本申請是申請日為2011年5月27日的中國專利申請201180036934.5“針對her2的單克隆抗體”的分案申請。本發(fā)明涉及針對人表皮生長因子受體2(her2)的單克隆抗體，和這類抗體的用途，尤其是它們在治療癌癥中的用途。
背景技術：
：her2是185-kda的細胞表面受體酪氨酸激酶，是表皮生長因子受體(egfr)家族的成員，該家族包括四種不同的受體：egfr/erbb-1，her2/erbb-2，her3/erbb-3和her4/erbb-4。egfr家族的四個成員形成同源和異源二聚體，her2是對于其他erbb受體優(yōu)選并且最有效的二聚體伴侶(graus-porta等，emboj1997；16：1647-1655；tao等，jcellsci2008；121：3207-3217)?？梢酝ㄟ^過表達或者通過與可以被配體結合而活化的其他erbbs的異源二聚化而活化her2(riese和stern，bioessays1998；20：41-48)。對于her2，沒有鑒別到任何配體。her2活化導致受體磷酸化，這通過多種信號通路如mapk、磷酸肌醇3-激酶/akt、jak/stat和pkc觸發(fā)下游信號的級聯(lián)，這最終導致多種細胞功能如生長、生存和分化的調控(huang等，expertopinbiolther2009；9：97-110)。對her2在腫瘤中的很多注意力集中在其在乳腺癌中的作用，其中報道了her2在約20％的病例中過表達并且her2過表達與預后較差相關(reese等，stemcells1997；15：1-8；andrechek等，procnatlacadsciusa2000；97：3444-3449；和slamon等，science1987；235：177-182)。除了乳腺癌，her2表達還與其他人腫瘤類型，包括前列腺癌，非小細胞肺癌，膀胱癌，卵巢癌，胃癌，結腸癌，食管癌和頭部和頸部的鱗狀細胞癌相關(garciadepalazzo等，intjbiolmarkers1993；8：233-239；ross等，oncologist2003；8：307-325；osman等，jurol2005；174：2174-2177；kapitanovic等，gastroenterology1997；112：1103-1113；turken等，neoplasma2003；50：257-261；和oshima等，intjbiolmarkers2001；16：250-254)。曲妥珠單抗是重組的人源化的單克隆抗體，其針對her2蛋白的結構域iv，從而在高her2過表達的細胞中阻斷配體非依賴性her2同源二聚化，導致在更小的程度上her2與其他家族成員的異源二聚化(cho等，nature2003；421：756-760和wehrman等，procnatlacadsciusa2006；103：19063-19068)。在具有適度her2表達水平的細胞中，發(fā)現曲妥珠單抗(trastuzumab)抑制her2/egfr異源二聚體的形成(wehrman等，(2006)，同上；schmitz等.，expcellres2009；315：659-670)。曲妥珠單抗介導抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)并防止胞外結構域脫落，否則胞外結構域脫落可以導致her2過表達細胞中截短的組成型活性的蛋白的形成。對于曲妥珠單抗也已經報道了表達高水平的her2的腫瘤細胞的體外和體內增殖的抑制(nahta和esteva的綜述，oncogene2007；26：3637-3643)。已經批準了用于her2過表達的轉移性乳腺癌第一線和輔助治療，或與化療相結合，或作為遵循一個或多個化療方案的單一藥物。已經發(fā)現曲妥珠單抗僅在20-50％的her2過表達的乳腺癌腫瘤患者中是有效的，許多初始應答者在幾個月后表現復發(fā)(dinh等，clinadvhematoloncol2007；5：707-717)。帕妥珠單抗(omnitargtm)是另一種人源化單克隆抗體。它針對her2蛋白的結構域ii，導致配體誘導的異源二聚化(即，her2與已經被配體結合的erbb家族的另一個成員的二聚化)的抑制；據報道不嚴格地要求高her2表達水平的機制(franklin等.，cancercell2004；5：317-328.)。盡管帕妥珠單抗也介導adcc，帕妥珠單抗的作用的主要機制依賴于其二聚化阻斷(hughes等，molcancerther2009；8：1885-1892)。此外，發(fā)現帕妥珠單抗增強egfr內化并通過抑制egfr/her2異源二聚體的形成而增強下調，否則使egfr拴系(tether)于質膜(hughes等，2009，同上)。這與egfr二聚體比egfr/her2二聚體更有效地內化這一觀察結果相關(pedersen等，molcancerres2009；7：275-284。據報道，當在以前的曲妥珠單抗治療期間進展的患者中組合時，帕妥珠單抗和曲妥珠單抗的作用的互補機制導致增強的抗腫瘤效果和有效性(baselga等，jclinoncol2010；28：1138-1144)，評價在以前未治療的her2陽性轉移性乳腺癌中這種抗體與多西他賽(docetaxel)共同組合的iii期試驗正在進行中。改進靶向抗體治療的另一種方法是通過將細胞毒性細胞或藥物特異性遞送至表達抗原的癌細胞。例如，所謂的三功能性抗體是雙特異性抗體，具有一個靶向腫瘤細胞上的抗原的臂以及另一個靶向t細胞上的抗原例如cd3的臂。結合后，形成結合fc的t細胞、腫瘤細胞和效應物細胞的復合物，導致殺死腫瘤細胞(muller和kontermann，biodrugs2010；24：89-98)。ertumaxomab就是這種針對her2的三功能性抗體，其在低her2表達的細胞系中誘導細胞毒性，在轉移性乳腺癌的ii期臨床開發(fā)中(jones等，lancetoncol2009；10：1179-1187和kiewe等，clincancerres2006；12：3085-3091)。her2抗體藥物綴合物(adc)目前在臨床開發(fā)中。t-dm1由與真菌毒素maytansine綴合的曲妥珠單抗組成。burris等，2011，jclinoncol29：398-405和lewisphillips等，cancerres2008；68：9280-9290)報道了在ii期試驗中嚴重預處理患者組群(包括以前的曲妥珠單抗和/或拉帕替尼(lapatinib)治療)中的應答。報道了來自ii期試驗的初步數據，其測定了t-dm1比曲妥珠單抗聯(lián)合多西他賽在沒有以前用于轉移性疾病的化療的her2-陽性轉移性乳腺癌患者中的療效和安全性(perez等，abstractba3，europeansocietyformedicaloncelogymeeting2010)。iii期試驗正在進行中，其中評價t-dm1比卡培他濱+拉帕替尼在以前接受曲妥珠單抗治療的her2-陽性的局部晚期或轉移性乳腺癌的患者中的療效和安全性。盡管許多因素參與選擇用于her2靶向治療的合適的抗體，如果her2-抗體復合物在抗體結合后有效地內化，這對于adc方法通常是一種優(yōu)勢。對于小鼠her2抗體的研究顯示，抗體的某些組合促進her2內吞作用(ben-kasus等，pnas2009；106：3294-9)。已經報道人her2抗體f5和c1相對于它們自身迅速地內化并結合相同的表位(wo99/55367和wo2006/116107)。然而，與egfr相比，her2的內化受損。事實上，egfr同源二聚體的內化效率遠遠高于her2同源二聚體(dinh等，clinadvhematoloncol2007；5：707-717)。egfr，也還有her3，可以分別通過形成egfr/her2和her3/her2異源二聚體而增加her2的內吞作用(baulida等，jbiolchem1996；271：5251-5257；pedersennm，等，molcancerres2009；7：275-84)。調節(jié)her2的功能的復雜機制需要進一步研究針對這種原癌基因的新的并且優(yōu)化的治療策略。因此，對于治療her2相關的疾病如癌癥，仍然需要有效和安全的產品。技術實現要素：本發(fā)明的一個目的是提供用于醫(yī)療用途的新的高度特異的、有效的單克隆her2抗體。本發(fā)明的抗體顯示與本領域中已有描述的抗體不同的her2結合特性。特別地，雖然如交叉阻斷her2的結合測定中顯示大部分抗體顯然結合與曲妥珠單抗、帕妥珠單抗或f5/c1結合的那些her2區(qū)段重疊的her2區(qū)段，新的抗體的特征在于，與已知抗體相比，在adc測定中殺死表達her-2的腫瘤細胞的更高的效率，改進的內化和/或其他優(yōu)勢。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體是完全人的，結合新的表位，和/或對于人患者中的治療用途具有有利的特性。示例性的特性包括但不限于，與以高或低水平表達人her2的癌細胞的有利的結合特性，特異性結合表達her2直接同源物的獼猴上皮細胞，結合her2后有效的內化，當作為adc施用時殺死高-或低-水平表達her2的癌細胞的高能力，在促進表達her2的細胞的增殖方面低于f5，對表達her2的癌細胞的增殖的中和或抑制的效果并提供對表達her2的細胞的有效的adcc-介導的殺死，以及上述特性的任何組合。下面進一步詳細描述了本發(fā)明的這些和其他方面。附圖說明圖1：humab重鏈可變區(qū)(vh)序列與種系(參照)序列的比對(a-k)。在每個vh序列中，在特定位置與種系(參照)的那些氨基酸不同的氨基酸突出顯示。顯示共有vh序列，其中“x”表示可能有其他氨基酸(選自在每個位置比對的那些氨基酸)的位置。在每個vh序列中，cdr1、cdr2和cdr3序列用下劃線表示。在表4中進一步定義了共有cdr序列。圖2：humab輕鏈可變區(qū)(vl)序列與種系(參照)序列的比對(部分a-b)。在每個vl序列中，在特定位置與種系(參照)的那些氨基酸不同的氨基酸突出顯示。在圖2a中，所有vl序列源自相同的v-區(qū)段(igkv1-12-01)，但抗體間最接近的j-區(qū)段不同。顯示共有vl序列，其中“x”表示可能有其他氨基酸(選自在指明位置比對的那些氨基酸)的位置。在每個vl序列中，cdr1、cdr2和cdr3序列用下劃線表示。在表4中進一步定義了共有cdr序列。圖3：如實施例12中所述測定的，her2抗體與(a、b)高(au565)和(c、d)低(a431)表達her2的細胞系的結合曲線。顯示數據是每種細胞系的一次代表性實驗的平均熒光強度(mfi)。ec50值表示表觀親和力。圖4：her2抗體與獼猴上皮細胞上表達的her2的結合。顯示數據是實施例13中所述的一次代表性實驗的平均熒光強度(mfi)。圖5：her2抗體的鉻-釋放(adcc)測定，顯示在與her2抗體孵育后51cr-標記的sk-br-3細胞的pbmc-介導的裂解。顯示的值是來自用sk-br-3細胞的一次代表性的體外adcc實驗的平均最高百分比51cr-釋放±標準偏差。詳細信息見實施例15。圖6：與未處理的細胞(設置為100％)相比，her2抗體對au565細胞的增殖的影響。顯示數據是在三次獨立的實驗中測定的與未處理的細胞相比的au565細胞的百分比增殖±標準偏差。*顯著的(p＜0.05)。詳細信息見實施例16。圖7：相對于僅用調蛋白-β1(heregulin-β1)刺激的細胞，用調蛋白-β1刺激并用指明的her2抗體處理的活的mcf7細胞的百分比。作為對照，顯示未刺激的細胞的增殖的百分比(無)。數據是從三次獨立的實驗獲得的±標準偏差。*調蛋白-β1誘導的增殖的顯著性抑制(p＜0.05)。詳細信息見實施例17。圖8：adc測定，顯示通過抗-κ-eta′-綴合的her2抗體的au565細胞(a、b)或a431細胞(c、d)的殺死。(a，b)顯示數據是使用以未綴合的和抗-κ-eta′-綴合的her2抗體處理的au565細胞的一次代表性實驗的熒光強度(fi)。(c，d)顯示數據是使用以未綴合的和抗-κ-eta′-綴合的her2抗體處理的a431細胞的一次代表性實驗的平均熒光強度(mfi)。詳細信息見實施例18。圖9：her2×her2雙特異性抗體與抗-κ-eta′預先孵育誘導的a431細胞的殺死。her2抗體與抗-κ-eta′預先孵育3天后a431細胞的活力。使用阿爾瑪藍定量細胞活力。顯示數據是使用以抗-κ-eta′-綴合的her2抗體和her2×her2雙特異性抗體處理的a431細胞的一次實驗的熒光強度(fi)。使用星形孢菌素作為陽性對照，而使用同種型對照抗體作為陰性對照抗體。圖10：her2×her2雙特異性分子誘導her2受體的下調。用10μg/mlmab孵育3天后au565細胞裂解物中her2表達水平的相對百分比。用her2特異性捕獲elisa定量her2的量并表示為與未處理的細胞相比的抑制百分比。顯示數據是兩次實驗(除了測試一次的單特異性igg1抗體的組合)的平均值加上標準偏差。圖11：her2×her2雙特異性抗體(fitc)與溶酶體標記lamp1(cy5)的共定位分析。對于各種單特異性her2抗體和her2×her2雙特異性抗體的與cy5重疊的fitc像素強度(圖11(a))。對于每種測試的抗體繪制三個不同的圖像的lamp1/cy5陽性像素的fitc像素強度。單特異性顯示與雙特異性相比在lamp1/cy5陽性像素中更低的fitc像素。圖11(b)代表從三個不同的圖像計算出的每個lamp1/cy5陽性像素的fitc像素強度的平均值。連同這些結果表明，在內化后，與單特異性抗體相比，更高水平的雙特異性抗體定位到lamp1/cy5陽性囊泡。圖12：通過her-2單和雙特異性抗體的增殖的抑制。在10μg/mlher2抗體或her2×her2雙特異性抗體存在的情況下在無血清的細胞培養(yǎng)基中接種au565細胞。3天后，以阿爾瑪藍定量活細胞的量，細胞活力表示為相對于未處理的細胞的百分比。使用同種型對照抗體作為陰性對照。顯示數據是五次測定的與未處理的細胞相比的活的au565細胞的百分比±標準偏差。*表示僅描述一個數據點。圖13：通過her2×cd3雙特異性抗體以及her2×cd3雙特異性抗體的n297q突變體(雙特異性表示為duo)的au565細胞的t細胞介導的細胞毒性。圖14：her2的抗體誘導的下調。用10μg/mlmab孵育3天后au565細胞裂解物中表達的her2的相對百分比。用her2特異性捕獲elisa定量her2的量并表示為相對于未處理的細胞的百分比。顯示數據是三次實驗的平均值±標準偏差。圖15：her2抗體(fitc)與溶酶體標記lamp1(cy5)的共定位分析。對于各種單特異性her2抗體的與cy5重疊的fitc像素強度。對于每種抗體繪制三個不同的圖像的lamp1/cy5陽性像素的fitc像素強度。第3組抗體098和153表現出與來自第2組的抗體025和帕妥珠單抗以及來自第1組的169和herceptin相比lamp1/cy5陽性對應物中更高的fitc像素強度。圖16：借助流式細胞儀分析的her2抗體與用不同的her2ecd構建體轉染的cho-s細胞的結合。hu-her2＝完全人her2，hu-her2-ch(i)cr1＝具有雞結構域i的hu-her2，hu-her2-ch(ii)＝具有雞結構域ii的hu-her2，hu-her2-ch(iii)＝具有雞結構域iii的hu-her2和hu-her2-ch(iv)＝具有雞結構域iv的hu-her2。顯示數據是一種代表性抗體th1014-153的平均熒光強度(mfi)。詳細信息見實施例25。圖17：在雌性cb.17重癥聯(lián)合免疫缺陷(scid)小鼠中nci-n87人胃癌異種移植物模型中her2-humabs的體內效果。顯示數據是每組(n＝10只小鼠/組)的平均腫瘤大小±s.e.m.(a)和生存(b)。詳細信息見實施例29。圖18：balb/c裸鼠中bt-474乳腺腫瘤異種移植物中her2humabs的體內效果。顯示數據是每組(n＝8只小鼠/組)的平均腫瘤大小±s.e.m.(a)和生存(b)。詳細信息見實施例30。具體實施方式定義當本文中使用時，術語“her2”(也被稱為erbb-2，neu，her-2和cd340)是指人表皮生長因子受體2(swissprotp04626)，包括細胞(包括腫瘤細胞)天然表達的或用her2基因轉染的細胞上表達的her2的任何變體、同種型和物種同源物。物種同源物包括獼猴her2(獼猴；genbank登錄號gi：109114897)。術語“免疫球蛋白”是指一類結構上相關的糖蛋白，由兩對多肽鏈(一對輕(l)低分子量鏈和一對重(h)鏈)組成，所有四條鏈通過二硫鍵內部連接。免疫球蛋白的結構已經得到充分表征。見例如fundamentalimmunology第7章(paul，w.，ed.，2nded.ravenpress，n.y.(1989))。簡而言之，每條重鏈典型地由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為vh或vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)典型地由三個結構域(ch1，ch2和ch3)組成。每條輕鏈典型地由輕鏈可變區(qū)(這里縮寫為vl或vl)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)典型地由一個結構域cl構成。vh和vl區(qū)可以進一步再分成超可變性區(qū)(或超變區(qū)，其在結構限定環(huán)的序列和/或形式中具有高度可變性)，也稱作互補決定區(qū)(cdrs)，它們之間散布著更保守的、稱作框架區(qū)(frs)的區(qū)域。每個vh和vl典型地由3個cdr和4個fr組成，從氨基末端向羧基末端以下列順序排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4(另見chothia和leskj.mol.biol.196，901-917(1987))。除非上下文另外指明或與之矛盾，根據imgt規(guī)則鑒別本文的cdr序列(brochetx.，nuclacidsres.2008；36：w503-508和lefrancmp.，nucleicacidsresearch1999；27：209-212；也參見因特網http地址imgt.cines.fr/imgt_vquest/vquest？livret＝0&option＝humanig。然而，也可以通過kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thed.publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.(1991)中所述的方法進行抗體序列中氨基酸殘基的編號(本文中短語如“如kabat中可變結構域殘基編號”，“kabat位置”或“根據kabat”是指這種編號系統(tǒng))。具體而言，對于恒定區(qū)中氨基酸的編號，可以使用根據同上的kabat等的eu索引編號系統(tǒng)。對于給定抗體，可以通過在該抗體序列與“標準”kabat編號序列的同源區(qū)的比對而確定殘基的kabat編號。在本發(fā)明的上下文中，術語“抗體”(ab)是指免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子的片段，或其二者中任一種的衍生物，其在典型的生理條件下具有與抗原特異性結合的能力，具有顯著時間期間的半衰期，如至少約30分鐘，至少約45分鐘，至少約1小時，至少約2小時，至少約4小時，至少約8小時，至少約12小時，約24小時或者更長，約48小時或者更長，約3、4、5、6、7或更多天等，或者任何其他相關的功能上定義的期間(如足夠誘發(fā)、促進、提高和/或調節(jié)和抗體與抗原的結合關聯(lián)的生理應答的時間，和/或足以供抗體招募效應物活性的時間)。