本發(fā)明涉及植物病害生物防治領域，特別涉及一種黃三素鏈霉菌和菌劑及其應用。

背景技術(shù)：

白絹病是由齊整小核菌(sclerotiumrolfsii)引起的一種常見的植物土傳真菌病害，主要發(fā)生于作物莖基部，在土壤較濕潤時，發(fā)病植株及周圍土壤表面會形成白色菌絲層，進而發(fā)育成外形似油菜籽的菌核。在發(fā)病后期，莖基部腐爛導致水分和營養(yǎng)運輸受阻，使作物干枯死亡。齊整小核菌的寄主超過500種，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害極大。齊整小核菌能產(chǎn)生菌核，提高了病原菌對農(nóng)藥及其他防治措施的抗性，增加了白絹病的防治難度。由于化學農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境中的殘留限制了其大量使用，而輪作及土壤消毒等方法對菌核消除效果不佳，探索新的防治途徑是目前亟待解決的問題。生物防治能避免化學農(nóng)藥導致的食品及環(huán)境風險等問題，已引起廣泛關注。

目前對白絹病的生物防治主要集中于木霉及細菌，利用放線菌抑制齊整小核菌(sclerotiumrolfsii)的報道較少，尚無放線菌次級代謝產(chǎn)物及活菌制劑對齊整小核菌菌核形成與土壤中菌核萌發(fā)抑制的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于通過提供一種黃三素鏈霉菌和菌劑及其應用，有效抑制齊整小核菌，防治白絹病及其類似植物病害。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。

(一)一種黃三素鏈霉菌，具體為黃三素鏈霉菌(streptomycesflavotricini)25，于2016年3月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學，郵編730072，保藏號為cctccno：m2016121。

對所述黃三素鏈霉菌(streptomycesflavotricini)25進行測序，其16srdna序列如seqidno.1所示。

(二)一種黃三素鏈霉菌菌劑，其特征在于，其有效成分為黃三素鏈霉菌(streptomycesflavotricini)25活菌孢子和/或黃三素鏈霉菌(streptomycesflavotricini)25的次級代謝產(chǎn)物。

優(yōu)選地，所述菌劑為粉狀菌劑，活菌數(shù)為3.3×10¹¹cfu/g。

(四)黃三素鏈霉菌在防治植物病害中的應用。

(五)黃三素鏈霉菌在防治白絹病中的應用。

(六)黃三素鏈霉菌菌劑在防治植物病害中的應用。

(七)黃三素鏈霉菌菌劑在防治白絹病中的應用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

黃三素鏈霉菌可合成幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶及纖維素酶，可同時產(chǎn)生抗齊整小核菌的活性物質(zhì)。這些真菌細胞壁水解酶能溶解齊整小核菌細胞壁，同時產(chǎn)生對病原菌絲的酶溶抗菌作用及活性物質(zhì)拮抗作用。黃三素鏈霉菌的粉狀活菌制劑施入未滅菌土壤可顯著促進土壤中齊整小核菌菌核腐爛，并顯著降低未腐爛菌核的萌發(fā)活性，從源頭上減少病原數(shù)量，減輕白絹病及類似的植物病害。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。

圖1為黃三素鏈霉菌25的菌落特征圖；

圖2為黃三素鏈霉菌25的系統(tǒng)進化樹；

圖3為放線菌無細胞發(fā)酵濾液對齊整小核菌菌核形成的抑制作用效果圖，其中：a顯示齊整小核菌在對照組ck培養(yǎng)基上菌核形成數(shù)量；b為黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液稀釋5倍時齊整小核菌菌核數(shù)量及對菌核形成的抑制作用效果圖；c為黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液稀釋25倍時的齊整小核菌菌核數(shù)量及對菌核形成的抑制作用效果圖，d為黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液稀釋50倍時齊整小核菌菌核數(shù)量及對菌核形成的抑制作用效果圖；

圖4為放線菌無細胞發(fā)酵濾液加入pda培養(yǎng)基對菌核萌發(fā)的影響效果圖，其中，a為在對照組ck培養(yǎng)基上菌核萌發(fā)及菌絲生長狀況圖，b為加入黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液的pda培養(yǎng)基上對菌核萌發(fā)的抑制效果圖；

