專利名稱：一種采用微板和嗜熱脂肪芽孢桿菌檢測(cè)抗生素殘留的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于動(dòng)物源食品，特別是鮮奶中抗生素殘留檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
隨著生活水平的提高，人們對(duì)自身和親人的健康都越來越重視，大都養(yǎng)成了 “藥補(bǔ)不如食補(bǔ)”的習(xí)慣，但這些食補(bǔ)原料的安全性卻越來越令人擔(dān)憂。自20世紀(jì)90年代以來，藥物殘留超標(biāo)已使我國(guó)出口動(dòng)物性食品屢屢被拒，2002年初，歐盟宣布全面禁止進(jìn)口中國(guó)的蝦、兔和家禽肉等動(dòng)物性食品和水產(chǎn)品，由此導(dǎo)致2002年上半年中國(guó)水產(chǎn)品出口下降70% 以上。同年，出口歐盟的蜂蜜中氯霉素超標(biāo)，造成了浙江省為主的出口企業(yè)數(shù)億美元的損失。消費(fèi)者的餐桌上更是危機(jī)四伏。農(nóng)業(yè)部日前對(duì)某市生豬市場(chǎng)抽檢報(bào)告顯示，該市市場(chǎng)上近兩成豬肉抗生素殘留超標(biāo)。全球每年消耗的抗生素總量中90%被用在食用動(dòng)物身上， 且其中90%都只是為了提高飼料轉(zhuǎn)化率而作為飼料添加劑來使用。有關(guān)資料顯示，基于利益的驅(qū)使和監(jiān)管的漏洞，濫用抗生素已成為農(nóng)畜養(yǎng)殖業(yè)的“惡性腫瘤”。我國(guó)對(duì)抗生素危害性問題的重視起步較晚，在我國(guó)1996年頒布的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)獸藥的殘留檢測(cè)還只限于四環(huán)素族抗生素一項(xiàng)。2002年無公害食品計(jì)劃開始實(shí)施，農(nóng)業(yè)部以法規(guī)形式規(guī)定了無公害食品(豬肉、雞肉、水產(chǎn)品等)中獸藥使用的規(guī)范和最高殘留限量。確定了包括4種氟喹諾酮類藥物即恩諾沙星、二氟沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星和氟甲喹等抗菌素在內(nèi)的共60余種獸(漁)藥的使用準(zhǔn)則，但是同時(shí)頒布的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法卻極為有限，在肉食中推出的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法僅有不到10種。動(dòng)物性食品的安全問題已成為人們關(guān)注的健康問題。而至今，我國(guó)尚未對(duì)動(dòng)物性食品中抗生素污染情況進(jìn)行全面調(diào)查和經(jīng)常性監(jiān)測(cè)。隨著全社會(huì)和政府部門對(duì)動(dòng)物源食品抗生素超標(biāo)問題的重視，研究開發(fā)一些簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)和便攜化的能檢測(cè)多種抗生素殘留的分析技術(shù)是發(fā)展的必然趨勢(shì)，尤其在質(zhì)檢機(jī)構(gòu)進(jìn)行大樣本量的篩選工作中尤為需要一種高效率，低成本的抗生素檢測(cè)方法，這也必然將提高我國(guó)食品抗生素檢測(cè)水平，為我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的穩(wěn)定發(fā)展提供保障。動(dòng)物性食品中抗生素殘留檢測(cè)方法主要有微生物檢測(cè)法，理化檢測(cè)方法，如高效液相色譜法，氣相色譜法和薄層色譜法等和免疫分析法三類。薄層色譜法(TLC)操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，但仍需要復(fù)雜的樣品前處理，靈敏度不高。HPLC和GC等方法較之微生物法有高度的靈敏度和特異性，具有高效，快速，靈敏度高， 檢出率高等特點(diǎn)，但設(shè)備昂貴，對(duì)試驗(yàn)人員也有較高的要求，分析費(fèi)時(shí)而不易推廣，同時(shí)它還需要復(fù)雜煩瑣的樣品前處理且不能同時(shí)篩選大量的樣品。免疫分析法靈敏度高，特異性比微生物法強(qiáng)，單抗的特異性更高，但是檢測(cè)成本要求較高，不易于推廣。微生物法是測(cè)定抗生素殘留的經(jīng)典方法，原理是根據(jù)抗生素對(duì)微生物的生理機(jī)能、代謝的抑制作用，定性或定量確定樣品中抗生素的殘留，目前的微生物法主要有棉簽法、杯碟法和紙片法，這些方法普遍適用于抗菌藥物的殘留測(cè)定，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，一般的實(shí)驗(yàn)室都能操作，適用批量樣品快速篩選，但常缺乏專一性和精確度，且受到其它抗生素的干擾。