一種甲基桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了甲基桿菌，其分類命名為甲基桿菌(Methylobacterium?sp.)YCA-02，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC?No.8389，保藏日期為2013年10月24日。本發(fā)明一種甲基桿菌(Methylobacterium?sp.)YCA-02具有較廣的降解譜，能使土壤中乙草胺的殘留量降低90％以上，成功地解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥殘留超標(biāo)和除草劑藥害問題，保證農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留含量符合綠色食品要求；適合在全國糧油蔬菜生產(chǎn)出口基地或有綠色食品商標(biāo)標(biāo)志的地方大面積推廣使用；對于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人類的身體健康，提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值具有重要的意義。本發(fā)明一種甲基桿菌Methylobacterium?sp.)YCA-02培養(yǎng)條件簡單、生產(chǎn)使用成本低，容易保存，使用方便，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
【專利說明】一種甲基桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種甲基桿菌(Methylobacterium sp.)YCA-02及其在乙草胺降解中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]乙草胺是美國孟山都公司1971年開發(fā)的一種新型酰胺類除草劑，作為該類除草劑早期開發(fā)的品種，乙草胺占酰胺類除草劑當(dāng)前銷售量的最大份額，是目前世界上最重要的除草劑品種之一，也是目前我國使用量僅次于草甘磷的第二大類除草劑。可廣泛用于玉米、水稻、甘蔗、花生、棉花、大豆、煙草、蔬菜等農(nóng)作物芽前土壤處理和防除田間牛筋草、稗草、冤絲子、馬唐、狗尾草、秋棱、馬齒覓、臂形草、黎、鴨拓草、覓、紫香附子禾本科雜草和部分小粒種子的闊葉雜草。
[0003]進(jìn)入環(huán)境的乙草胺及其代謝產(chǎn)物通過食物鏈在生物體內(nèi)不斷富集，可能會給哺乳動物、食草鳥類及水生生物帶來不育、癌癥和遺傳病等嚴(yán)重的健康問題和環(huán)境問題。目前，國內(nèi)外有關(guān)乙草胺在環(huán)境中降解動態(tài)方面的研究不多，而生物修復(fù)技術(shù)因微生物本身能對各類不同的有機(jī)污染物進(jìn)行降解和轉(zhuǎn)化而具有巨大的潛力。因此，從自然環(huán)境中篩選得到能夠去除乙草胺的有效菌種具有重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一目的在于提供一種對乙草胺具有降解作用的甲基桿菌。
[0005]本發(fā)明的第二目的在于提供一種甲基桿菌在乙草胺降解中的應(yīng)用。
[0006]技術(shù)方案:為了解決上述第一目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種甲基桿菌，其分類命名為甲基桿菌(Methylobacterium sp.)YCA-02,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼為100101，保藏編號為=CGMCC N0.8389，保藏日期為2013年10月24日。
[0007]為了解決上述的第二目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:所述甲基桿菌在乙草胺降解中的應(yīng)用。
[0008]具體應(yīng)用為:
[0009](I)將降解乙草胺殘留的甲基桿菌YCA-02的試管種接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；
[0010](2)將步驟(I)培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入500L的種子罐，無菌空氣的通氣量為1:0.6-1:1.2，攪拌速度為180-240r/min，培養(yǎng)溫度為30-35°C，培養(yǎng)時(shí)間為60h，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，得到種子液；
[0011](3)將步驟(2)所得到種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同，無菌空氣的通氣量為1:0.6-1:1.2，攪拌速度為180-240r/min，培養(yǎng)溫度為30_35°C，培養(yǎng)時(shí)間為60h，發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液即為應(yīng)用于乙草胺降解中的甲基桿菌。
[0012]更進(jìn)一步的，所述步驟(I)中LB培養(yǎng)基的配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g，蛋白胨 10.0g,氯化鈉 10.0g, pH7.0。
[0013]更進(jìn)一步的，所述步驟(2)中種子罐所用培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖0.8%，(NH4)2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值 7.2-7.5。
[0014]本發(fā)明中所述的甲基桿菌(Methylobacterium sp.)YCA-02的生理活性特征如下:
[0015]所述甲基桿菌(Methylobacterium sp.)YCA-02主要生物學(xué)特性為G-,無芽孢,無鞭毛，卵圓形，LB培養(yǎng)基上菌落成圓形，突起，邊緣整齊，干燥，不透明，接觸酶陽性，不能水解淀粉。
[0016]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0017](I)本發(fā)明公開的一種甲基桿菌(Methylobacterium sp.)YCA-02具有較廣的降解譜，能使土壤中乙草胺的殘留量降低90%以上，可在農(nóng)作物的生長過程中正常使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行病蟲害防治的同時(shí)保證農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留含量符合綠色食品要求；適合在全國糧油蔬菜生產(chǎn)出口基地或有綠色食品商標(biāo)標(biāo)志的地方大面積推廣使用。本發(fā)明對于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人類的身體健康，提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值具有重要的意義。本發(fā)明成功地解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥殘留超標(biāo)和除草劑藥害問題，既充分發(fā)揮了化學(xué)農(nóng)藥在植物病蟲草害防治中的高效快速的作用，又可以生產(chǎn)出無毒無公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品。
[0018](2)甲基桿菌(Methylobacterium sp.)YCA-02培養(yǎng)條件簡單、生產(chǎn)使用成本低,容易保存，使用方便，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明菌株YCA-02菌體結(jié)晶紫染色照片(IOOOx)；