圖5為黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液對病原菌絲的酶溶致畸作用效果圖，其中，a為對照組ck發(fā)酵濾液處理對病原菌絲的影響，b為黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵液處理對病原菌絲的酶溶致畸作用效果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域的技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明提供一種拮抗白絹病的黃三素鏈霉菌(streptomycesflavotricini)25，該菌分離自陜西省嵐皋縣魔芋白絹病株根區(qū)土壤，其菌落特征如圖1所示。

對黃三素鏈霉菌(streptomycesflavotricini)25進行16srdna序列分析，其系統(tǒng)進化樹如圖2所示，其核苷酸序列如下：

ctgcagtgtctgggattgccattcttggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgcccttcactctgggacaagcccatggaaacggggtctaataccggatacgactgcggaaggcatcttctgcggtggaaagctccggcggtgaaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgtcggatgtgaaagcccgaggcttaacctcgggtctgcattcgatacgggctagctagagtgtggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccattactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgttgggaactaggtgttggcgacattccacgtcgtcggtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatataccggaaagcattagagatagtgccccccttgtggtcggtatacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctgtgttgccagcatgcccttcggggtgatggggactcacaggagaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgataccgtgaggtggagcgaatctcaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgctcgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaacccttgtgagggagcggtcgaagctctactctgc

本實施例所用試驗材料及其制備方法如下：

本實施例的供試病原菌為齊整小核菌(sclerotiumrolfsii)，分離自陜西省南鄭縣大田中被白絹病侵染的附子，由西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院微生物資源研究室分離鑒定。

本實施例的黃三素鏈霉菌(streptomycesflavotricini)25為西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院微生物資源研究室篩選鑒定保藏。

本實施例的土壤采自有白絹病發(fā)生的附子大田耕層，風干，粉碎過2mm篩，用于放線菌活菌制劑對土壤中菌核萌發(fā)抑制測定。

黃三素鏈霉菌制劑的制備：將黃三素鏈霉菌進行固態(tài)發(fā)酵制備孢子粉，所得菌劑的活菌數(shù)為3.3×10¹¹cfu/g，其有效成分為黃三素鏈霉菌25活菌孢以及黃三素鏈霉菌25的次級代謝產(chǎn)物。

齊整小核菌菌體粉的制備：用竹簽分別挑取適量pda斜面活化好的齊整小核菌菌絲，接種到裝有200ml察氏液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，25℃，160r·min^-1搖床振蕩培養(yǎng)5d。雙層紗布過濾收集菌絲體，用去離子水多次沖洗至無殘留培養(yǎng)液，40℃烘干，用研缽磨至細粉狀，過0.25mm篩，即得。

靶標菌病原菌菌餅的制備：挑取在皿內(nèi)培養(yǎng)3天的齊整小核菌(sclerotiumrolfsii)菌絲加入裝有3ml無菌水及細石英砂的試管中，用無菌玻璃棒研磨制成菌絲片段懸液，吸取0.05ml于pda培養(yǎng)基上，用刮鏟涂勻。28℃培養(yǎng)4天后，用無菌打孔器制成直徑7mm圓形菌餅。

菌核的制備：挑取pda斜面上生長的齊整小核菌菌絲至pda平板上，28℃培養(yǎng)3周，將菌核從平板上刮下，用滅菌吸水紙吸干水分備用。

以淀粉為碳源的黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液的制備：向培養(yǎng)至長出孢子的放線菌黃三素鏈霉菌斜面加無菌水3ml，用滅菌竹簽將孢子刮下，攪勻制成孢子懸液；用無菌吸管將孢子懸液全部轉(zhuǎn)入已滅菌裝有100ml高氏1號液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，用4層棉布封口，重復3瓶，28℃、160r/min搖床培養(yǎng)8d后用濾紙過濾、0.22μm滅菌微孔濾膜過濾除菌，即可獲得以淀粉為碳源的黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液。