免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結合結構域?？贵w(abs)的恒定區(qū)可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應細胞)和補體系統(tǒng)的組分，如補體活化經典途徑中的第一組分c1q。her2抗體也可以是雙特異性抗體、雙抗體(diabody)或類似分子(雙抗體的描述見例如pnasusa90(14)，6444-8(1993))。事實上，本發(fā)明提供的雙特異性抗體、雙抗體等除了結合her2的一部分以外，還可以結合任何合適的目標。如前所述，除非上下文另外指明或與之明顯矛盾，本文的術語抗體包括抗體的片段，該抗體片段是抗原結合片段，即保持與抗原特異性結合能力。已經顯示，可以由全長抗體的片段行使抗體的抗原結合功能。術語“抗體”中涵蓋的抗原結合片段的例子包括(i)fab’或fab片段，由vl，vh，cl和ch1結構域組成的單價片段，或者如wo2007059782(genmab)中描述的單價抗體；(ii)f(ab′)2片段，包含通過在鉸鏈區(qū)中的二硫橋連接的兩個fab片段的二價片段；(iii)基本上由vh和ch1結構域組成的fd片段；(iv)基本上由抗體的單一臂的vl和vh結構域組成的fv片段；(v)dab片段(ward等，nature341，544-546(1989))，其基本上由vh結構域組成，也稱作結構域抗體(holt等；trendsbiotechnol.2003nov；21(11)：484-90)；(vi)駱駝抗體(camelid)或納米抗體(nanobodies)(revets等；expertopinbiolther.2005jan；5(1)：111-24)，和(vii)分離的互補決定區(qū)(cdr)。而且，盡管fv片段的兩個結構域vl和vh是由分別的基因編碼，但是可以通過合成的接頭用重組方法將它們連接起來，該合成的接頭能夠使它們作為單一蛋白鏈制造出來，其中vl和vh區(qū)配對形成單價分子(被稱為單鏈抗體或單鏈fv(scfv)，見例如bird等.，science242，423-426(1988)和huston等.，pnasusa85，5879-5883(1988))。除非上下文另外指出或明顯指明，這種單鏈抗體涵蓋在術語抗體中。盡管這種片段通常包括在抗體的意義內，它們共同地并且各自獨立地是本發(fā)明的獨特特征，顯示不同的生物學特性和效用。本文進一步討論了在本發(fā)明的上下文中的這些和其他有用的抗體片段以及這種片段的雙特異性形式。還應當理解的是，除非另外指出，術語抗體還包括通過任何已知的技術如酶切割(enzymaticcleavage)、肽合成和重組技術提供的多克隆抗體、單克隆抗體(mabs)、抗體樣多肽，如嵌合抗體和人源化抗體，以及保留與抗原特異性結合能力的抗體片段(抗原結合片段)。產生的抗體可以具有任何同種型。如本文所使用的，“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的免疫球蛋白類型(例如igg1，igg2，igg3，igg4，igd，iga，ige，或igm)。術語“單價抗體”在本發(fā)明的上下文中意味著抗體分子能夠結合單個抗原分子，因此不能夠抗原交聯(lián)?！靶锕δ苋毕莸目贵w”或“效應物功能缺陷抗體”是指如下抗體，其具有顯著降低的活化一種或多種效應物機制(如補體活化或fc受體結合)的能力或者沒有該能力。因此，效應物功能缺陷抗體具有顯著降低的介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(adcc)和/或補體依賴的細胞毒性(cdc)的能力或者沒有該能力。這種抗體的一個例子是igg4?！癶er2抗體”或“抗-her2抗體”是如上所述的抗體，其與抗原h(huán)er2特異性結合。如本文所使用的，術語“人抗體”意圖包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機或定點誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)。然而，如本文所使用的，術語“人抗體”并不意圖包括如下抗體，其中源自另一種哺乳動物物種(如小鼠)種系的cdr序列被接枝到人框架序列上。如本文所使用的，如果抗體是從使用人免疫球蛋白序列的系統(tǒng)獲得的(例如通過免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠或者通過篩選人免疫球蛋白基因文庫)，并且其中選擇的人抗體在氨基酸序列與由該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列具有至少90％，如至少95％，例如至少96％，如至少97％，例如至少98％，或者如至少99％相同，則人抗體“源自”特定的種系序列。典型地，除了重鏈cdr3，源自特定人種系序列的人抗體與由該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列相比，顯示不超過20個氨基酸的差異，例如不超過10個氨基酸的差異，例如不超過9、8、7、6或5個，例如不超過4、3、2或1個氨基酸的差異。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體是分離的。如本文所使用的，“分離的抗體”意圖是指如下抗體，其基本上不含其他具有不同抗原特異性的抗體(例如，特異性結合her2的分離抗體基本上不含特異性結合除her2以外的抗原的抗體)。然而，特異性結合her2的表位、同種型或變體的分離的抗體可以與其他相關抗原，例如來自其他物種的抗原(例如her2種間同源物)具有交叉反應性。而且，分離的抗體可以基本上不含其他細胞材料和/或化學劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，兩種或多種具有不同抗原結合特異性的“分離的”單克隆抗體被組合在良好定義的組合物中。當本文中在兩種或更多種抗體的上下文中使用時，術語“與...競爭”或“與...交叉競爭”表明，兩種或更多種抗體競爭結合her2，例如在實施例14中所述的測定中競爭結合her2。如果抗體競爭一種或多種其他抗體25％或更高時，抗體“阻斷”或“交叉阻斷”一種或多種其他抗體結合her2，25％-74％代表“部分阻斷”，75％-100％代表“完全阻斷”，優(yōu)選使用實施例14的測定來確定。對于一些抗體對，實施例的測定中的競爭或阻斷只有在將一種抗體包被在平板上，而用另一種進行競爭時才能觀察到，但反之則不行。除非上下文另外定義或否定，當在本文中使用時，術語“與...競爭”，“與...交叉競爭”，“阻斷”或“交叉阻斷”還意圖涵蓋這種抗體對。術語“表位”是指能夠特異性結合抗體的蛋白決定簇。表位通常由分子的表面基團如氨基酸或糖側鏈組成，通常具有特定的三維結構特征，以及特定的帶電特征。構象表位和非構象表位的區(qū)別在于，在變性劑存在的情況下，與前者的結合消失，而與后者的結合不消失。表位可以包括直接參與結合的氨基酸殘基(也稱作表位的免疫顯性組分(immunodominantcomponent))，和其他不直接參與結合的氨基酸殘基，如可以被特異性抗原結合肽有效阻斷或覆蓋的氨基酸殘基(換言之，這些氨基酸殘基位于特異抗原結合肽的足跡(footprint)內)。如本文所使用的，術語“單克隆抗體”是指具有單一分子組成的抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物顯示對特定表位的單一的結合特異性和親和力。因此，術語“人單克隆抗體”是指顯示單一結合特異性的抗體，其具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。人單克隆抗體可以通過雜交瘤產生，雜交瘤包括與永生化細胞融合的、從轉基因或轉染色體非人類動物(例如轉基因小鼠)獲得的b細胞，該動物具有包含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。如本文所使用的，在抗體與預定抗原或表位的結合的上下文中，術語“結合”典型地是其以對應于約10-7m或者更小，如約10-8m或者更小，如約10-9m或者更小，約10-10m或者更小，或者約10-11m或者甚至更小的kd的親和力結合(當通過例如在biacore3000設備中用抗原作為配體、以抗體作為分析物通過表面等離子體共振(spr)技術進行測定時)，并且與除預定抗原或密切相關的抗原之外的非特異性抗原(例如bsa或酪蛋白)結合的其親和力相比，其與預定抗原結合的親和力對應的kd低至少10倍，如至少低100倍，例如至少低1,000倍，如至少低10,000倍，例如至少低100,000倍。親和力低出的量取決于抗體的kd，因此當抗體的kd非常低時(即抗體是高度特異性的)，對抗原的親和力低于對非特異性抗原的親和力的量可以是至少10,000倍。如本文所使用的，術語“kd”(sec-1)是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率常數。所述值也稱作koff值。如本文所使用的，術語“ka”(m-1×sec-1)是指特定抗體-抗原相互作用的結合速率常數。如本文所使用的，術語“kd”(m)是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。如本文所使用的，術語“ka”(m-1)是指特定抗體-抗原相互作用的結合平衡常數，并且通過ka除以kd獲得。如本文所使用的，術語“抑制增殖”(例如涉及細胞，如腫瘤細胞)意圖包括當與her2抗體接觸時，和不與her2抗體接觸的相同細胞的增殖相比，細胞增殖的任何明顯的降低，例如，抑制細胞培養(yǎng)物增殖至少約10％，至少約20％或至少約30％，或至少與參照抗體如曲妥珠單抗一樣，例如，通過實施例，例如實施例16中的測定所確定的。如本文所使用的，術語“促進增殖”(例如涉及細胞，如腫瘤細胞)意圖包括當與her2抗體接觸時，和不與her2抗體接觸的相同細胞的增殖相比，細胞增殖的任何明顯的增加，例如，促進細胞培養(yǎng)物增殖至少約10％，至少約20％或至少約30％，或至少與參照抗體如f5一樣，例如，通過實施例中的測定所確定的。如本文所使用的，當本文中在her2抗體的上下文中使用時，術語“內化”包括其中所述抗體從細胞表面和/或從周圍培養(yǎng)基內化進表達her-2的細胞的任何機制，例如，通過內吞作用。可以使用測量內化抗體的量的直接測定(如，例如，實施例18中所述的fab-cypher5e測定)或其中測定內化的抗體-毒素綴合物的作用的間接測定(如，例如，實施例17的抗-κ-eta′測定)評價抗體的內化。本發(fā)明還提供了包括實施例抗體的vl區(qū)、vh區(qū)、或一個或多個cdr的功能變體的抗體。在her2抗體的上下文中使用的vl、vh或cdr的功能變體仍然允許該抗體保留母體抗體(parentantibody)的親和力(affinity)/親合力(avidity)和/或特異性/選擇性的至少相當部分(至少約50％，60％，70％，80％，90％，95％或更多)，在一些情況下，與母體抗體相比，這種her2抗體可以與更大的親和力、選擇性和/或特異性相關。這些功能變體典型地保留與母體抗體的顯著的序列同一性。兩條序列之間的百分比同一性是序列所共享的相同位置的數量的函數(即，％同源性＝相同位置數/位置的總數×100)，同時考慮缺口的數量和每個缺口的長度，需要引入缺口是為了在兩條序列間進行最佳比對?？梢酝ㄟ^e.meyers和w.miller，comput.appl.biosci4，11-17(1988)的算法(其已經被引入到align程序(2.0版)中)，使用pam120加權殘基表、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分確定兩條核苷酸或氨基酸序列之間的百分比同一性。此外，可以使用needleman和wunsch，j.mol.biol.48，444-453(1970)算法確定兩個氨基酸序列之間的百分比同一性。示例性的變體包括在一個或更多個“變體”氨基酸位置(在對應的共有序列表示為“x”)與圖1和2所示的母體抗體vh和/或vl序列不同的那些。優(yōu)選的變體是其中的新的氨基酸選自在圖1或2中比對序列之一的對應位置的那些氨基酸(關于cdr序列變體的詳細信息，見表4)。另外地或額外地，vh，vl或cdr變體的序列可以主要通過保守的取代而與母體抗體序列的vh，vl或cdr序列不同；例如變體中的至少10個，如至少9、8、7、6、5、4、3、2或1個取代是保守的氨基酸殘基替換。在本發(fā)明的上下文中，可以通過下列表格中反映的氨基酸類型內的取代定義保守取代。對于保守取代的氨基酸殘基類型如本文所使用的，術語“重組宿主細胞”(或簡稱為“宿主細胞”)意圖是指其中已經引入表達載體，例如編碼本發(fā)明的抗體的表達載體的細胞。重組宿主細胞包括例如轉染瘤(transfectomas)，如cho細胞、hek293細胞、ns/0細胞和淋巴細胞。術語“轉基因非人類動物”是指如下非人類動物，其基因組包括一個或多個人重鏈和/或輕鏈轉基因或轉染色體(整合或者不整合進動物的天然基因組dna中)，并且能夠表達完全的人抗體。例如，轉基因小鼠可以具有人輕鏈轉基因，以及人重鏈轉基因或人重鏈轉染色體，使得當用her2抗原和/或表達her2的細胞進行免疫時，小鼠產生人her2抗體?？梢詫⑷酥劓溵D基因整合進小鼠的染色體dna中，如同在轉基因小鼠(例如humab小鼠如hco7，hco12或hco17小鼠)中那樣，或者人重鏈轉基因可以保持在染色體外部，如在wo02/43478中描述的轉染色體km小鼠中那樣。具有更大的人ab基因所有組成成分的類似小鼠包括hco7和hco20(見例如wo2009097006)。這些轉基因和轉染色體小鼠(本文共同地稱為“轉基因小鼠”)能夠通過經歷v-d-j重組和同種型轉換(isotypeswitching)而產生針對給定抗原的人單克隆抗體的多種同種型(如igg，iga，igm，igd和/或ige)。還可以通過引入編碼這種特異性抗體的基因，例如通過將基因與在動物乳汁中表達的基因可操作連接而利用轉基因非人動物用于產生針對特定抗原的抗體?！爸委煛笔侵甘┯糜行Я康谋景l(fā)明的治療活性化合物，用于緩解、減輕、遏制或根除(治愈)癥狀或疾病狀態(tài)的目的?！坝行Я俊被颉爸委熡行Я俊笔侵冈诒匾膭┝亢蜁r間期間，有效獲得期望的治療結果的量。治療有效量的her2抗體可以隨著多種因素而改變，如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，以及her2抗體在個體內引發(fā)期望的應答的能力。治療有效量還是這樣的量，其中抗體或抗體部分的治療有益效果超過其任何毒性或有害效果?！翱?獨特型”抗體是如下抗體，其識別通常與抗體的抗原結合位點關聯(lián)的獨特決定簇。本發(fā)明的進一步的方面和實施方案如上所述，在第一個方面，本發(fā)明涉及結合her2的單克隆抗體?？梢岳缤ㄟ^kohler等，nature256，495(1975)首先描述的雜交瘤方法產生，或者可以通過重組dna方法產生本發(fā)明的單克隆抗體。還可以使用例如clackson等，nature352，624-628(1991)和marks等，j.mol.biol.222，581-597(1991)中描述的技術從噬菌體抗體文庫分離單克隆抗體?？梢詮娜魏魏线m的來源獲得單克隆抗體。因此，例如，可以從雜交瘤獲得單克隆抗體，其中所述雜交瘤可以從用感興趣的抗原免疫的小鼠獲得的小鼠脾b細胞制備，該感興趣的抗原的形式可以是例如在表面上表達抗原的細胞，或者是編碼感興趣的抗原的核酸。還可以從雜交瘤獲得單克隆抗體，所述雜交瘤源自被免疫的人或非人哺乳動物(如大鼠、狗、靈長動物等)的表達抗體的細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是人抗體?？梢允褂脭y帶部分人免疫系統(tǒng)而非小鼠系統(tǒng)的轉基因或轉染色體小鼠產生針對her2的人單克隆抗體。這種轉基因和轉染色體小鼠包括在本文分別被稱為humab小鼠和km小鼠的小鼠，并在本文共同地被稱為“轉基因小鼠”。humab小鼠包含編碼未重排的人重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列，連同使內源μ和κ鏈基因座失活的靶向的突變的人免疫球蛋白基因迷你基因座(miniloci)(lonberg，n.等，nature368，856-859(1994))。因此，小鼠顯示降低的小鼠igm或κ的表達，并且對免疫應答中，引入的人重鏈和輕鏈轉基因經歷類型轉換(classswitching)和體細胞突變(somaticmutation)從而產生高親和力人igg，κ單克隆抗體(lonberg，n.等.(1994)，同上；綜述見lonberg，n.handbookofexperimentalpharmacology113，49-101(1994)，lonberg，n.和huszar，d.，intern.rev.immunol.vol.1365-93(1995)以及harding，f.和lonberg，n.ann.n.y.acad.sci764536-546(1995))。taylor，l.等，nucleicacidsresearch20，6287-6295(1992)，chen，j.等，internationalimmunology5，647-656(1993)，tuaillon等，j.immunol.152，2912-2920(1994)，taylor，l.等，internationalimmunology6，579-591(1994)，fishwild，d.等，naturebiotechnology14，845-851(1996)中詳細描述了humab小鼠的制備。也參見us5,545,806，us5,569,825，us5,625,126，us5,633,425，us5,789,650，us5,877,397，us5,661,016，us5,814,318，us5,874,299，us5,770,429，us5,545,807，wo98/24884，wo94/25585，wo93/1227，wo92/22645，wo92/03918和wo0i/09187.hco7，hco12，hco17和hco20小鼠在它們的內源輕鏈(κ)基因中具有jkd破壞(jkddisruption)(如chen等，emboj.12，821-830(1993)中所述)，在它們的內源重鏈基因中具有cmd破壞(如wo01/14424的實施例1中所述)，并具有kco5人κ輕鏈轉基因(如fishwild等，naturebiotechnology14，845-851(1996)中所述)。此外，hco7小鼠具有hco7人重鏈轉基因(如us5,770,429中所述)，hco12小鼠具有hco12人重鏈轉基因(如wo01/14424的實施例2中所述)，hco17小鼠具有hco17人重鏈轉基因(如wo01/09187的實施例2中所述)以及hco20小鼠具有hco20人重鏈轉基因。產生的小鼠在對于內源的小鼠重鏈和κ輕鏈基因座的破壞純合的背景中表達人免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈轉基因。