[0020]圖2為本發(fā)明菌株YCA-02對乙草胺的搖瓶降解試驗(yàn)結(jié)果示意圖；
[0021]圖3為本發(fā)明使用菌株YCA-02進(jìn)行田間試驗(yàn)對乙草胺降解結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)例詳細(xì)闡述本發(fā)明甲基桿菌(Methylobacterium sp.)YCA_02的應(yīng)用。
[0023]甲基桿菌(Methylobacterium sp.) YCA-02的篩選、分離和鑒定:
[0024](I)取從生產(chǎn)乙草胺的某農(nóng)藥廠生產(chǎn)車間的廢水處理池中得到的活性污泥3.0mL加入乙草胺濃度為100mg/L的IOOmL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)中，其配方為:IOOOmL蒸懼水、1.50gΚ2ΗΡ04、0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4.7Η20、1.00g NaClU.00g (NH4) 2S04，ρΗ7.0，于 160r/min，30°C條件下振蕩培養(yǎng)，每隔5天按3%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接5次；
[0025](2)取上面得到的富集菌液1.0mL，加入9.0mL無菌水中，配成KT1的富集液，再吸取1.0mL配好的KT1的富集液加入9.0mL無菌水中，充分混勻配成10_2的富集液，以此類推，對富集液進(jìn)行梯度稀釋。吸取各梯度的稀釋液0.1mL涂布于含乙草胺的濃度為IOOmg/L無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方為:1000mL蒸餾水、1.50g Κ2ΗΡ04、0.50gKH2P04、0.20gMgSO4.7Η20、1.0Og NaClU.0Og (NH4) 2S04, 20.0Og 瓊脂，ρΗ7.0)上，30°C培養(yǎng) 7 天；
[0026](3) 7天后從上述無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，于3.0mL的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，LB液體培養(yǎng)基配方為:1000mL蒸餾水、NaCl 10.00g、蛋白胨10.00g、酵母粉
5.00g、pH7.0于8000r/min的條件下離心2min,倒去上清液,加入3.0mL的無菌水搖勻,仍于8000r/min的條件下離心2min,按此方法用無菌水洗兩遍后,加入3.0mL無菌水重懸該菌。吸取1.0mL該菌液加入IOOmL乙草胺濃度為100mg/L的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于160r/min，30°C條件下振蕩培養(yǎng)7天后，用高效液相色譜測其降解效果。將降解效率較高的一株囷株保存，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；
[0027](4)將降解菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，其配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g,蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g，pH7.0 ;30°C恒溫培養(yǎng)48h后觀察菌落形態(tài)，用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)(1000X)。菌株的生理生化鑒定按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行。鑒定為甲基桿菌屬(Methylobacterium sp.);命名為:YCA_02。其結(jié)晶紫染色照片如圖1所示，主要生物學(xué)特性為G-，無芽孢，無鞭毛，卵圓形，LB培養(yǎng)基上菌落成圓形，突起，邊緣整齊，干燥，不透明，接觸酶陽性，不能水解淀粉。
[0028]將甲基桿菌(Methylobacterium sp.)YCA-02進(jìn)行搖瓶試驗(yàn),檢驗(yàn)其對乙草胺的降解效果:
[0029]在含100mg/L乙草胺的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，其配方為:IOOOmL蒸懼水、1.50g Κ2ΗΡ04、0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4.7Η20、1.00g NaClU.0Og(NH4)2SO4, ρΗ7.0，按 3% 的接種量接種YCA-02，于30°C振蕩培養(yǎng)，48小時(shí)取樣測定。與空白相比，如圖2所示，處理樣品的吸收峰明顯下降，乙草胺被降解90%以上。
[0030]甲基桿菌(Methylobacterium sp.) YCA-02在乙草胺降解中的應(yīng)用:
[0031]實(shí)施例1:
[0032](I)將甲基桿菌YCA-02的原種在培養(yǎng)皿上活化，并測定降解性能，接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200mL LB培養(yǎng)基的IOOOmL搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；其中LB培養(yǎng)基的配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g, pH7.0 ；
[0033](2)準(zhǔn)備接種種子罐，種子罐500升，投料量400升，其中培養(yǎng)基配方為:葡萄糖0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值7.2。投料完畢后121°C高壓濕熱滅菌，冷卻至30°C后，培養(yǎng)60h，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，攪拌速度為180r/min，無菌空氣通入量為1:0.6 ;
[0034](3)將到達(dá)對數(shù)期的種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的生產(chǎn)罐1.1 kg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35°C以下，通無菌空氣保持無菌狀態(tài)備用。接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在30°C，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:0.6，攪拌速度為180r/min，培養(yǎng)60h。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/mL以上，即為應(yīng)用于乙草胺降解中的菌劑。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
[0035]實(shí)施例2:[0036](I)將甲基桿菌YCA-02的原種在培養(yǎng)皿上活化，并測定降解性能，接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200mL LB培養(yǎng)基的IOOOmL搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；其中LB培養(yǎng)基的配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g, pH7.0 ；