以齊整小核菌菌體為碳源的黃三素鏈霉菌誘導酶液及其無細胞發(fā)酵濾液的制備：以齊整小核菌菌體粉代替高氏1號液體培養(yǎng)基中的淀粉，齊整小核菌菌體粉的用量為10g/l，121℃滅菌30min，黃三素鏈霉菌的接種方法同上。28℃、160r/min搖床培養(yǎng)5d時靜置，用無菌吸管取20ml上清液用于供試放線菌產(chǎn)生的真菌細胞壁水解酶活性測定，剩余培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至第8d，10000r/min離心5min，上清液用0.22μm滅菌微孔濾膜過濾除菌，即可獲得以病原菌菌體為碳源的無細胞發(fā)酵濾液。上述高氏1號液體培養(yǎng)基中加入的齊整小核菌菌體粉用做黃三素鏈霉菌生長的碳源及合成真菌細胞壁水解酶的誘導物，加入該誘導物后獲得的無細胞發(fā)酵濾液即為黃三素鏈霉菌產(chǎn)生的含有真菌細胞壁水解酶的粗酶液。

實施例1

黃三素鏈霉菌(streptomycesflavotricini)25對菌絲生長的抑制

(1)試驗方法：

將黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液(原液，5、10倍的無菌水稀釋液)與冷卻至50℃左右的pda培養(yǎng)基按體積比1∶4混勻后倒平板，即得最終稀釋為5、25及50倍的發(fā)酵濾液pda平板；用滅菌竹簽挑取齊整小核菌(sclerotiumrolfsii)瓊脂塊于平板中央，菌面向上，每處理重復3次；以無菌水為對照。28℃培養(yǎng)，分別于24h、48h后用十字交叉法測量菌落直徑，按下式計算無細胞發(fā)酵濾液對菌絲生長的抑菌率(inhibitionrateofmyceliagrowth，irmg)

式中：irmg為拮抗菌無細胞發(fā)酵濾液對菌絲生長的抑菌率，dck、dt分別為對照、處理菌落直徑。

(2)試驗結(jié)果：

由表1可知，以淀粉及齊整小核菌菌體作為碳源時，黃三素鏈霉菌可產(chǎn)生能抑制齊整小核菌菌絲生長的活性代謝產(chǎn)物。以淀粉為碳源時，黃三素鏈霉菌的無細胞發(fā)酵液在稀釋5、25及50倍時，培養(yǎng)48h的抑菌率分別為52.8％、36.1％及25.0％，培養(yǎng)72h的抑菌率分別為46.1％、28.4％、17.6％，抑菌率呈現(xiàn)隨稀釋度增加、培養(yǎng)時間延長而逐漸降低的趨勢；以齊整小核菌菌體做碳源時，黃三素鏈霉菌也能產(chǎn)生抑制齊整小核菌菌絲生長的活性物質(zhì)，但相同時間及相同稀釋度的黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵液的抑菌率均略低于以淀粉為碳源時的黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液。

表1黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液對齊整小核菌菌絲生長的抑菌率(％)

實施例2

黃三素鏈霉菌(streptomycesflavotricini)25對菌核形成的抑制

(1)試驗方法：

完成黃三素鏈霉菌對菌絲生長抑菌率的測定之后，將培養(yǎng)皿置于室溫培養(yǎng)20d，將所產(chǎn)生的菌核刮下計數(shù)，對菌核形成的抑制率(inhibitionrateofsclectiaformation，irsf)按下式計算：

式中：irsf為菌核形成抑制率，nck、nt分別為對照、處理皿內(nèi)形成的菌核數(shù)量。

(2)試驗結(jié)果

由表2及圖3可知，培養(yǎng)20天時，黃三素鏈霉菌不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液對齊整小核菌菌核形成均有抑制作用(p＜0.01)。黃三素鏈霉菌的抑制效果良好，稀釋5、25及50倍時，產(chǎn)生的菌核數(shù)分別為5個/皿、234個/皿及327個/皿，無細胞濾液中抗菌活性物質(zhì)對菌核形成抑制率分別為99.5％、79.8％及71.8％。黃三素鏈霉菌發(fā)酵液抑制菌核形成的能力隨稀釋倍數(shù)升高而降低。