盡管微生物法存在一些不足，許多發(fā)達(dá)國(guó)家都有一套用微生物法快速檢測(cè)可食性動(dòng)物組織和食物中抗生素殘留的方法，尤其是對(duì)紫外沒有特征吸收的氨基糖苷類抗生素，微生物效價(jià)法是當(dāng)前各國(guó)藥典測(cè)定該類抗生素含量的主要方法。同時(shí)，一些公司已將微生物抑制法試劑盒商品化，如BSDA、Charm&rec印tor assay及ECLIPSE等，檢測(cè)限可能滿足歐盟的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。在我國(guó)，微生物法被用于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和部頒標(biāo)準(zhǔn)中，用于檢測(cè)動(dòng)物性食品中的抗生素殘留。但是采用的一些方法精確性和時(shí)效性都相對(duì)較差，已經(jīng)無法滿足現(xiàn)在的檢測(cè)要求， 而對(duì)微生物法的改進(jìn)研究也較少，因此，借鑒微板微生物法在殺菌劑、防腐劑開發(fā)，和化合物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中的技術(shù)，及國(guó)外開發(fā)微生物試劑盒的先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，開發(fā)高效、靈敏、廉價(jià)的基于微板的微生物法檢測(cè)動(dòng)物性食品中的抗生素殘留，廣泛應(yīng)用于質(zhì)檢、農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)督管理、商檢和衛(wèi)生部門，并且為開發(fā)擁有自有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的試劑盒打下技術(shù)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、能夠普遍推廣應(yīng)用的抗生素殘留微生物檢測(cè)方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是(1)菌種活化準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基備用，在無菌條件下，挑取一環(huán)嗜熱脂肪芽孢桿菌用劃線法接種至牛肉膏蛋白胨斜面，放入55°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。本次試驗(yàn)復(fù)蘇后的菌種在1-2天后使用。(2)搖菌及轉(zhuǎn)接根據(jù)測(cè)試搖床中嗜熱脂肪芽孢桿菌懸液的OD值來確定最佳搖菌時(shí)間，以便在最佳時(shí)刻進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)及檢測(cè)。當(dāng)OD值為0. 2時(shí)，菌的生長(zhǎng)最旺盛，適合轉(zhuǎn)接培養(yǎng)檢測(cè)。在無菌操作臺(tái)上將嗜熱脂肪芽孢桿菌接到盛有75mL普通液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，封口，即刻放入搖床，在55°C，150r/min的條件下?lián)u勻，及時(shí)測(cè)試其OD值，當(dāng)OD值為0. 2 左右時(shí)(該實(shí)驗(yàn)大致為5小時(shí))，將菌懸液從搖床中取出，等待轉(zhuǎn)接。(3)制備混合菌液搖菌時(shí)間滿后，取出菌液瓶，在無菌操作臺(tái)上，用移液槍取擴(kuò)增好(待轉(zhuǎn)接)的菌液5mL (取前要充分搖勻)加入至IOOOmL培養(yǎng)基中混勻，該培養(yǎng)基含有葡萄糖1%，酵母粉 0. 2 %，牛肉膏0. 5 %，溴甲酚紫指示劑0. 00005 %。(4)微板的制作用移液槍取以上混合菌液270 μ L，加入微板孔中，同時(shí)以未加菌液的培養(yǎng)基做無菌空白對(duì)照，在檢測(cè)樣品微板孔內(nèi)再加入加30 μ L牛奶樣品或其它動(dòng)物源食品的提取液。(5)檢測(cè)將所制得的檢測(cè)微板放入55°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)池后觀察結(jié)果。微板孔內(nèi)培養(yǎng)基顏色變黃說明樣品中不含有抗生素或是抗生素的含量低于方法的檢出限。微板孔內(nèi)培養(yǎng)基的顏色如果仍為紫色，說明樣品中有抗生素殘留。方法的檢測(cè)限(ppb)青霉素G1-2阿莫西林1-4頭孢氨芐25-50