在km小鼠品系中，已經如chen等，emboj.12，811-820(1993)中所述將內源小鼠κ輕鏈基因純合地破壞，并且已經如wo01/09187的實施例1所述將內源小鼠重鏈基因純合地破壞。如fishwild等，naturebiotechnology14，845-851(1996)中所述，該小鼠品系攜帶人κ輕鏈轉基因kco5。該小鼠品系還攜帶由如wo02/43478中所述的染色體14片段hcf(sc20)組成的人重鏈轉染色體。可以通過如wo/2009/097006中所述通過將hco12與kco5[j/k](balb)交配而產生hco12-balb/c小鼠?？梢愿鶕募夹g使用來自這些轉基因小鼠的脾細胞來產生分泌人單克隆抗體的雜交瘤。進一步，可以使用本領域公知的技術通過展示型技術(包括但不限于，噬菌體展示、逆轉錄病毒展示、核糖體展示和其他技術)鑒別本發(fā)明的人抗體或來自其他物種的本發(fā)明的抗體，產生的分子可以經受額外的成熟過程，例如親和力成熟，因為這些技術是本領域公知的(見例如hoogenboom等，j.mol.biol.227，381(1991)(噬菌體展示)，vaughan等，naturebiotech14，309(1996)(噬菌體展示)，hanes和plucthau，pnasusa94，4937-4942(1997)(核糖體展示)，parmley和smith，gene73，305-318(1988)(噬菌體展示)，scotttibs17，241-245(1992)，cwirla等，pnasusa87，6378-6382(1990)，russel等，nucl.acidsresearch21，1081-1085(1993)，hogenboom等，immunol.reviews130，43-68(1992)，chiswell和mccaffertytibtech10，80-84(1992)，和us5,733,743)。如果使用展示技術產生非人的抗體，則這些抗體可以進行人源化。交叉阻斷組i的抗體在本發(fā)明的抗體一個方面，抗體與本文所述的交叉阻斷組1的新的人抗體中的一種或多種結合her2上的相同表位。在一個實施方案中，當如實施例14中所述測定時，抗體交叉阻斷曲妥珠單抗與可溶性her2的結合。在一個實施方案中，抗體與含有包含seqidno：1的序列的vh區(qū)和包含seqidno：5的序列的vl區(qū)的參照抗體(169)結合相同的表位。在一個實施方案中，抗體與含有包含seqidno：8的序列的vh區(qū)和包含seqidno：12的序列的vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位。在一個實施方案中，抗體與含有包含seqidno：15的序列的vh區(qū)和包含seqidno：84的序列的vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位。在一個實施方案中，抗體與包含選自如下的vh和vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位：a)包含序列seqidno：77的vh區(qū)和包含序列seqidno：78的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：79的vh區(qū)和包含序列seqidno：80的vl區(qū)；c)包含序列seqidno：81的vh區(qū)和包含序列seqidno：82的vl區(qū)；d)包含序列seqidno：83的vh區(qū)和包含序列seqidno：84的vl區(qū)；e)包含序列seqidno：85的vh區(qū)和包含序列seqidno：86的vl區(qū)；和f)包含序列seqidno：87的vh區(qū)和包含序列seqidno：88的vl區(qū)。在本發(fā)明的抗體的另一個額外的或另外的方面，抗體結合her2，包含與本文所述的新的抗體的序列相似或相同的vhcdr3，vh區(qū)和/或vl區(qū)序列。在一個實施方案中，抗體包含具有選自如下的序列的vhcdr3區(qū)：seqidno：11，任選地，其中vh區(qū)源自ighv3-21-1種系序列；seqidno：130，如seqidno：18的序列，任選地，其中vh區(qū)源自ighv1-69-04種系序列；seqidno：133，如seqidno：4的序列，任選地，其中vh區(qū)源自ighv1-18-1種系序列；或者在一個實施方案中，抗體包含如圖1中所示的抗體123，161或124中一種的vhcdr3區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv1-18-1種系。在一個實施方案中，抗體包含選自如下的vh區(qū)a)包含seqidnos：9，127和11的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：9，10和11的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)；任選地，其中vh區(qū)源自ighv3-23-1種系；b)包含seqidnos：128，129和130的cdr1，cdr2和cdr3序列如分別地seqidnos：16，17和18的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv1-69-04種系；以及c)包含分別地seqidnos：131，132和133的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：2，3和4的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv1-18-1種系。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)選自前述實施方案(a)或(b)，所述vl區(qū)包含分別地seqidno：13，xas(其中x是a或v)和seqidno：155的cdr1，cdr2和cdr3序列，如選自seqidnos：13或20的cdr1，是aas或vas的cdr2和選自seqidnos：14和21的cdr3序列；分別地，任選地，其中vl區(qū)源自igkv1-12-01種系。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)是前述實施方案(c)，所述vl區(qū)包含分別地seqidno：6，dxs(其中x＝a或t)，和seqidno：156的cdr1，cdr2和cdr3序列，任選地，其中所述vl區(qū)源自igkv3-11-01。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)包含分別地seqidnos：2，3和4的cdr1，cdr2和cdr3；所述vl區(qū)包含分別地seqidnos：6，das，和seqidno：7的cdr1，cdr2和cdr3。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)包含分別地seqidnos：9，10和11的cdr1，cdr2和cdr3；所述vl區(qū)包含分別地seqidnos：13，aas，和seqidno：14的cdr1，cdr2和cdr3。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)包含分別地seqidnos：16，17和18的cdr1，cdr2和cdr3；所述vl區(qū)包含分別地seqidnos：20，vas，和seqidno：21的cdr1，cdr2和cdr3。在單獨的實施方案中，抗體包括：a)包含序列seqidno：1的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：5的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：8的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：12的vl區(qū)；c)包含序列seqidno：15的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：19的vl區(qū)；d)包含序列seqidno：77的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：78的vl區(qū)；e)包含序列seqidno：79的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：80的vl區(qū)；f)包含序列seqidno：81的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：82的vl區(qū)；g)包含序列seqidno：83的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：84的vl區(qū)；h)包含序列seqidno：85的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：86的vl區(qū)；i)包含序列seqidno：87的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：88的vl區(qū)；和/或j)所述抗體中任一種的變體，其中所述變體優(yōu)選地具有最多1，2或3個氨基酸修飾，更優(yōu)選氨基酸取代，如保守的氨基酸取代，以及其中新的氨基酸是在圖1或2中比對的序列的相同位置處，尤其是在對應的共有序列中通過“x”表示的位置處的氨基酸的取代。交叉阻斷組2的抗體在本發(fā)明的一個方面，抗體與本文所述的交叉阻斷組2的新的人抗體中的一種或多種結合her2上的相同表位。在一個實施方案中，當如實施例14中所述測定時，抗體交叉阻斷帕妥珠單抗與可溶性her2的結合。在一個實施方案中，抗體與含有包含序列seqidno：22的vh區(qū)和包含序列seqidno：26的vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位。在一個實施方案中，抗體與含有包含序列seqidno：29的vh區(qū)和包含序列seqidno：32的vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位。在一個實施方案中，抗體與含有包含序列seqidno：35的vh區(qū)和包含序列seqidno：39的vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位。在一個實施方案中，抗體與包含選自如下的vh和vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位：a)包含序列seqidno：89的vh區(qū)和包含序列seqidno：90的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：91的vh區(qū)和包含序列seqidno：92的vl區(qū)；c)包含序列seqidno：93的vh區(qū)和包含序列seqidno：94的vl區(qū)；d)包含序列seqidno：95的vh區(qū)和包含序列seqidno：96的vl區(qū)；e)包含序列seqidno：97的vh區(qū)和包含序列seqidno：98的vl區(qū)；f)包含序列seqidno：99的vh區(qū)和包含序列seqidno：100的vl區(qū)。g)包含序列seqidno：101的vh區(qū)和包含序列seqidno：102的vl區(qū)；h)包含序列seqidno：103的vh區(qū)和包含序列seqidno：104的vl區(qū)；i)包含序列seqidno：105的vh區(qū)和包含序列seqidno：106的vl區(qū)；和j)包含序列seqidno：107的vh區(qū)和包含序列seqidno：108的vl區(qū)。在本發(fā)明的抗體的另一個額外的或另外的方面，抗體結合her2，包含與本文所述的新的抗體的序列相似或相同的vhcdr3，vh區(qū)和/或vl區(qū)序列。在一個實施方案中，抗體包含具有選自如下的序列的vhcdr3區(qū)：seqidno：136，如seqidno：25的序列，任選地，其中vh區(qū)源自ighv4-34-1種系序列；seqidno：139，如seqidno：31的序列，任選地，其中vh區(qū)源自ighv4-34-01種系序列；和seqidno：142，如seqidno：38的序列，任選地，其中vh區(qū)源自ighv3-30-01種系序列。在一個實施方案中，抗體包含如圖1中所示的抗體001，143，019，021，027，032，035，036，054或094中一種的vhcdr3區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv4-34-1種系。在一個實施方案中，抗體包含選自如下的vh區(qū)a)包含seqidnos：134，135和136的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：23，24和25的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)；任選地，其中vh區(qū)源自ighv4-34-1種系；b)包含seqidnos：137，138和139的cdr1，cdr2和cdr3序列如分別地seqidnos：30，163和31的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv4-34-01種系；以及c)包含分別地seqidnos：140，141和142的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：36，37和38的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv3-30-01種系。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)選自前述實施方案(a)，所述vl區(qū)包含分別地seqidno：157，aas，和seqidno：164的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：27，aas，和seqidno：28的cdr1，cdr2和cdr3序列；分別地，任選地，其中vl區(qū)源自igkv1d-16-01種系。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)選自前述實施方案(b)，所述vl區(qū)包含分別地seqidno：33，ax1x2(其中x1是a或t，優(yōu)選a；x2是s或f，優(yōu)選s)，和seqidno：158的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：33，aas，和seqidno：34的cdr1，cdr2和cdr3序列；分別地，任選地，其中vl區(qū)源自igkv1d-16-01種系。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)是前述實施方案(c)，所述vl區(qū)包含分別地seqidno：40，das，和seqidno：41的cdr1，cdr2和cdr3序列，任選地，其中所述vl區(qū)源自igkv3-11-01。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)包含分別地seqidnos：23，24和25的cdr1，cdr2和cdr3；所述vl區(qū)包含分別地seqidnos：27，aas，和seqidno：28的cdr1，cdr2和cdr3。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)包含分別地seqidnos：30，163和31的cdr1，cdr2和cdr3；所述vl區(qū)包含分別地seqidnos：33，aas，和seqidno：34的cdr1，cdr2和cdr3。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)包含分別地seqidnos：36，37和38的cdr1，cdr2和cdr3；所述vl區(qū)包含分別地seqidnos：40，das，和seqidno：41的cdr1，cdr2和cdr3。在單獨的實施方案中，抗體包括：a)包含序列seqidno：22的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：26的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：29的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：32的vl區(qū)；c)包含序列seqidno：35的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：39的vl區(qū)；d)包含序列seqidno：89的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：90的vl區(qū)；e)包含序列seqidno：91的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：92的vl區(qū)；f)包含序列seqidno：93的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：94的vl區(qū)；g)包含序列seqidno：95的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：96的vl區(qū)；h)包含序列seqidno：97的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：98的vl區(qū)；i)包含序列seqidno：99的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：100的vl區(qū)；j)包含序列seqidno：101的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：102的vl區(qū)；k)包含序列seqidno：103的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：104的vl區(qū)；l)包含序列seqidno：105的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：106的vl區(qū)；m)包含序列seqidno：106的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：108的vl區(qū)；和/或n)所述抗體中任一種的變體，其中所述變體優(yōu)選地具有最多1，2或3個氨基酸修飾，更優(yōu)選氨基酸取代，如保守的氨基酸取代，以及其中新的氨基酸是在圖1或2中比對的序列的相同位置處，尤其是在對應的共有序列中通過“x”表示的位置處的氨基酸的取代。