表2黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液對齊整小核菌菌核形成的抑制

注:同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示經(jīng)lsd法檢驗不同處理之間差異極顯著(p＜0.01)。

實施例3

黃三素鏈霉菌(streptomycesflavotricini)25對菌核萌發(fā)的抑制

(1)試驗方法

(1.1)黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液直接加入培養(yǎng)基對菌核萌發(fā)的抑制率：

將黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液原液與冷卻至50℃左右的pda培養(yǎng)基按體積比1∶4混勻后倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，用接種針將菌核接種于pda平板上，每皿接種12顆菌核，置于黑暗環(huán)境中，28℃下培養(yǎng)，每隔24h觀察1次萌發(fā)情況，按照下式計算黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液對菌核萌發(fā)的抑制率(inhibitionrateofsclerotiumgermination，irsg)

式中：irsg為發(fā)酵液對菌核萌發(fā)的抑制率，nck、nt分別為對照、處理皿內(nèi)萌發(fā)菌核數(shù)量。

(1.2)黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液浸泡菌核對菌核萌發(fā)的抑制率：

將黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液原液稀釋0、10、10²、10³倍，將菌核加入不同稀釋度無細胞發(fā)酵濾液中浸泡24h，用接種針按12粒/皿將已浸泡菌核接種于pda平板上，置于黑暗環(huán)境中28℃下培養(yǎng)，每隔24h觀察1次萌發(fā)情況，按下式計算無細胞發(fā)酵濾液浸泡對菌核萌發(fā)的抑制率(inhibitionrateofsclerotiumgermination，irsg)

式中：irsg為發(fā)酵液對菌核萌發(fā)的抑制率，nck、nt分別為對照、處理皿內(nèi)萌發(fā)菌核數(shù)量。

48h后拍照，采用imageproplus6.0進行圖像顏色分析，分別測定處理和對照的菌絲萌發(fā)面積像素值(hyphaareapixels，hap)。按下式計算無細胞發(fā)酵濾液對菌核萌發(fā)形成的新菌絲的抑制率(inhibitionrateofsub-mycelia，irsm)：

式中：irsm為發(fā)酵液浸泡后對萌發(fā)菌核產(chǎn)生的新菌絲生長的抑制率，hapck和hapt分別為對照和處理菌核萌發(fā)后的新菌絲面積像素值。

(1.3)黃三素鏈霉菌菌劑對土壤中菌核萌發(fā)的抑制：

參照rafik等的方法，將黃三素鏈霉菌活菌菌劑按0.5、1.0、5.0、10.0g/kg的用量加入附子種植田耕層風干土中，充分混勻，使黃三素鏈霉菌的孢子濃度達到1.7×10⁸、3.4×10⁸、1.7×10⁹、3.3×10⁹cfu/g土，然后按50g/皿用量將接種黃三素鏈霉菌活菌制劑的土壤分兩次裝入培養(yǎng)皿：先裝土30g/皿，刮平后按25粒/皿均勻放置菌核，再按20g/皿在菌核上覆蓋剩余土壤，加水20ml/皿后28℃培養(yǎng)14d，培養(yǎng)期間補水2次，10ml/次。培養(yǎng)結(jié)束后，將皿內(nèi)土壤中的菌核全部挑出，自來水洗凈菌核表面土壤后，用2％次氯酸鈉表面消毒3min，無菌水洗3次，再將表面消毒后的菌核置于pda平板上，28℃培養(yǎng)3d后觀察萌發(fā)率。以上處理每個濃度重復5皿。按下式計算黃三素鏈霉菌活菌制劑對土壤中菌核的萌發(fā)抑制率(inhibitionrateofstreptomycesisolatesonsclerotialgerminationinfieldsoil，irf)。

式中：irf為放線菌活菌制劑對土壤中菌核萌發(fā)的抑制率，nck、nt分別為對照、添加黃三素鏈霉菌活菌制劑處理皿中的菌核萌發(fā)數(shù)。

菌劑效應，即菌劑處理較對照組的增率⊿ck按下式計算

(2)試驗結(jié)果

(2.1)黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液加入培養(yǎng)基中對齊整小核菌菌核萌發(fā)的抑制效果：