[0037](2)準(zhǔn)備接種種子罐，種子罐500升，投料量400升，其中培養(yǎng)基配方為:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值7.5。投料完畢后121°C高壓濕熱滅菌，冷卻至35°C后，培養(yǎng)60h，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種按10 %的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，攪拌速度為240r/min，無菌空氣通入量為1:1.2 ;
[0038](3)將到達(dá)對數(shù)期的種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的生產(chǎn)罐1.1 kg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35°C以下，通無菌空氣保持無菌狀態(tài)備用。接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在35°C，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:1.2，攪拌速度為240r/min，培養(yǎng)60h。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/mL以上，即為應(yīng)用于乙草胺降解中的菌劑。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
[0039]實(shí)施例3:
[0040](I)將甲基桿菌YCA-02的原種在培養(yǎng)皿上活化，并測定降解性能，接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200mL LB培養(yǎng)基的IOOOmL搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；其中LB培養(yǎng)基的配方為:1000mL蒸餾水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g, pH7.0 ；
[0041](2)準(zhǔn)備接種種子罐，種子罐500升，投料量400升，其中培養(yǎng)基配方為:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值
7.4。投料完畢后121°C高壓濕熱滅菌，冷卻至33°C后，培養(yǎng)60h，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種按10 %的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，攪拌速度為220r/min，無菌空氣通入量為1:0.9 ;
[0042](3)將到達(dá)對數(shù)期的種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的生產(chǎn)罐1.1 kg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35°C以下，通無菌空氣保持無菌狀態(tài)備用。接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在33°C，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:0.9，攪拌速度為220r/min，培養(yǎng)60h。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/mL以上，即為應(yīng)用于乙草胺降解中的菌劑。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
[0043]甲基桿菌(Methylobacterium sp.)YCA-02在田間試驗(yàn)中對乙草胺降解的應(yīng)用:
[0044]對此耕作土壤施用乙草胺原藥，使乙草胺初始濃度為50mg/kg，攪拌均勻，噴施含lg/L的葡萄糖水溶液使其含水量達(dá)到飽和含水量的60%。然后將1#田平均劃分為6塊，向其中3塊分別加入實(shí)施例2制備的菌劑60g ;另外3塊分別加入同體積的滅菌處理(121°C，30min)的實(shí)施例2制備的菌劑。共兩種處理，每個(gè)處理均是三個(gè)重復(fù)。分別于5d、10d、15d、20d、25d、30d后取樣測定乙草胺在土壤中的降解率。如圖3所示，加入菌體后，加入未滅活的菌劑的土壤中乙草胺降解明顯，降解率可達(dá)90%，加入滅活后的菌劑的土壤中乙草胺沒有明顯降解。[0045] 本發(fā)明一種甲基桿菌(Methylobacterium sp.) YCA-O2可直接用于田間土壤中對乙草胺降解，成功地解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥殘留超標(biāo)和除草劑藥害問題，既充分發(fā)揮了化學(xué)農(nóng)藥在植物病蟲草害防治中的高效快速的作用，又可以生產(chǎn)出無毒無公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品O
【權(quán)利要求】
1.一種甲基桿菌，其分類命名為甲基桿菌(Methylobacterium sp.)YCA-02,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC N0.8389，保藏日期為2013年10月24日。
2.權(quán)利要求1所述的甲基桿菌在乙草胺降解中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，采用以下生產(chǎn)流程得到應(yīng)用于乙草胺降解中的甲基桿菌: (1)將降解乙草胺殘留的甲基桿菌YCA-02的試管種接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期； (2)將步驟(I)培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入500L的種子罐，無菌空氣的通氣量為1:0.6-1:1.2，攪拌速度為180-240r/min，培養(yǎng)溫度為30_35°C，培養(yǎng)時(shí)間為60h，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，得到種子液； (3)將步驟(2)所得到種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同，無菌空氣的通氣量為1:0.6-1:1.2，攪拌速度為180-240r/min,培養(yǎng)溫度為30-35°C,培養(yǎng)時(shí)間為60h,發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液即為應(yīng)用于乙草胺降解中的甲基桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(I)中LB培養(yǎng)基的配方為:IOOOmL蒸餾水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g, pH7.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(2)中種子罐所用培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖 0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏.0.02%, pH 值 7.2-7.5。
【文檔編號】A62D101/28GK103834595SQ201410084284
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】馬愛軍, 何任紅, 張小華 申請人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院