交叉阻斷組3的抗體在本發(fā)明的一個方面，抗體與本文所述的交叉阻斷組3的新的人抗體中的一種或多種結合her2上的相同表位。在一個實施方案中，當如實施例14中所述測定時，抗體交叉阻斷f5和/或c5與可溶性her2的結合。在一個實施方案中，抗體與含有包含序列seqidno：46的vh區(qū)和包含序列seqidno：49的vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位。在一個實施方案中，抗體與含有包含序列seqidno：49的vh區(qū)和包含序列seqidno：53的vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位。在一個實施方案中，抗體與含有包含序列seqidno：56的vh區(qū)和包含序列seqidno：60的vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位。在一個實施方案中，抗體與含有包含序列seqidno：63的vh區(qū)和包含序列seqidno：67的vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位。在一個實施方案中，抗體與含有包含序列seqidno：70的vh區(qū)和包含序列seqidno：74的vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位。在一個實施方案中，抗體與包含選自如下的vh和vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位：k)包含序列seqidno：109的vh區(qū)和包含序列seqidno：110的vl區(qū)；1)包含序列seqidno：111的vh區(qū)和包含序列seqidno：112的vl區(qū)；m)包含序列seqidno：113的vh區(qū)和包含序列seqidno：114的vl區(qū)；n)包含序列seqidno：115的vh區(qū)和包含序列seqidno：116的vl區(qū)；o)包含序列seqidno：117的vh區(qū)和包含序列seqidno：118的vl區(qū)；p)包含序列seqidno：119的vh區(qū)和包含序列seqidno：120的vl區(qū)q)包含序列seqidno：121的vh區(qū)和包含序列seqidno：122的vl區(qū)；r)包含序列seqidno：123的vh區(qū)和包含序列seqidno：124的vl區(qū)；和s)包含序列seqidno：125的vh區(qū)和包含序列seqidno：126的vl區(qū)。在本發(fā)明的抗體的另一個額外的或另外的方面，抗體結合her2，包含與本文所述的新的抗體的序列相似或相同的vhcdr3，vh區(qū)和/或vl區(qū)序列。在一個實施方案中，抗體包含具有選自如下的序列的vhcdr3區(qū)：seqidno：148，如seqidno：48的序列，任選地，其中vh區(qū)源自ighv5-51-01種系序列；seqidno：52，任選地，其中vh區(qū)源自ighv5-51-01種系序列；seqidno：145，如seqidno：59的序列，任選地，其中vh區(qū)源自ighv3-23-01種系序列；seqidno：154，如seqidno：66的序列，任選地，其中vh區(qū)源自ighv3-30-03-01種系序列；和seqidno：151，如seqidno：73的序列，任選地，其中vh區(qū)源自ighv1-18-01種系序列。在一個實施方案中，抗體包含如圖1中所示的抗體105，100，125或162中一種的vhcdr3區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv3-23-1種系。在一個實施方案中，抗體包含如圖1中所示的抗體033，160，166，152或167中一種的vhcdr3區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv3-30-3-01種系。在一個實施方案中，抗體包含選自如下的vh區(qū)a)包含seqidnos：146，147和148的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：43，44和45的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)；任選地，其中vh區(qū)源自ighv5-51-01種系；b)包含seqidnos：149，51和52的cdr1，cdr2和cdr3序列如分別地seqidnos：50，51和52的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv5-51-01種系；c)包含分別地seqidnos：143，144和145的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：57，58和59的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv3-23-01種系；d)包含seqidnos：152，153和154的cdr1，cdr2和cdr3序列如分別地seqidnos：64，65和66的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv3-30-03-01種系；和e)包含分別地seqidnos：71，150和151的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：71，72和73的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv1-18-01種系。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)選自前述實施方案(a)，所述vl區(qū)包含分別地seqidno：47，aas，和seqidno：48的cdr1，cdr2和cdr3序列；分別地，任選地，其中所述vl區(qū)源自igkv1d-8-01種系。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)選自前述實施方案(b)，所述vl區(qū)包含分別地seqidno：54，aas，和seqidno：55的cdr1，cdr2和cdr3序列；分別地，任選地，其中所述vl區(qū)源自igkv1d-16-01種系。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)是前述實施方案(c)，所述vl區(qū)包含分別地seqidno：159，aas，和seqidno：160的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：61，aas，和seqidno：62的vlcdr1，cdr2和cdr3序列，任選地，其中vl區(qū)源自igkv1d-16-01。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)是前述實施方案(d)，所述vl區(qū)包含分別地seqidno：161，xas(其中x＝d或a，優(yōu)選d)，和seqidno：162的cdr1，cdr2和cdr3序列，如seqidno：68，das和69的vlcdr序列，任選地，其中所述vl區(qū)源自igkv1d-16-01。在一個實施方案中，抗體包含vh區(qū)和vl區(qū)，所述vh區(qū)是前述實施方案(e)，所述vl區(qū)包含seqidno：75，das，和seqidno：76的cdr1，cdr2和cdr3序列，分別地，任選地，其中所述vl區(qū)源自igkv3-11-01。在一個實施方案中，抗體含有包含分別地seqidnos：43，44和45的cdr1，cdr2和cdr3的vh區(qū)；以及包含分別地seqidnos：47，aas，和seqidno：48的cdr1，cdr2和cdr3的vl區(qū)。在一個實施方案中，抗體含有包含分別地seqidnos：50，51和52的cdr1，cdr2和cdr3的vh區(qū)；以及包含分別地seqidnos：54，aas，和seqidno：55的cdr1，cdr2和cdr3的vl區(qū)。在一個實施方案中，抗體含有包含分別地seqidnos：57，58和59的cdr1，cdr2和cdr3的vh區(qū)；以及包含分別地seqidnos：60，aas，和seqidno：61的cdr1，cdr2和cdr3的vl區(qū)。在一個實施方案中，抗體含有包含分別地seqidnos：64，65和66的cdr1，cdr2和cdr3的vh區(qū)；以及包含分別地seqidnos：68，das，和seqidno：69的cdr1，cdr2和cdr3的vl區(qū)。在一個實施方案中，抗體含有包含分別地seqidnos：71，72和73的cdr1，cdr2和cdr3的vh區(qū)；以及包含分別地seqidnos：75，das，和seqidno：76的cdr1，cdr2和cdr3的vl區(qū)。在單獨的實施方案中，抗體包括：a)包含序列seqidno：46的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：49的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：49的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：53的vl區(qū)；c)包含序列seqidno：56的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：60的vl區(qū)；d)包含序列seqidno：63的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：67的vl區(qū)；e)包含序列seqidno：70的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：74的vl區(qū)；f)包含序列seqidno：109的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：110的vl區(qū)；g)包含序列seqidno：111的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：112的vl區(qū)；h)包含序列seqidno：113的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：114的vl區(qū)；i)包含序列seqidno：115的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：116的vl區(qū)；j)包含序列seqidno：117的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：118的vl區(qū)；k)包含序列seqidno：119的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：120的vl區(qū)1)包含序列seqidno：121的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：122的vl區(qū)；m)包含序列seqidno：123的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：124的vl區(qū)；o)包含序列seqidno：125的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：126的vl區(qū)；和/或p)所述抗體中任一種的變體，其中所述變體優(yōu)選地具有最多1，2或3個氨基酸修飾，更優(yōu)選氨基酸取代，如保守的氨基酸取代，以及其中新的氨基酸是在圖1或2中比對的序列的相同位置處，尤其是在對應的共有序列中通過“x”表示的位置處的氨基酸的取代。雙特異性抗體在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，包含(i)第一抗體，包含本文定義的抗體的抗原結合區(qū)，例如，交叉阻斷1，2或3的抗體的抗原結合區(qū)，或包含序列的vh和vl區(qū)，和(ii)第二抗體，包含與cd3結合的抗體的抗原結合區(qū)。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，包含(i)第一抗體，包含本文定義的抗體的抗原結合區(qū)或包含序列的vh和vl區(qū)，和(ii)第二抗體，包含本文定義的抗體的抗原結合區(qū)或包含序列的vh和vl區(qū)，其中所述第一抗原結合區(qū)與所述第二抗原結合區(qū)相比結合不同的表位。在一個實施方案中，第一抗體包含vh區(qū)，所述vh區(qū)包含本文定義的交叉阻斷1，2或3的抗體如seqidno：4，25或66(或)的cdr3序列，或seqidno：168的cdr3序列。在一個實施方案中，第一抗體包含vh區(qū)，所述vh區(qū)包含本文定義的交叉阻斷1，2或3的抗體的cdr1，cdr2和cdr3序列，如seqidnos：2，3和4的cdr1，cdr2，和cdr3序列，或seqidnos：23，24和25的cdr1，cdr2和cdr3序列，或seqidnos：64，65和66的cdr1，cdr2和cdr3序列，或seqidnos：166，167和168的cdr1，cdr2和cdr3序列。在一個進一步或另外的實施方案中，第一抗體包含vh區(qū)，所述vh區(qū)包含本文定義的交叉阻斷1，2或3的抗體的cdr3序列，如seqidno：11或seqidno：18的交叉阻斷1的抗體的cdr3序列；或seqidno：31，或seqidno：38的交叉阻斷2的抗體的cdr3序列，或seqidno：45，或seqidno：52，或seqidno：59，或seqidno：73的交叉阻斷3的抗體的cdr3序列。在一個實施方案中，第一抗體包含vh區(qū)，所述vh區(qū)包含本文定義的交叉阻斷1，2或3的抗體的cdr1，cdr2和cdr3序列，如seqidnos：2，3和4的cdr1，cdr2，和cdr3序列，或seqidnos：23，24和25的cdr1，cdr2和cdr3序列，或seqidnos：64，65和66的cdr1，cdr2和cdr3序列，或seqidnos：166，167和168的cdr1，cdr2和cdr3序列。在一個實施方案中，第一抗體含有包含本文定義的交叉阻斷1，2或3的抗體的cdr1，cdr2，和cdr3序列的vh區(qū)和包含本文定義的交叉阻斷1，2或3的抗體的cdr1，cdr2，和cdr3序列的vl區(qū)。在一個進一步或另外的實施方案中，第一抗體包含vh區(qū)，所述vh區(qū)包含本文定義的交叉阻斷1，2或3的抗體的cdr1，cdr2，和cdr3序列，如seqidnos：9，10和11，或seqidnos：16，17和18的交叉阻斷1的抗體的cdr1，cdr2，和cdr3序列；或seqidnos：30，163和31，或seqidnos：36，37和38的交叉阻斷2的抗體的cdr1，cdr2，和cdr3序列，或seqidnos：43，44和45，或seqidnos：50，51和52，或seqidnos：57，58和59，或seqidnos：71，72和73的交叉阻斷3的抗體的cdr1，cdr2，和cdr3序列。在一個實施方案中，第一抗體包含選自如下的vh區(qū)和vl區(qū)：a)分別地，包含seqidnos：2，3和4的cdr1，cdr2，和cdr3序列的vh區(qū)；和包含seqid：6，gas和seqidno：7的cdr1，cdr2，和cdr3序列的vl區(qū)；b)分別地，包含seqidnos：23，24和25的cdr1，cdr2，和cdr3序列的vh區(qū)；和包含seqid：27，aas和seqidno：28的cdr1，cdr2，和cdr3序列的vl區(qū)；c)分別地，包含seqidnos：64，65和66的cdr1，cdr2，和cdr3序列的vh區(qū)；和包含seqid：68，das和seqidno：69的cdr1，cdr2，和cdr3序列的vl區(qū)；和d)分別地，包含seqidnos：166，167和168的cdr1，cdr2，和cdr3序列的vh區(qū)；和包含seqid：169，gas和seqidno：170的cdr1，cdr2，和cdr3序列的vl區(qū)。在一個進一步或另外的實施方案中，第一抗體包含選自如下的vh區(qū)和vl區(qū)：a)包含seqidnos：9，127和11的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：9，10和11的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)；任選地，其中vh區(qū)源自ighv3-23-1種系；b)包含seqidnos：128，129和130的cdr1，cdr2和cdr3序列如分別地seqidnos：16，17和18的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv1-69-04種系；和c)包含seqidnos：137，138和139的cdr1，cdr2和cdr3序列如分別地seqidnos：30，163和31的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv4-34-01種系；和d)包含分別地seqidnos：140，141和142的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：36，37和38的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv3-30-01種系。e)包含seqidnos：146，147和148的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：43，44和45的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)；任選地，其中vh區(qū)源自ighv5-51-01種系；f)包含seqidnos：149，51和52的cdr1，cdr2和cdr3序列如分別地seqidnos：50，51和52的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv5-51-01種系；g)包含分別地seqidnos：143，144和145的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：57，58和59的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv3-23-01種系；h)包含分別地seqidnos：71，150和151的cdr1，cdr2和cdr3序列如seqidnos：71，72和73的cdr1，cdr2和cdr3序列的vh區(qū)，任選地，其中vh區(qū)源自ighv1-18-01種系。