由表3可知，將菌核置于拮抗菌5倍稀釋發(fā)酵液pda平板上培養(yǎng)24h時，黃三素鏈霉菌對齊整小核菌菌核萌發(fā)的抑制率達到100％。隨著培養(yǎng)時間延長，黃三素鏈霉菌對菌核萌發(fā)抑制率未受到影響。如圖4所示，在培養(yǎng)96h時，黃三素鏈霉菌發(fā)酵液對菌核萌發(fā)的抑制率仍為100％。根據(jù)后期觀察，黃三素鏈霉菌處理的菌核已完全喪失萌發(fā)能力。

表3黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液加入培養(yǎng)基稀釋5倍對齊整小核菌菌核萌發(fā)的影響

注:同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示經(jīng)lsd法檢驗不同處理之間差異極顯著(p＜0.01)。

(2.2)黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液浸泡菌核對菌核萌發(fā)的抑制效果：

由表4可知，黃三素鏈霉菌發(fā)酵液原液浸泡菌核對菌核萌發(fā)有一定抑制作用。培養(yǎng)24h、48h時，對菌核的抑制率分別為47.2％、2.8％，其余稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液處理菌核的萌發(fā)數(shù)與對照無顯著差異，說明拮抗菌無細胞發(fā)酵濾液浸泡僅能延遲菌核萌發(fā)，不能使其徹底喪失萌發(fā)能力。盡管如此，發(fā)酵濾液浸泡對菌核萌發(fā)后產(chǎn)生的新菌絲生長仍有顯著的抑制作用，黃三素鏈霉菌發(fā)酵濾液原液、10倍及10²倍稀釋液對新菌絲生長的抑制率分別達到82.8％、72.6％及77.1％。

表4黃三素鏈霉菌發(fā)酵液浸泡處理對齊整小核菌菌核萌發(fā)及新菌絲生長的抑制率

注:同一稀釋梯度同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示在同一時間不同菌株無細胞發(fā)酵濾液對齊整小核菌菌核萌發(fā)及生長抑制率經(jīng)lsd法檢驗差異達到極顯著(p＜0.01)。

(2.3)黃三素鏈霉菌活菌制劑對土壤中菌核活性的影響

由表5可知，添加黃三素鏈霉菌活菌制劑對土壤中菌核腐爛有促進作用，但殘留菌核的萌發(fā)率仍較高，當菌劑用量高達10.0g/kg時，菌核的總萌發(fā)率降低至44％，顯示出對菌核萌發(fā)的抑制作用(p＜0.01)，從源頭減小了白絹病的危害。

表5黃三素鏈霉菌活菌制劑對大田土壤中菌核腐爛及萌發(fā)的影響

注:同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示經(jīng)lsd法檢驗不同處理之間差異極顯著(p＜0.01)。

實施例4

黃三素鏈霉菌(streptomycesflavotricini)25合成的真菌細胞壁水解酶活性及對齊整小核菌菌絲的酶溶致畸作用。

(1)試驗方法

以齊整齊整小核菌菌體作為碳源時可誘導黃三素鏈霉菌產(chǎn)生真菌細胞壁水解酶，其無細胞發(fā)酵濾液為誘導酶粗酶液，以該粗酶液為材料，測定3種真菌細胞壁組分水解酶活性。

(1.1)幾丁質(zhì)酶活性測定：

幾丁質(zhì)膠體制備、幾丁質(zhì)酶活測定參照shanmugaiah等的方法，取1ml制備好的黃三素鏈霉菌誘導酶粗酶液，加1ml10g·l^-1的膠體幾丁質(zhì)，混勻后置于37℃恒溫水浴中水解3h，沸水浴中煮5min終止反應，用去離子水定容至3ml，于4000r·min^-1離心5min，取1ml上清液用dns法測定水解液中n-乙酰氨基葡萄糖含量。

