菌體發(fā)酵劑濃縮條件為離心轉(zhuǎn)速5000r/min，離心lOmin，離心溫度為4°C，所采用的保護(hù)劑為含有5%麥芽糊精、4%蔗糖、0. 8%海藻糖和0. 2%吐溫的水溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于所述枯草芽孢桿菌的名稱為TK-1，分類名稱枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4731，保藏日期2011年4月2日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)條件為37士 1°C進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為20h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于所述直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑中枯草芽孢桿菌的存活率為95. 3%，活菌數(shù)為2. 69X IO10Cfu/ g°
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于所述直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑按1%。的接種量應(yīng)用于液態(tài)發(fā)酵，最高活菌數(shù)為 1. 03X10lclcfu/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑按1%。的接種量應(yīng)用于固態(tài)發(fā)酵，最高活菌數(shù)為0. 985X 1010cfu/go
7.一種直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑，其特征在于包括凍干保護(hù)劑和枯草芽孢桿菌， 所述凍干保護(hù)劑為5%麥芽糊精、4%蔗糖、0. 8%海藻糖、0. 2%吐溫。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑，其特征在于所述枯草芽孢桿菌的名稱為TK-1，分類名稱Bacillus subtilis，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4731，保藏日期 2011年4月2日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑及其制備方法，包括枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)、枯草芽孢桿菌高密度放大培養(yǎng)、冷凍干燥法制備菌體發(fā)酵劑，最后得到直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑，所述枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)及高密度放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基重量百分比為蔗糖2，豆粕1，磷酸二氫鉀0.1，硫酸鎂0.05，加水至100％，pH7.0-7.2。冷凍干燥法制備菌體發(fā)酵劑濃縮條件為離心轉(zhuǎn)速5000r/min，離心10min，離心溫度為4℃，凍干保護(hù)劑為5％麥芽糊精、4％蔗糖、0.8％海藻糖、0.2％吐溫。用本方法生產(chǎn)的直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的存活率為95.3％，活菌數(shù)為2.69×1010cfu/g，按照1‰的接種量便可達(dá)到理想的液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵效果?；诒揪觊_發(fā)了一種新型高活性的直投式枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備方法應(yīng)用于枯草芽孢桿菌相關(guān)產(chǎn)品的液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵。
文檔編號(hào)C12N1/04GK102433287SQ20111044672
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者孫巖, 尚瑋, 王建玲, 王海寬 申請人:天津科技大學(xué)