在一個實施方案中，第二抗體是前面對于第一抗體所述的實施方案中的一種，但是其中，所述第二抗體與所述第一抗體相比結合不同的表位。在一個實施方案中，第二抗體是cd3抗體。在一個實施方案中，cd3抗體可以是含有包含序列seqidno：171的vh區(qū)和包含序列seqidno：172的vl區(qū)的抗體。cd3抗體的另一個例子是含有包含序列seqidno：173的vh區(qū)和包含序列seqidno：174的vl區(qū)的抗體。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，包括(i)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第一抗體，所述抗體包含或的vh和vl區(qū)，所述抗體包含igg1野生型fc區(qū)，其中ch3區(qū)包含350位的ile，370位的thr，和405位的leu，和(ii)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第二抗體，所述抗體包含或的vh和vl區(qū)，所述抗體包含igg1野生型fc區(qū)，其中ch3區(qū)包含409位的arg。實施例中公開了特定的實施方案。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，包括(i)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第一抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：164的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：165的氨基酸序列，任選地，其中所述第一抗體包含igg1，кfc區(qū)，其中ch3區(qū)包含350位的ile，370位的thr，和405位的leu；和(ii)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第二抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：1的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：5的氨基酸序列，任選地，其中所述第二抗體包含igg1，κfc區(qū)，所述igg1，κfc區(qū)具有409位的arg。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，包括(i)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第一抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：22的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：26的氨基酸序列，任選地，其中所述第一抗體包含igg1，κfc區(qū)，其中ch3區(qū)包含350位的ile，370位的thr，和405位的leu；和(ii)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第二抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：164的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：165的氨基酸序列，任選地，其中所述第二抗體包含igg1，κfc區(qū)，所述igg1，κfc區(qū)具有409位的arg。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，包括(i)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第一抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：22的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：26的氨基酸序列，任選地，其中所述第一抗體包含igg1，κfc區(qū)，其中ch3區(qū)包含350位的ile，370位的thr，和405位的leu；和(ii)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第二抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：63的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：37的氨基酸序列，任選地，其中所述第二抗體包含igg1，κfc區(qū)，所述igg1，κfc區(qū)具有409位的arg。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，包括(i)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第一抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：22的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：26的氨基酸序列，任選地，其中所述第一抗體包含igg1，кfc區(qū)，其中ch3區(qū)包含350位的ile，370位的thr，和405位的leu；和(ii)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第二抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：1的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：5的氨基酸序列，任選地，其中所述第二抗體包含igg1，κfc區(qū)，所述igg1，κfc區(qū)具有409位的arg。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，包括(i)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第一抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：63的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：67的氨基酸序列，任選地，其中所述第一抗體包含igg1，кfc區(qū)，其中ch3區(qū)包含350位的ile，370位的thr，和405位的leu；和(ii)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第二抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：164的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：165的氨基酸序列，任選地，其中所述第二抗體包含igg1，кfc區(qū)，所述igg1，кfc區(qū)具有409位的arg。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，包括(i)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第一抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：63的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：67的氨基酸序列，任選地，其中所述第一抗體包含igg1，кfc區(qū)，其中ch3區(qū)包含350位的ile，370位的thr，和405位的leu；和(ii)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第二抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：1的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：5的氨基酸序列，任選地，其中所述第二抗體包含igg1，κfc區(qū)，所述igg1，κfc區(qū)具有409位的arg。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，包括(i)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第一抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：63的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：67的氨基酸序列，任選地，其中所述第一抗體包含igg1，κfc區(qū)，所述igg1，κfc區(qū)具有409位的arg，或297位的gln，或409位的arg和297位的gln；和(ii)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第二抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：171的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：172的氨基酸序列(yth12.5)，任選地，其中所述第二抗體包含igg1，кfc區(qū)，所述igg1，кfc區(qū)具有297位的gln，或405位的leu，或297位的gln和405位的leu。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，包括(i)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第一抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：1的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：5的氨基酸序列，任選地，其中所述第一抗體包含igg1，кfc區(qū)，所述igg1，кfc區(qū)具有409位的arg；和(ii)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第二抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：171的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：172的氨基酸序列(yth12.5)，任選地，其中所述第二抗體包含igg1，кfc區(qū)，所述igg1，кfc區(qū)具有297位的gln，或405位的leu，或297位的gln和405位的leu。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，包括(i)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第一抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：63的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：67的氨基酸序列，任選地，其中所述第一抗體包含igg1，кfc區(qū)，所述igg1，кfc區(qū)具有409位的arg，或297位的gln，或409位的arg和297位的gln；和(ii)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第二抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：173的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：174的氨基酸序列(huclb-t3/4)，任選地，其中所述第二抗體包含igg1，кfc區(qū)，所述igg1，кfc區(qū)具有297位的gln，或405位的leu，或297位的gln和405位的leu。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，包括(i)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第一抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：1的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：5的氨基酸序列，任選地，其中所述第一抗體包含igg1，кfc區(qū)，所述igg1，кfc區(qū)具有409位的arg；和(ii)具有fc區(qū)和vh和vl序列的第二抗體，其中所述vh區(qū)包含seqidno：173的氨基酸序列，所述vl區(qū)包含seqidno：174的氨基酸序列(huclb-t3/4)，任選地，其中所述第二抗體包含igg1，кfc區(qū)，所述igg1，κfc區(qū)具有297位的gln，或405位的leu，或297位的gln和405位的leu。cd3抗體是具有包含序列seqidno：171的vh區(qū)(vhyth12.5)和包含序列seqidno：172的vl區(qū)(vlyth12.5)的抗體。另一個例子是具有包含序列seqidno：173的vh區(qū)(vhhuclb-t3/4)和包含序列seqidno：174的vl區(qū)(vlhuclb-t3/4)的cd3抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體可以選自：igg1-005-itl×igg1-169-k409r，igg1-025-itl×igg1-005-k409r，igg1-025-itl×igg1-153-k409r，igg1-025-itl×igg1-169-k409r，igg1-153-itl×igg1-005-k409r；和igg1-153-itl×igg1-169-k409r，其中igg1-005-itl意味著具有350位的ile，370位的thr和405位的leu的igg1，κ，igg1-005-k409r意味著具有409位的arg的igg1，κ，igg1-025-itl意味著具有350位的ile，370位的thr，和405位的leu的igg1，κ，igg1-153-itl意味著具有包含350位的ile，370位的thr和405位的leu的igg1，κ，igg1-153-k409r意味著具有409位的arg的igg1，κ，igg1-169-k409r意味著具有409位的arg的igg1，κ，并且其中的粗體數字是指本文所述的具有包含表1所示的序列的vh和vl區(qū)的抗體，對于實施例21中的；即seqidnos：164和165。在一個實施方案中，雙特異性抗體可以選自：igg1-her2-153-k409r×igg1-yth12.5-f405l，igg1-her2-153-k409r×igg1-ythl2.5-n297q-f405l，igg1-her2-153-k409r×igg1-hu-clb-t3/4-f405l，igg1-her2-153-k409r×igg1-hu-clb-t3/4-n297q-f405l，igg1-her2-153-n297q-k409r×igg1-yth12.5-f405l，igg1-her2-153-n297q-k409r×igg1-yth12.5-n297q-f405l，igg1-her2-153-n297q-k409r×igg1-hu-clb-t3/4-f405l，igg1-her2-153-n297q-k409r×igg1-hu-clb-t3/4-n297q-f405l，igg1-her2-169-k409r×igg1-hu-clb-t3/4-f405l，igg1-her2-169-k409r×igg1-hu-clb-t3/4-n297q-f405l，igg1-her2-169-k409r×igg1-yth12.5-f405l和igg1-her2-169-k409r×igg1-yth12.5-n297q-f405l。組1、2和3抗體和雙特異性抗體的功能特性在本發(fā)明的抗體另一個方面，抗體與本文所述的新的組1，2或3抗體中的一種或多種結合相同的her2表位，優(yōu)選地，當如實施例14中所述測定時；以及其進一步特征在于，如實施例12，13，15，16，17，18和19中所述測定的一種或多種特性。在一個實施方案中，當如實施例12中所述測定時，her2抗體在與a431細胞結合中具有比曲妥珠單抗更低的ec50值(半數最大有效濃度)，優(yōu)選ec50值低于0.80μg/ml，0.50μg/ml，或0.30μg/ml，優(yōu)選地，所述her2抗體與包含選自如下的vh和vl區(qū)的至少一種參照抗體結合相同的表位：a)包含序列seqidno：1的vh區(qū)和包含序列seqidno：5的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：15的vh區(qū)和包含序列seqidno：19的vl區(qū)；c)包含序列seqidno：22的vh區(qū)和包含序列seqidno：26的vl區(qū)；d)包含序列seqidno：29的vh區(qū)和包含序列seqidno：32的vl區(qū)；e)包含序列seqidno：46的vh區(qū)和包含序列seqidno：49的vl區(qū)；f)包含序列seqidno：49的vh區(qū)和包含序列seqidno：53的vl區(qū)；g)包含序列seqidno：56的vh區(qū)和包含序列seqidno：60的vl區(qū)；h)包含序列seqidno：63的vh區(qū)和包含序列seqidno：67的vl區(qū)；和i)包含序列seqidno：70的vh區(qū)和包含序列seqidno：74的vl區(qū)。在一個額外或另外的實施方案中，當如實施例13中所述測定時，抗-her2抗體特異性結合her2陽性的獼猴上皮細胞，優(yōu)選地，所述抗-her2抗體與包含vh和vl區(qū)的至少一種參照抗體結合相同的表位，所述vh和vl區(qū)選自抗體169，050，084，025，091，129，127，159，098，153和132中任一種的vh和vl區(qū)。