(1.2)β-1，3-葡聚糖酶活性測定：

參照noronha等的方法，取0.5ml1.2.2制備的酶粗酶液，加.0.5ml10g·l^-1的昆布多糖，混勻后置于45℃恒溫水浴中水解30min。后續(xù)處理同幾丁質(zhì)酶，取1ml水解液用dns法測定水解液中葡萄糖含量。

(1.3)濾紙纖維素酶活性測定：

參照ghose等的方法，取0.5ml1.2.2制備的粗酶液，加1ml0.05mol·l^-1ph4.8的檸檬酸緩沖液，混勻后放入1×6cm新華濾紙條1條，置于50℃恒溫水浴中水解60min。后續(xù)處理及葡萄糖測定同β-1，3-葡聚糖酶。

以上3種酶測定時均以高溫滅活酶液為對照，每處理重復3次。酶活性定義：將37℃時1ml酶液在1min內(nèi)水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μgn-乙酰氨基葡萄糖的幾丁質(zhì)酶活性定義為1u；將45℃時1ml酶液在1min內(nèi)水解昆布多糖產(chǎn)生1μg葡萄糖的β-1，3-葡聚糖酶活性定義為1u；將50℃時1ml酶液在1min內(nèi)水解濾紙產(chǎn)生1μg葡萄糖的濾紙纖維素酶活性定義為1u。

(1.4)黃三素鏈霉菌合成的真菌細胞壁水解酶對齊整小核菌菌絲的酶溶致畸作用：

將洗凈且已滅菌的蓋玻片插入接有齊整小核菌的pda平皿，待菌絲鋪滿蓋玻片后，將布滿菌絲的蓋玻片斜靠在直立的50ml滅菌離心管壁上，向離心管中加黃三素鏈霉菌無細胞發(fā)酵濾液至蓋玻片高度約2/3處，37℃下保溫48h后將蓋玻片取出，將其中一面的菌絲擦干凈后晾干，于光學顯微鏡下觀察蓋玻片浸沒與未浸沒部分菌絲差異，檢查發(fā)酵濾液對菌絲有無溶解作用，并拍照。

(2)試驗結(jié)果

(2.1)黃三素鏈霉菌合成的真菌細胞壁水解酶：

由表6可知，在以齊整小核菌菌體為碳源時，可誘導黃三素鏈霉菌合成能降解真菌細胞壁成分的水解酶，黃三素鏈霉菌可同時合成幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶及濾紙纖維素酶3種酶。

表6齊整小核菌菌體誘導黃三素鏈霉菌發(fā)酵液中3種胞外真菌細胞壁降解酶活性

(2.2)酶溶致畸作用：

圖5為發(fā)酵液對病原菌絲的酶溶致畸作用。由圖5可知，對照組ck為病原菌正常菌絲，粗細均勻，光滑透明；黃三素鏈霉菌發(fā)酵液處理過的菌絲，可見在發(fā)酵液作用下菌絲發(fā)生溶解。

綜合以上實施例可知：①將黃三素鏈霉菌的粉狀活菌制劑施入未滅菌土壤可顯著促進土壤中齊整小核菌菌核腐爛，并顯著降低未腐爛菌核的萌發(fā)活性。黃三素鏈霉菌菌劑不同用量時的腐爛菌核數(shù)為對照的1.5～4.5倍，并使殘留菌核的萌發(fā)率較對照分別降低21.0％～42.0％。②以齊整小核菌菌體為碳源時，可誘導供黃三素鏈霉菌合成幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶及纖維素酶，可同時產(chǎn)生抗齊整小核菌的活性物質(zhì)，這意味著黃三素鏈霉菌菌劑產(chǎn)生的真菌細胞壁水解酶能溶解齊整小核菌細胞壁，同時產(chǎn)生對病原菌菌絲的酶溶抗菌作用及活性物質(zhì)拮抗作用。

雖然，本說明書中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

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<110>陜西博秦生物工程有限公司西北農(nóng)林科技大學

<120>一種黃三素鏈霉菌和菌劑及其應用

<130>2017

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<213>黃三素鏈霉菌（streptomycesflavotricini）25

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