頭孢匹林2-4土霉素 20-80四環(huán)素 20-80紅霉素100-200氯霉素3000應(yīng)用實(shí)例一在超凈工作臺(tái)中挑取前一天培養(yǎng)的嗜熱脂肪芽孢桿菌單菌落，放入液體培養(yǎng)基中，放入搖床，55°C下震蕩培養(yǎng)7h，測(cè)0D600的范圍為0. 2-0. 4間。在微板第1列只加入270 μ L培養(yǎng)基，在2 12例之間加入的是270 μ L檢測(cè)培養(yǎng)基和菌懸液的混合溶液(其中檢測(cè)培養(yǎng)基87. 5 %，菌懸液12. 5 % )，然后在第1，3 6列上繼續(xù)加入30 μ L牛奶樣品，在第2列上加入無菌水，在7 12加入牛奶和抗生素的混合物， 其中A D加入的是青霉素和牛奶的混合物，7 12例濃度依次為10 10_5μ g/mL，E H加入的是氯霉素和牛奶的混合物，7 12濃度依次為1 10_5μ g/mL。在55°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)池觀察，加入青霉素樣品中變色的最低濃度為0. 001 μ g/mL，加入氯霉素樣品變色的最低濃度為1 μ g/mL，這剛好符合國(guó)家對(duì)這兩種抗生素的安全標(biāo)準(zhǔn)。所有未添加抗生素的牛奶樣品的培養(yǎng)基均變成黃色，說明現(xiàn)在市售牛奶都是無抗奶。應(yīng)用實(shí)例二在超凈工作臺(tái)中挑取前一天培養(yǎng)的嗜熱脂肪芽孢桿菌單菌落，放入液體培養(yǎng)基中，放入搖床，55°C下震蕩培養(yǎng)7h，測(cè)0D600的范圍為0. 2-0. 4間。在微板第1列只加入270 μ L培養(yǎng)基，在2 12之間加入的是270 μ L檢測(cè)培養(yǎng)基和菌懸液的混合溶液(其中檢測(cè)培養(yǎng)基87. 5%，菌懸液12. 5% )，然后在第1列的A D繼續(xù)加入30 μ L飼料雞蛋稀釋20倍的蛋清，第1列的E H加入土雞蛋稀釋20倍的蛋清，在第2列上加入無菌水，在3 12例A D加入飼料雞蛋稀釋20倍的蛋清，在E H加入土雞蛋釋20倍的蛋清，在55°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)池后觀察結(jié)果。土雞蛋的11個(gè)樣品中，有 1個(gè)樣品未變色，而飼料雞蛋11個(gè)樣品中有4個(gè)未變色，說明這些樣品有可能有抗生素的殘留，但需要采用色譜法進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。
權(quán)利要求
1.一種用于用于動(dòng)物源食品，特別是鮮奶中抗生素殘留檢測(cè)的微生物方法，其特征在于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)在96孔微板上進(jìn)行。
2.權(quán)利要求1中的微生物，其特征在于采用采用嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)為供試菌。
3.權(quán)利要求1中的檢測(cè)方法其特征在于以溴甲酚紫為變色指示劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在微板上采用微生物方法檢測(cè)抗生素殘留的方法。這種方法采用嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)為供試菌，在96孔微板上對(duì)動(dòng)物源食品中的抗生素殘留進(jìn)行檢測(cè)，以溴甲酚紫為指示劑，通過指示劑的變色確定是否有抗生素的殘留。這種方法可以用在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)動(dòng)物源食品中的抗生素殘留進(jìn)行粗篩。通過實(shí)驗(yàn)表明，這種方法比傳統(tǒng)的平板微生物方法檢測(cè)效率高，節(jié)約成分，并成靈敏度高。該方法的主要步驟是采用牛肉膏、葡萄糖、酵母粉和溴甲酚紫指示劑加蒸餾水配制成檢測(cè)培養(yǎng)基并將pH調(diào)至7.5，加入含有以上菌種的菌懸液，加入待測(cè)樣品，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，觀察培養(yǎng)基顏色變化以判定樣品中是否含有抗生素。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK102409077SQ20101029056
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者劉興泉 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)