在一個額外或另外的實施方案中，當如實施例15中所述測定時，抗-her2抗體有效地誘導adcc(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性)，優(yōu)選地實現至少30％，更優(yōu)選至少40％的特異性的51cr-釋放，優(yōu)選地，所述抗-her2抗體與包含選自如下的vh和vl區(qū)的至少一種參照抗體結合相同的表位：a)包含序列seqidno：1的vh區(qū)和包含序列seqidno：5的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：8的vh區(qū)和包含序列seqidno：12的vl區(qū)；c)包含序列seqidno：15的vh區(qū)和包含序列seqidno：19的vl區(qū)；d)包含序列seqidno：22的vh區(qū)和包含序列seqidno：26的vl區(qū)；e)包含序列seqidno：29的vh區(qū)和包含序列seqidno：32的vl區(qū)；f)包含序列seqidno：35的vh區(qū)和包含序列seqidno：39的vl區(qū)；和g)包含序列seqidno：63的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：67的vl區(qū)。在一個額外或另外的實施方案中，當如實施例16中所述測定時，her2抗體特異性地結合表達her2的au565細胞，但是與f5和c1中任一種相比，所述her2抗體對細胞的配體非依賴性增殖的促進要弱，優(yōu)選地，所述her2抗體與包含選自如下的vh和vl區(qū)的至少一種參照抗體結合相同的表位：a)包含序列seqidno：1的vh區(qū)和包含序列seqidno：5的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：8的vh區(qū)和包含序列seqidno：12的vl區(qū)；c)包含序列seqidno：15的vh區(qū)和包含序列seqidno：19的vl區(qū)；d)包含序列seqidno：22的vh區(qū)和包含序列seqidno：26的vl區(qū)；e)包含序列seqidno：29的vh區(qū)和包含序列seqidno：32的vl區(qū)；f)包含序列seqidno：35的vh區(qū)和包含序列seqidno：39的vl區(qū)；g)包含序列seqidno：46的vh區(qū)和包含序列seqidno：49的vl區(qū)；h)包含序列seqidno：49的vh區(qū)和包含序列seqidno：53的vl區(qū)；i)包含序列seqidno：56的vh區(qū)和包含序列seqidno：60的vl區(qū)；j)包含序列seqidno：63的vh區(qū)和包含序列seqidno：67的vl區(qū)；和k)包含序列seqidno：70的vh區(qū)和包含序列seqidno：74的vl區(qū)。在一個額外或另外的實施方案中，當如實施例16中所述測定時，her2抗體特異性地結合表達her2的au565細胞并抑制細胞的配體非依賴性增殖，優(yōu)選地至少20％，更優(yōu)選至少25％地抑制增殖，優(yōu)選地，所述her2抗體與包含選自如下的vh和vl區(qū)的至少一種參照抗體結合相同的表位：a)包含序列seqidno：1的vh區(qū)和包含序列seqidno：5的vl區(qū)；和b)包含序列seqidno：8的vh區(qū)和包含序列seqidno：12的vl區(qū)。在一個額外或另外的實施方案中，當如實施例17中所述測定時，her2抗體特異性地結合表達her2的au565細胞但不明顯影響或不促進細胞的配體誘導的增殖，優(yōu)選地，不超過15％，更優(yōu)選不超過25％地抑制增殖，所述her2抗體與包含選自如下的vh和vl區(qū)的至少一種參照抗體結合相同的表位：a)包含序列seqidno：1的vh區(qū)和包含序列seqidno：5的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：8的vh區(qū)和包含序列seqidno：12的vl區(qū)；c)包含序列seqidno：15的vh區(qū)和包含序列seqidno：19的vl區(qū)；和d)包含序列seqidno：56的vh區(qū)和包含序列seqidno：60的vl區(qū)。在一個額外或另外的實施方案中，當如實施例17中所述測定時，her2抗體特異性地結合表達her2的mcf-7細胞并抑制細胞的配體誘導的增殖，例如，它可以完全抑制配體誘導的效果，或50％，例如60％或70％或80％地抑制總的增殖，所述her2抗體與包含選自如下的vh和vl區(qū)的至少一種參照抗體結合相同的表位：a)包含序列seqidno：22的vh區(qū)和包含序列seqidno：26的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：29的vh區(qū)和包含序列seqidno：32的vl區(qū)；c)包含序列seqidno：35的vh區(qū)和包含序列seqidno：39的vl區(qū)；和d)包含序列seqidno：63的vh區(qū)和，優(yōu)選地，包含序列seqidno：67的vl區(qū)。在一個額外或另外的實施方案中，當如實施例18中所述測定時，當直接或間接綴合于治療部分如假單胞菌外毒素a的截短形式時，抗體在殺死au565細胞，a431細胞，或au565和a431細胞中比曲妥珠單抗更有效。在一個實施方案中，當如實施例18中所述測定時，綴合的抗體在殺死au565細胞和/或a431細胞中具有小于70ng/ml，小于50ng/ml，或小于30ng/ml的ec50值，所述綴合的抗體與包含抗體的vh和vl區(qū)的至少一種參照抗體結合相同的表位，所述抗體選自169，091，050，084，098，05，153，129，132，127和159；優(yōu)選地選自抗體153，129，098，091和025。在一個實施方案中，當如實施例18中所述測定時，綴合的抗體具有或導致比曲妥珠單抗和帕妥珠單抗更高百分比地殺死au565細胞，優(yōu)選殺死至少49％，更優(yōu)選至少60％的au565細胞，所述綴合的抗體與包含抗體的vh和vl區(qū)的至少一種參照抗體結合相同的表位，所述抗體選自169，091，050，084，098，025，153，129，132，127和159；優(yōu)選地選自抗體153，132，127，129，159和025。在一個優(yōu)選的實施方案中，綴合的抗體與含有包含序列seqidno：49的vh區(qū)和包含序列seqidno：53的vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位。在一個實施方案中，當如實施例18中所述測定時，綴合的抗體具有比曲妥珠單抗和帕妥珠單抗更高百分比地殺死au565細胞，優(yōu)選殺死至少50％，更優(yōu)選至少70％，所述綴合的抗體與包含抗體的vh和vl區(qū)的至少一種參照抗體結合相同的表位，所述抗體選自025，084，091，098，129和153；優(yōu)選地選自抗體025，091，098，129和153。在一個優(yōu)選的實施方案中，綴合的抗體與含有包含序列seqidno：56的vh區(qū)和包含序列seqidno：60的vl區(qū)的參照抗體結合相同的表位。在一個額外或另外的實施方案中，抗體被表達her2的腫瘤細胞如au565細胞內化，其程度高于曲妥珠單抗和帕妥珠單抗，優(yōu)選是內化的曲妥珠單抗的量的超過兩倍或三倍，優(yōu)選當根據實施例18測定時，所述抗體與包含選自如下的vh和vl區(qū)的抗體結合相同的表位：a)包含序列seqidno：46的vh區(qū)和包含序列seqidno：49的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：49的vh區(qū)和包含序列seqidno：53的vl區(qū)；c)包含序列seqidno：56的vh區(qū)和包含序列seqidno：60的vl區(qū)；d)包含序列seqidno：63的vh區(qū)和包含序列seqidno：67的vl區(qū)；和e)包含序列seqidno：70的vh區(qū)和包含序列seqidno：74的vl區(qū)。優(yōu)選地，抗體與包含選自如下的vh和vl區(qū)的抗體結合相同的表位a)包含序列seqidno：46的vh區(qū)和包含序列seqidno：49的vl區(qū)和b)包含序列seqidno：56的vh區(qū)和包含序列seqidno：60的vl區(qū)。在一個進一步的實施方案中，抗體結合her2的結構域ii或iv，優(yōu)選地，其中所述抗體不顯著促進表達her2的細胞的增殖，并且比曲妥珠單抗或帕妥珠單抗更有效地內化，或以更高的程度內化進表達her2的腫瘤細胞，優(yōu)選地當如實施例中，例如，分別地實施例16和19中所述測定時。在進一步的實施方案中，當如實施例22中所述測定時，抗體比曲妥珠單抗更多地增強her2下調，例如抗體以超過30％，如超過40％或超過50％地增強her2下調，優(yōu)選地，其中所述抗體與本發(fā)明的交叉阻斷組3的抗體結合相同的表位，例如與包含選自如下的vh和vl區(qū)的抗體結合相同的表位的抗體：a)包含序列seqidno：56的vh區(qū)和包含序列seqidno：60的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：63的vh區(qū)和包含序列seqidno：67的vl區(qū)。在另一個或另外的實施方案中，當如實施例29中所述測定時，抗體比曲妥珠單抗更多地在體內降低腫瘤生長并改善生存，優(yōu)選地，其中所述抗體與本發(fā)明的交叉阻斷組1或交叉阻斷組2的抗體結合相同的表位，例如與包含選自如下的vh和vl區(qū)的抗體結合相同的表位的抗體：a)包含序列seqidno：1的vh區(qū)和包含序列seqidno：5的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：15的vh區(qū)和包含序列seqidno：19的vl區(qū)；和c)包含序列seqidno：29的vh區(qū)和包含序列seqidno：32的vl區(qū)。在另一個或另外的實施方案中，當如實施例30中所述測定時，抗體比曲妥珠單抗更多地降低腫瘤生長并改善體內生存，優(yōu)選地，其中所述抗體與本發(fā)明的交叉阻斷組2或交叉阻斷組3的抗體結合相同的表位，例如與包含選自如下的vh和vl區(qū)的抗體結合相同的表位的抗體：a)包含序列seqidno：22的vh區(qū)和包含序列seqidno：26的vl區(qū)；b)包含序列seqidno：29的vh區(qū)和包含序列seqidno：32的vl區(qū)；c)包含序列seqidno：35的vh區(qū)和包含序列seqidno：39的vl區(qū)；和d)包含序列seqidno：63的vh區(qū)和包含序列seqidno：67的vl區(qū)。更具體地，其中所述抗體與包含選自如下的vh和vl區(qū)的抗體結合相同的表位：a)包含序列seqidno：22的vh區(qū)和包含序列seqidno：26的vl區(qū)；和b)包含序列seqidno：29的vh區(qū)和包含序列seqidno：32的vl區(qū)。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體。在進一步的實施方案中，抗體是雙特異性抗體，當如實施例22中所述測定時，其增強her2下調，尤其比它們的單特異性對應物更多地增強，例如所述抗體多于20％如多于30％或多于40％地增強her2下調，優(yōu)選地，其中所述抗體與選自如下的雙特異性抗體結合相同的表位：igg1-005-itl×igg1-169-k409r，igg1-025-itl×igg1-005-k409r，igg1-025-itl×igg1-153-k409r，igg1-025-itl×igg1-169-k409r，igg1-153-itl×igg1-005-k409r；和igg1-153-itl×igg1-169-k409r。在一個額外或另外的實施方案中，當如實施例24中所述測定時，雙特異性抗體特異性結合表達her2的au565細胞并抑制細胞的配體誘導的增殖，所述雙特異性抗體與至少一種選自如下的雙特異性抗體結合相同的表位：igg1-005-itl×igg1-169-k409r，igg1-025-itl×igg1-005-k409r，igg1-025-itl×igg1-153-k409r，igg1-025-itl×igg1-169-k409r，igg1-153-itl×igg1-005-k409r；和igg1-153-itl×igg1-169-k409r。尤其地，雙特異性抗體比它們的單特異性對應物更多地抑制au565細胞的增殖，所述雙特異性抗體選自igg1-005-itl×igg1-169-k409r和igg1-025-itl×igg1-005-k409r。在一個額外或另外的實施方案中，雙特異性抗體是her2×cd3雙特異性抗體，如實施例25中所述，其誘導au565的t細胞介導的細胞毒性，所述雙特異性抗體與選自如下的至少一種雙特異性抗體結合相同的表位：duohuclb-q/153-q，duohuclb-q/b12-q，duoyth12.5/153-q和duoyth12.5/b12-q(duo表示雙特異性抗體)?？贵w形式本發(fā)明提供了her2抗體，所述her2抗體有效結合并內化進表達her2的腫瘤細胞，通常沒有顯著促進細胞的配體非依賴性增殖。根據用于特定用途的期望的功能特性，特定抗體可以選自本發(fā)明中提供的抗體組和/或可以如下面所述調整它們的形式以改變這些特性。本發(fā)明抗體可以是任何同種型。同種型的選擇典型地遵從期望的效應物功能，例如adcc誘導。示例性的同種型是igg1，igg2，igg3，和igg4?？梢允褂萌溯p鏈恒定區(qū)，к或λ，的任一個。如果期望，可以通過已知方法轉換本發(fā)明的her2抗體的類型。例如，可以將初始為igm的本發(fā)明的抗體類型轉換為本發(fā)明的igg抗體。進一步地，可以使用類型轉換技術將一種igg亞類轉化為另一種，例如從igg1至igg2。因此，可以通過同種型轉換為例如igg1，igg2，igg3，igg4，igd，iga，ige，或igm抗體而改變本發(fā)明的抗體的效應物功能而用于各種治療用途。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是igg1抗體，例如igg1，κ。在進一步的實施方案中，將本發(fā)明的抗體糖工程化以減少巖藻糖并因此增強adcc，例如，通過如us2009317869中所述或如vanberkel等.(2010)biotechnol.bioeng.105：350中所述在抗體生產期間將化合物加入培養(yǎng)基，或者通過，例如，如yamane-ohnuki等(2004)biotechnol.bioeng87：614中所述使用fut8敲除細胞?；蛘呖梢允褂玫?(1999)naturebiotech17：176中所述的方法優(yōu)化adcc。在進一步的實施方案中，已經將本發(fā)明的抗體工程化以增強補體活化，例如，如natsume等.(2009)cancersci.100：2411中所述。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是全長抗體，優(yōu)選igg1抗體，尤其是igg1，к抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是抗體片段或者單鏈抗體?？梢岳缬贸Ｒ?guī)技術通過片段化獲得抗體片段，以本文所述的完整抗體的相同的方式基于用途篩選片段。例如，可以通過用胃蛋白酶(pepsin)處理抗體產生f(ab′)2片段?？梢杂眠€原劑如二硫蘇糖醇處理產生的f(ab′)2片段以還原二硫鍵而產生fab′片段?？梢酝ㄟ^用木瓜蛋白酶處理抗體而獲得fab片段。還可以通過硫醚鍵或二硫鍵結合fab′片段來產生f(ab′)2片段。還可以通過在重組細胞中表達編碼這種片段的核酸來產生抗體片段(見例如evans等，j.immunol.meth.184，123-38(1995))。例如，編碼f(ab′)2片段的一部分的嵌合基因可以包括：編碼h鏈的ch1結構域和鉸鏈區(qū)的dna序列，隨后是用于產生這種截短的抗體片段分子的翻譯終止密碼子。如上所解釋的，在一個實施方案中，本發(fā)明的her2抗體是二價抗體，即能夠結合兩種抗原或相同抗原上的兩種表位的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的her2抗體是單價抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是fab片段或單臂的抗體，如us20080063641(genentech)中所述的，或其他單價抗體，例如如wo2007048037(amgen)中所述的。在一個優(yōu)選的實施方案中，單價抗體具有如wo2007059782(genmab)(通過引用并入本文)所述的具有鉸鏈區(qū)缺失的結構。因此，在一個實施方案中，抗體是單價抗體，其中通過如下方法構建所述her2抗體，該方法包括：i)提供編碼所述單價抗體的輕鏈的核酸構建體，所述構建體包含編碼選擇的抗原特異性her2抗體的vl區(qū)的核苷酸序列和編碼ig的恒定cl區(qū)的核苷酸序列，其中所述編碼選擇的抗原特異性抗體的vl區(qū)的核苷酸序列和所述編碼ig的cl區(qū)的核苷酸序列可操作地連接在一起，并且其中，在igg1亞型的情況下，編碼cl區(qū)的核苷酸序列已經修飾，使得cl區(qū)不包含任何如下氨基酸：在多克隆人igg存在的情況下或者當施用于動物或人類時，所述氨基酸能夠與包含相同的cl區(qū)的氨基酸序列的其他肽形成二硫鍵或共價鍵；ii)提供編碼所述單價抗體的重鏈的核酸構建體，所述構建體包含編碼選擇的抗原特異性抗體的vh區(qū)的核苷酸序列和編碼人ig的恒定ch區(qū)的核苷酸序列，其中編碼ch區(qū)的核苷酸序列已經修飾，使得對應于鉸鏈區(qū)的區(qū)域，以及如ig亞型所要求的，ch區(qū)的其他區(qū)域，如ch3區(qū)，不包含任何如下氨基酸殘基：在多克隆人igg存在的情況下或者當施用于動物或人類時，所述氨基酸殘基參與和包含相同的人ig的ch區(qū)的氨基酸序列的其他肽形成二硫鍵或者共價的或穩(wěn)定的非共價的重鏈間鍵，其中所述編碼選擇的抗原特異性抗體的vh區(qū)的核苷酸序列和所述編碼所述ig的ch區(qū)的核苷酸序列可操作地連接在一起；iii)提供用于產生所述單價抗體的細胞表達系統(tǒng)；iv)通過在(iii)的細胞表達系統(tǒng)的細胞中共表達(i)和(ii)的核酸構建體而產生所述單價抗體。類似地，在一個實施方案中，her2抗體是單價抗體，其包含(i)如本文所述的本發(fā)明的抗體的可變區(qū)或所述區(qū)的抗原結合部分，和(ii)免疫球蛋白的ch區(qū)或其包含ch2和ch3區(qū)的片段，其中所述ch區(qū)或其片段已經修飾，使得對應于鉸鏈區(qū)的區(qū)域，以及，如果免疫球蛋白不是igg4亞型，ch區(qū)的其他區(qū)域，如ch3區(qū)，不包含任何如下氨基酸殘基：在多克隆人igg存在的情況下，所述氨基酸殘基能夠與相同的ch區(qū)形成二硫鍵或者與相同的ch區(qū)形成其他共價的或穩(wěn)定的非共價重鏈間鍵。在其進一步的實施方案中，單價her2抗體的重鏈已經修飾，使得整個鉸鏈缺失。在另一個進一步的實施方案中，上述步驟ii)中所指的免疫球蛋白是igg4亞型的。在另一個進一步的實施方案中，所述單價抗體是igg4亞型的，但ch3區(qū)已經修飾，使得產生下列氨基酸取代中的一種或多種：ch3突變的編號*kabat表示根據kabat的氨基酸編號(kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thed.publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.(1991)。eu索引表示根據如kabat(同上)所述的eu索引的氨基酸編號。在另一個進一步的實施方案中，所述單價抗體的序列已經修飾，使得它不包含任何用于n-連接的糖基化的受體位點。本發(fā)明的her2抗體還包括單鏈抗體。單鏈抗體是其中重鏈和輕鏈fv區(qū)被連接的肽。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了單鏈fv(scfv)，其中在單肽鏈中用柔性肽接頭(典型地約10、12、15或更多個氨基酸殘基)將本發(fā)明的her2抗體的fv中的重鏈和輕鏈連接起來。下列文獻中描述了生產這種抗體的方法：例如，us4,946,778，pluckthuninthepharmacologyofmonoclonalantibodies，vol.113，rosenburg和mooreeds.springer-verlag，newyork，pp.269-315(1994)，bird等，science242，423-426(1988)，huston等，pnasusa85，5879-5883(1988)和mccafferty等，nature348，552-554(1990)。單鏈抗體可以是單價的，如果僅使用單一的vh和vl，可以是二價的，如果使用兩個vh和vl，或者是多價的，如果使用多于兩個vh和vl。在一個實施方案中，本發(fā)明her2抗體是效應物功能缺陷抗體。在一個實施方案中，效應物功能缺陷的her2抗體是人穩(wěn)定化的igg4抗體，其已經修飾以防止fab-臂交換(vanderneutkolfschoten等.(2007)science317(5844)：1554-7)。合適的人穩(wěn)定化的igg4抗體的例子是如下抗體，其中用賴氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸，優(yōu)選賴氨酸(如wo2006033386(kirin)中所述)取代人igg4重鏈恒定區(qū)409位的精氨酸(如kabat等在eu索引中表示)，和/或其中鉸鏈區(qū)已經修飾以包含cys-pro-pro-cys序列。在一個實施方案中，穩(wěn)定化的igg4her2抗體是包含重鏈和輕鏈的igg4抗體，其中所述重鏈包含人igg4恒定區(qū)，所述恒定區(qū)在對應于409的位置處具有選自lys，ala，thr，met和leu的殘基，和/或在對應于405的位置處具有選自ala，val，gly，ile和leu的殘基，并且其中所述抗體任選地包含一個或多個進一步的取代、缺失和/或插入，但在鉸鏈區(qū)不包含cys-pro-pro-cys序列。優(yōu)選地，所述抗體在對應于409的位置處包含lys或ala殘基，或者抗體的ch3區(qū)已經被人igg1、人igg2或人igg3的ch3區(qū)所替代。還可參見wo2008145142(genmab)。在甚至進一步的實施方案中，穩(wěn)定化的igg4her2抗體是包含重鏈和輕鏈的igg4抗體，其中所述重鏈包括人igg4恒定區(qū)，所述人igg4恒定區(qū)在對應于409的位置處具有選自lys，ala，thr，met和leu的殘基，和/或在對應于405的位置處具有選自ala，val，gly，ile和leu的殘基，并且其中所述抗體任選地包含一個或多個進一步的取代、缺失和/或插入，并且其中所述抗體在鉸鏈區(qū)包含cys-pro-pro-cys序列。優(yōu)選地，所述抗體在對應于409的位置處包含lys或ala殘基，或者抗體的ch3區(qū)已經被人igg1、人igg2或人igg3的ch3區(qū)所替代。在進一步的實施方案中，效應物功能缺陷的her2抗體是非igg4型例如igg1，igg2或igg3的抗體，其已經突變，使得介導效應物功能如adcc的能力已經降低或者甚至去除。例如dall′acquawf等，jimmunol.177(2)：1129-1138(2006)和hezarehm，jvirol.；75(24)：12161-12168(2001)中已經描述了這種突變。綴合物在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了與治療部分如細胞毒素、化療藥物、細胞因子、免疫抑制劑或放射性同位素連接或綴合的her2抗體或her2雙特異性抗體。這種綴合物在本文被稱作“免疫綴合物”。包括一種或多種細胞毒素的免疫綴合物稱作免疫毒素(immunotoxins)。細胞毒素或細胞毒劑包括任何對細胞有害(例如殺死細胞)的試劑。用于形成本發(fā)明免疫綴合物的合適治療劑包括紫杉醇(taxol)、細胞松弛素b(cytochalasinb)、短桿菌肽d(gramicidind)、溴化乙錠(ethidiumbromide)、依米丁(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、鬼臼噻吩苷(tenoposide)、長春新堿(vincristine)、長春花堿(vinblastine)、秋水仙堿(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、二羥炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、美登素i(maytansine)或其類似物或衍生物、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放線菌素d(actinomycind)、1-去氫睪酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)；卡里奇霉素(calicheamicin)或其類似物或衍生物；抗代謝物(如氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達拉賓、5-氟脲嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine)、羥基脲、天冬酰胺酶、吉西他濱、克拉屈濱)，烷化劑(如氮芥、thioepa、苯丁酸氮芥、美法侖、卡氮芥(bsnu)、洛莫司汀(ccnu)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、達卡巴嗪(dtic)、丙卡巴肼、絲裂霉素c、順鉑和其他鉑衍生物，如卡鉑；以及duocarmycina、duocarmycinsa、cc-1065(又名雷查霉素(rachelmycin))，或cc-1065的類似物或衍生物)、抗生素(如放線菌素d(以前稱作放線菌素)、博來霉素、柔紅霉素(以前稱作道諾霉素)、阿霉素、伊達比星、光神霉素(mithramycin)、絲裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、安曲霉素(amc))、抗有絲分裂劑(例如，微管蛋白抑制劑)如monomethylauristatine、monomethylauristatinf或多拉司他汀10的其他類似物或衍生物；白喉毒素和相關分子(如白喉a鏈及其活性片段和雜合分子)；蓖麻毒蛋白毒素(例如蓖麻毒蛋白a或脫糖基化蓖麻毒蛋白a鏈毒素)、霍亂毒素、志賀樣毒素(slt-i，slt-ii，slt-iiv)、lt毒素、c3毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆bowman-birk蛋白酶抑制劑、假單胞菌外毒素、alorin、皂苷、蒴蓮素、gelanin、相思豆毒蛋白a鏈、蒴蓮素a鏈、α-帚曲霉素、油桐(aleuritesfordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸(phytolaccaamericana)蛋白(papi，papii和pap-s)、苦瓜抑制劑、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、mitogellin、局限曲霉素(restrictocin)、酚霉素和依諾霉素毒素。其他合適的綴合分子包括抗菌/裂解肽，如clip、蛙皮素2、蜂毒肽、天蠶抗菌肽和p18；核糖核酸酶(rnase)、dnasei、葡萄球菌內毒素-a、美洲商陸抗病毒蛋白、白喉毒素和假單胞菌內毒素。見例如pastan等，cell47，641(1986)和goldenberg，calif.acancerjournalforclinicians44，43(1994)?？梢耘c如本文其他部分所述的本發(fā)明的her2抗體組合施用的治療劑，如抗癌細胞因子或趨化因子，也是可用于與本發(fā)明的抗體綴合的治療部分的候選。在一個實施方案中，本發(fā)明的her2抗體包括綴合的核酸或核酸相關分子。在一個這種實施方案中，綴合的核酸是細胞毒性核糖核酸酶、反義核酸、抑制性rna分子(例如，sirna分子)或免疫刺激性核酸(例如，免疫刺激性的包含cpg基序的dna分子)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的her2抗體綴合于適配子或核酶。在一個實施方案中，提供了包含一個或多個放射性標記的氨基酸的her2抗體。放射性標記的her2抗體可以用于診斷和治療目的(與放射性標記的分子綴合是另一種可能的特征)。用于多肽的標記的非限制性例子包括3h、14c、15n、35s、90y、99tc和125i、131i和186re。在一個實施方案中，抗體與放射性同位素或包含放射性同位素螯合物的綴合。例如，抗體可以與螯合劑接頭，例如dota，dtpa或tiuxetan綴合，這允許抗體與放射性同位素形成復合物?？贵w也可以或另外包含或綴合于一個或多個放射性標記的氨基酸，或其他放射性標記的分子。放射性標記的cd74ab可以用于診斷和治療目的。放射性同位素的非限制性例子包括3h、14c、15n、35s、90y、99tc、125i、”111in、131i、186re、213bs、225ac和227th。還可以通過與聚合物共價綴合而化學修飾her2抗體，以便例如增加它們的循環(huán)半衰期。在例如us4,766,106、us4,179,337、us4,495,285和us4,609,546中例舉了示例性聚合物和將它們與肽連接的方法。其他聚合物包括聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(peg)(例如分子量為約1,000-約40,000如約2,000-約20,000的peg)?？梢允褂萌魏伪绢I域已知的用于將her2抗體與綴合的分子如上文所述的那些相綴合的方法，包括在下列文獻中描述的方法：hunter等，nature144，945(1962)，david等，biochemistry13，1014(1974)，pain等，j.immunol.meth.40，219(1981)和nygren，j.histochem.andcytochem.30，407(1982)?？梢酝ㄟ^將其他部分與her2抗體或其片段(例如her2抗體h或l鏈)的n-末端側或c-末端側化學地綴合而產生這種抗體(見例如osamukanemitsu編輯的antibodyengineeringhandbook，由chijinshokan出版(1994))。還可以通過在合適的內部殘基或糖處綴合而產生這種綴合的抗體衍生物?？梢灾苯踊蜷g接地將該試劑與本發(fā)明的her2抗體偶聯(lián)。第二種試劑的間接偶聯(lián)的一個例子是通過間隔部分與抗體中的半胱氨酸或賴氨酸殘基偶聯(lián)。在一個實施方案中，將her2抗體與前藥分子綴合，所述前藥分子在體內可以通過間隔子或接頭被活化為治療性藥物。施用后，通過腫瘤細胞相關的酶或其他腫瘤特異性的條件裂解間隔子或接頭，由此形成活性藥物。syntargabv等在wo02083180，wo2004043493，wo2007018431，wo2007089149，和wo2009017394中描述了這種前藥技術和接頭的例子。美國專利號6,989,452(medarex)中也可以發(fā)現合適的抗體-前藥技術和duocarmycin類似物。在一個實施方案中，將本發(fā)明的her2抗體與螯合劑接頭(例如tiuxetan)連接，這允許將抗體綴合于放射性同位素。雙特異性抗體在進一步的方面，本發(fā)明涉及雙特異性分子，所述雙特異性分子包含來自本文上面所述的本發(fā)明的her2抗體的第一抗原結合位點和具有不同的結合特異性(如對于人效應物細胞、人fc受體、t細胞受體、b細胞受體的結合特異性，或者對于her2的非重疊表位的結合特異性)的第二抗原結合位點，即其中例如當如實施例14中所述測試時，所述第一和第二抗原結合位點對于和her2的結合不彼此交叉阻斷的雙特異性抗體。本發(fā)明的示例性的雙特異性抗體分子包括(i)綴合在一起的兩種抗體，一種具有對her2的特異性，另一種具有對第二種目標的特異性，(ii)單一抗體，其具有對her2特異性的一條鏈或臂以及對第二種分子特異性的第二條鏈或臂，(iii)單鏈抗體，其具有對her2和第二種分子的特異性，例如，經由通過一個額外的肽接頭串聯(lián)連接的兩個scfv；(iv)雙可變結構域抗體(dvd-ig)，其中每條輕鏈和重鏈包含通過短肽連接串聯(lián)的兩個可變結構域(wu等，generationandcharacterizationofadualvariabledomainimmunoglobulin(dvd-igtm)molecule，in：antibodyengineering，springerberlinheidelberg(2010))；(v)化學連接的雙特異性(fab’)2片段；(vi)tandab，這是兩種單鏈雙抗體的融合體，其產生四價的雙特異性抗體，其具有兩個針對每一種目標抗原的結合位點；(vii)flexibody，這是scfv與雙抗體的組合，產生多價分子；(viii)基于蛋白激酶a中“二聚化和錨結構域”的所謂的“錨和鎖(dockandlock)”分子，當應用于fabs時，其可以產生由兩個相同的fab片段和與之連接的不同的fab片段組成的三價雙特異性結合蛋白；(ix)所謂的蝎子分子(scorpionmolecule)，其包含，例如，融合于人fc區(qū)的兩個末端的兩個scfv；和(x)雙抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體是通過控制的fab臂交換獲得的雙抗體、交叉體或雙特異性抗體，如本發(fā)明中描述的那些。可用于制備雙特異性抗體的平臺的例子包括但不限于bite(micromet)、dart(macrogenics)、fcab和mab2(f-star)、fc-工程化的igg1(xencor)或duobody(基于fab臂交換，genmab，本申請)。不同類型的雙特異性抗體的例子包括但不限于●不對稱的igg-樣分子，其中分子的一側包含至少一種抗體的fab區(qū)或部分fab區(qū)，分子的另一側包含至少一種其他抗體的fab區(qū)或部分fab區(qū)；在這種類型中，fc區(qū)中也可以存在不對稱，并且可用于分子的兩個部分的特定連接；●對稱的igg樣分子，其中分子的兩側每個包含至少兩種不同的抗體的fab區(qū)或部分fab區(qū)；●igg融合分子，其中全長igg抗體與額外的fab區(qū)或部分fab區(qū)融合；●fc融合分子，其中單鏈fv分子或穩(wěn)定化的雙抗體與fcγ區(qū)或其部分融合；●fab融合分子，其中不同的fab片段融合在一起；●基于scfv和雙抗體的分子，其中不同的單鏈fv分子或不同的雙抗體彼此融合或與另一種蛋白或載體分子融合。不對稱的igg樣分子的例子包括但不限于triomab/quadroma(trionpharma/freseniusbiotech)，theknobs-into-holes(genentech)，crossmabs(roche)和theelectrostatically-matched(amgen)，theluz-y(genentech)，thestrandexchangeengineereddomainbody(emdserono)，thebiclonic(merus)和theduobody(genmaba/s)。對稱的igg樣分子的例子包括但不限于dualtargeting(dt)-ig(gsk/domantis)，two-in-oneantibody(genentech)，cross-hnkedmabs(karmanoscancercenter)，mab2(f-star)和covx-body(covx/pfizer)。igg融合分子的例子包括但不限于dualvariabledomain(dvd)-ig(abbott)，igg-likebispecific(imclone/elililly)，ts2ab(medimmune/az)和bsab(zymogenetics)，hercules(biogenidec)以及tvab(roche)。fc融合分子的例子包括但不限于scfv/fcfusions(academicinstitution)，scorpion(emergentbiosolutions/trubion，zymogenetics/bms)，dualaffinityretargetingtechnology(fc-dart)(macrogenics)和dual(scfv)2-fab(nationalresearchcenterforantibodymedicine-china)。v類雙特異性抗體的例子包括但不限于f(ab)2(medarex/amgen)，dual-action或bis-fab(genentech)，dock-and-lock(dnl)(immunomedics)，bivalentbispecific(biotecnol)和fab-fv(ucb-celltech)?；趕cfv和雙抗體的分子的例子包括但不限于bispecifictcellengager(bite)(micromet9，tandemdiabody(tandab)(affimed)，dualaffinityretargetingtechnology(dart)(macrogenics)，single-chaindiabody(academic)，tcr-likeantibodies(ait，receptorlogics)，humanserumalbuminscfvfusion(merrimack)和combody(epigenbiotech)。在一個實施方案中，第二種分子是癌抗原/腫瘤相關抗原，如癌胚抗原(cea)、前列腺特異性抗原(psa)、rage(腎抗原)、α-甲胎蛋白、camel(黑色素瘤上的ctl-識別的抗原)、ct抗原(如mage-b5，-b6，-c2，-c3，和d；mage12；ct10；ny-eso1，ssx2，gage，bage，mage，和sage)、粘蛋白抗原(例如muc1，粘蛋白-ca125等)、神經節(jié)苷脂抗原、酪氨酸酶、gp75、c-met、c-myc、mart1、melana、mum-1、mum-2、mum-3、hla-b7、ep-cam或癌癥相關的整合素如α5β3整合素。在另一個實施方案中，第二種分子是t細胞和/或nk細胞抗原，如cd3或cd16。在另一個實施方案中，第二種分子是血管生成因子或其他癌癥相關生長因子，如血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子受體、血管生成素或這些中任一種的受體，尤其地，與癌癥進展相關的受體(例如her受體中的另一種；her1、her3或her4)。在一個實施方案中，第二抗原結合位點結合her2上與本發(fā)明的抗體結合的位點不同的，優(yōu)選非阻斷的位點。例如，第二種分子可以源自，或交叉阻斷曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、f5或c1的her2結合。制備雙特異性抗體的方法包括wo2008119353(genmab)中描述的并且vanderneut-kolfschoten等.(science.2007sep14；317(5844)：1554-7)報道的那些，可以例如如本發(fā)明的實施例20中所述進行。核酸序列、載體和宿主細胞在進一步的方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的抗體的重鏈和輕鏈的核酸序列如dna序列。在一個實施方案中，核酸序列編碼選自如下的氨基酸序列：seqidno：1，5，8，12，15，19，22，26，29，32，35，39，42，46，49，53，56，60，，63，67，70，74，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125和126。在另一個特定實施方案中，核酸序列編碼選自如下的vh氨基酸序列：seqidno：1，8，15，22，29，35，42，49，56，63，70，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123和125。在另一個特定實施方案中，核酸序列編碼選自如下的vl氨基酸序列：seqidno：5，12，19，26，32，39，46，53，60，67，74，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124和126。在甚至進一步的方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的抗體的表達載體，或一組表達載體?？贵w的重鏈和輕鏈可以由相同載體或由不同載體編碼。這種表達載體可用于重組產生本發(fā)明的抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的表達載體包含編碼選自如下的氨基酸序列中的一種或多種的核苷酸序列：seqidno：1，5，8，12，15，19，22，26，29，32，35，39，42，46，49，53，56，60，，63，67，70，74，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125和126。在另一個特定實施方案中，本發(fā)明的表達載體包含編碼選自如下的vh氨基酸序列中的一種或多種的核苷酸序列：seqidno：1，8，15，22，29，35，42，49，56，63，70，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123和125。在另一個特定實施方案中，本發(fā)明的表達載體包含編碼選自如下的vl氨基酸序列中的一種或多種的核苷酸序列：seqidno：5，12，19，26，32，39，46，53，60，67，74，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124和126。在進一步的實施方案中，表達載體進一步包含編碼抗體，例如人抗體的輕鏈恒定區(qū)、重鏈恒定區(qū)、或輕鏈和重鏈恒定區(qū)二者的核苷酸序列。本發(fā)明上下文中的表達載體可以是任何合適的載體，包括染色體、非染色體、合成的核酸載體(包含一組合適的表達控制元件的核酸序列)。這種載體的例子包括sv40的衍生物、細菌質粒、噬菌體dna、桿狀病毒、酵母質粒、源自質粒和噬菌體dna組合的載體和病毒核酸(rna或dna)載體。在一個實施方案中，編碼her2抗體的核酸被包含在裸dna或rna載體內，包括例如線性表達元件(例如在sykes和johnston，natbiotech17，35559(1997)中所述的)，緊湊的核酸載體(例如在us6,077,835和/或wo00/70087中所述的)，質粒載體如pbr322、puc19/18或puc118/119，“侏儒(midge)”尺寸最小化核酸載體(例如在schakowski等，molther3，793-800(2001)中所述的)，或者作為沉淀的(precipitated)核酸載體構建體，例如cap04-沉淀構建體(如在例如wo00/46147，benvenisty和reshef，pnasusa83，9551-55(1986)，wigler等，cell14，725(1978)，以及coraro和pearson，somaticcellgenetics7，603(1981)中所述的)。這種核酸載體及其使用是本領域公知的(見例如us5,589,466和us5,973,972)。實施例2和3中也描述了本發(fā)明的抗體的示例性的表達載體。在一個實施方案中，載體適合用于在細菌細胞中表達her2抗體。這種載體的例子包括表達載體，如bluescript(stratagene)，pin載體(vanheeke&schuster，jbiolchem264，5503-5509(1989)，pet載體(novagen，madisonwi)等)。表達載體還可以是，或者可選擇地是適合用于在酵母系統(tǒng)中表達的載體。可以采用任何適合用于在酵母系統(tǒng)中表達的載體。適合的載體包括，例如，包含組成型或誘導型啟動子如α因子、醇氧化酶和pgh的載體(綜述見：f.ausubel等，ed.currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingandwileyintersciencenewyork(1987)，和grant等，methodsinenzymol153，516-544(1987))。表達載體還可以是，或者可選擇地是適合用于在哺乳動物細胞中表達的載體，例如包含作為可選擇標記的谷氨酰胺合成酶的載體，如bebbington(1992)biotechnology(ny)10：169-175中所述的載體。核酸和/或載體還可以包含編碼分泌/定位序列的核酸序列，其可以將多肽，如新生的多肽鏈，靶向至周質空間(periplasmicspace)或者細胞培養(yǎng)基內。這種序列是本領域中已知的，并包括分泌前導或信號肽。在本發(fā)明的表達載體中，編碼her2抗體的核酸可以包含任何合適的啟動子、增強子和其他促進表達的元件或者與任何合適的啟動子、增強子和其他促進表達的元件相關。這種元件的例子包括強表達啟動子(例如人cmvie啟動子/增強子以及rsv，sv40，sl33，mmtv，和hivltr啟動子)，有效的聚(a)終止序列，大腸桿菌中質粒產物的復制起點，作為選擇標記的抗生素抗性基因，和/或便利的克隆位點(例如多接頭)。核酸也可以包含誘導型啟動子而不是組成型啟動子，如cmvie。在一個實施方案中，編碼her2抗體的表達載體可以通過病毒載體置于或者遞送至宿主細胞或宿主動物中。在甚至進一步的方面，本發(fā)明涉及重組的真核或原核宿主細胞，例如轉染瘤，其產生如本文所定義的本發(fā)明的抗體。宿主細胞的例子包括酵母、細菌和哺乳動物細胞，如cho或hek細胞。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含核酸的細胞，所述核酸穩(wěn)定整合到細胞基因組內并且包含用于表達本發(fā)明的her2抗體的編碼序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了細胞，所述細胞包含非整合的核酸，如質粒、粘粒、噬菌?；蚓€性表達元件，所述非整合的核酸包含用于表達本發(fā)明的her2抗體的編碼序列。在進一步的方面，本發(fā)明涉及產生如本文所定義的本發(fā)明的抗體的雜交瘤。在甚至進一步的方面，本發(fā)明涉及轉基因非人動物或植物，其包括編碼人重鏈和人輕鏈的核酸，其中所述動物或植物產生本發(fā)明的抗體。在進一步的方面，本發(fā)明涉及用于產生本發(fā)明的her2抗體的方法，所述方法包括如下步驟：a)培養(yǎng)如本文上面所述的本發(fā)明的雜交瘤或宿主細胞，和b)從培養(yǎng)基純化本發(fā)明的抗體。組合物在進一步的主要方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含：-如本文所定義的her2抗體，和-藥學上可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物可以包含本發(fā)明的抗體或者本發(fā)明的不同抗體的組合?？梢愿鶕Ｒ?guī)技術如remington：thescienceandpracticeofpharmacy，19thedition，gennaro，ed.，mackpublishingco.，easton，pa，1995中公開的那些配制藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以，例如，包括稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、去垢劑(例如非離子去垢劑，如吐溫-20或吐溫-80)、穩(wěn)定劑(例如糖類或無蛋白氨基酸)、防腐劑、組織固定劑、增溶劑、和/或適合用于包含在藥物組合物中的其他材料。藥學上可接受的載體包括任何和全部合適的溶劑、分散介質、包衣劑、抗菌和抗真菌劑、等滲劑、抗氧化劑和吸收延遲劑，以及與本發(fā)明的化合物生理上相容的類似物。本發(fā)明的藥物組合物中可以采用的合適的水性和非水性載體的例子包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇、右旋糖、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其合適的混合物、植物油、羧甲基纖維素膠體溶液、黃蓍膠和可注射的有機酯，如油酸乙酯，和/或各種緩沖劑。藥學上可接受的載體包括用于即時制備無菌可注射溶液或分散體的無菌水溶液或分散體和無菌粉末?？梢酝ㄟ^使用包衣材料，如卵磷脂，在分散體情況下通過保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑而保持合適的流動性。本發(fā)明的藥物組合物還可以包括藥學上可接受的抗氧化劑，例如(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚、丁羥甲苯、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。本發(fā)明的藥物組合物在組合物中還可以包括等滲劑，如糖，多元醇，如甘露醇、山梨醇、甘油或氯化鈉。本發(fā)明的藥物組合物還可以包含一種或多種適合用于選擇的給藥途徑的佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、防腐劑或緩沖劑，其可以提高藥物組合物的保存期限或有效性。可以用保護化合物免于快速釋放的載體制備本發(fā)明的化合物，所述載體如控釋劑型，包括植入體、經皮貼片和微膠囊化的遞送系統(tǒng)。這種載體可以包括明膠、單硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸，單獨地或者與蠟一起，或者其他本領域公知的材料。用于制備這種制劑的方法是本領域技術人員通常已知的。可以通過將所需量的活性化合物與根據需要的組分(例如，如上面所列舉的)的一種或組合并入適合的溶劑中，隨后通過無菌微量過濾而制備無菌可注射溶液。通常，通過將活性化合物并入含有基礎分散介質和所需的其他成分(例如來自上面列舉的那些)的無菌媒介中而制備分散體。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，制備方法的例子是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，所述方法從先前無菌過濾的其溶液產生活性成分加上任何額外的期望組分的粉末。藥物組合物中活性組分的實際劑量水平可以變化，以獲得在對患者沒有毒性的情況下對于特定患者、組合物或施用模式有效地實現期望的治療應答的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于多種藥代動力學因素，包括采用的本發(fā)明的特定組合物或其酰胺的活性，施用途徑，施用時間，采用的特定化合物的排泄速度，治療的持續(xù)時間，與采用的特定組合物聯(lián)合使用的其他藥物、化合物和/或材料，治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康狀況和以前的醫(yī)療史，以及醫(yī)學領域公知的類似因素?？梢酝ㄟ^任何合適的途徑和模式施用藥物組合物。在一個實施方案中，腸胃外施用本發(fā)明的藥物組合物。如本文所使用的，術語“腸胃外施用”是指除腸內和局部施用以外的施用模式，通常通過注射，包括表皮、靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心臟內、皮內、腹膜內、腱內、經氣管、皮下、表皮下(subticular)、關節(jié)內、囊下、蛛網膜下、椎管內、顱內、胸內、硬腦膜外和胸骨內注射和輸注。在一個實施方案中，通過靜脈內或皮下注射或輸注施用藥物組合物。用途在進一步的主要方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的her2抗體，其用作藥物。本發(fā)明的her2抗體可以用于多種目的。具體而言，本發(fā)明的抗體可用于治療各種形式的癌癥，包括轉移性癌癥和難治性癌癥。在一個實施方案中，本發(fā)明的her2抗體用于治療乳腺癌，包括原發(fā)性、轉移性和難治性乳腺癌。在一個實施方案中，本發(fā)明的her2抗體用于治療選自如下的癌癥形式，前列腺癌，非小細胞肺癌，膀胱癌，卵巢癌，胃癌，結腸直腸癌，食道癌，頭部和頸部的鱗狀細胞癌，子宮頸癌，胰腺癌，睪丸癌，惡性黑色素瘤和軟組織癌(如滑膜肉瘤)。類似地，本發(fā)明涉及用于殺死表達her2的腫瘤細胞的方法，包括將有效量的本發(fā)明的抗體如抗體藥物綴合物(adc)施用于需要其的個體。在一個實施方案中，所述腫瘤細胞參與如下的癌癥形式：乳腺癌，前列腺癌，非小細胞肺癌，膀胱癌，卵巢癌，胃癌，結腸直腸癌，食道癌，頭部和頸部的鱗狀細胞癌，子宮頸癌，胰腺癌，睪丸癌，惡性黑色素瘤和軟組織癌(例如滑膜肉瘤)。在一個實施方案中，所述腫瘤細胞是共表達her2和至少一個egfr家族的其他成員，優(yōu)選egfr、her3、或egfr和her3兩者的腫瘤細胞，是參與乳腺癌，結腸直腸癌，子宮內膜/子宮頸癌，肺癌，惡性黑色素瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，睪丸癌，軟組織腫瘤(例如，滑膜肉瘤)或膀胱癌的腫瘤細胞。在一個方面，本發(fā)明涉及用于在受試者中治療癌癥的方法，包括選擇患有包含共表達her2和egfr和/或her3的腫瘤細胞的癌癥的受試者，以及將任選地以綴合細胞毒性劑或藥物的抗體的形式的本發(fā)明的抗體施用于受試者。在一個實施方案中，受試者患有選自如下的癌癥：乳腺癌，結腸直腸癌，子宮內膜/子宮頸癌，肺癌，惡性黑色素瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，睪丸癌，軟組織腫瘤(例如，滑膜肉瘤)或膀胱癌。而且，本發(fā)明涉及結合人her2的單克隆抗體在制備用于治療癌癥(如上面提到的特定癌癥適應癥中的一種)的藥物中的用途。本發(fā)明進一步涉及單克隆抗體，其用于治療癌癥，如上面提到的癌癥適應癥中的一種。在本發(fā)明的治療方法的進一步的實施方案中，通過確定腫瘤負擔或相關腫瘤細胞上的her2表達水平而在治療期間，例如，在預定的時間點監(jiān)測治療的效力。對上述治療方法和用途中的劑量方案進行調節(jié)，以提供最佳的期望的應答(例如治療性應答)。例如，可以施用單次大劑量(bo]us)，可以隨時間施用若干分開的劑量，或者可以根據治療情形的迫切情況如指示成比例地減少或增加劑量。胃腸外組合物可以配制為單位劑量形式，以便于施用并保持劑量均勻性。her2抗體的有效劑量和給藥方案取決于待治療的疾病或狀況，并可以由本領域技術人員確定。本發(fā)明的化合物的治療有效量的示例性的非限制性范圍是約0.1-100mg/kg，如約0.1-50mg/kg，例如約0.1-20mg/kg，如約0.1-10mg/kg，例如約0.5，約如0.3，約1，約3，約5，或約8mg/kg。具有本領域普通技術的醫(yī)師或獸醫(yī)可以容易地確定并處方有效量的所需藥物組合物。例如，醫(yī)師或獸醫(yī)可以從低于實現期望的治療效果所需水平的水平開始藥物組合物中采用的her2抗體的劑量，并逐漸增加劑量，直到實現期望的效果。通常，本發(fā)明組合物的合適的每日劑量是化合物有效產生治療效果的最低劑量的量。施用可以，例如，是腸胃外的，如靜脈內的、肌內的或皮下的。在一個實施方案中，可以通過以10-500mg/m2，如200-400mg/m2的每周劑量輸注而施用her2抗體。這種施用可以重復進行，例如1-8次，如3-5次?？梢酝ㄟ^在2-24小時，如2-12小時的期間連續(xù)輸注而進行施用。在一個實施方案中，可以通過在長時間期間，如超過24小時，緩慢連續(xù)輸注而施用her2抗體以降低毒副作用。在一個實施方案中，可以以250mg-2000mg，如300mg，500mg，700mg，1000mg，1500mg或2000mg的每周劑量施用her2抗體，當每周一次給予時，最多達8次，如4-6次。必要時，這種方案可以，例如在6個月或12個月后，重復1次或多次。可以通過例如取出生物樣品測定施用后血液中本發(fā)明的化合物的量并使用針對本發(fā)明的her2抗體的抗原結合區(qū)的抗-獨特型抗體來確定或調整劑量。雙特異性抗體的有效劑量和給藥方案取決于待治療的疾病或狀況，并且可以由本領域技術人員確定。本發(fā)明的雙特異性抗體的治療有效量的示例性的非限制性范圍是約0.1-100mg/kg，如約0.1-50mg/kg，例如約0.1-20mg/kg，如約0.1-10mg/kg，例如約0.5，約如0.3，約1，約3，約5，或約8mg/kg。在一個實施方案中，可以通過維持療法施用her2抗體，例如在6個月或更長的期間每周1次。還可以預防性地施用her2抗體，以降低發(fā)生癌癥的風險、延遲癌癥進程中事件發(fā)生的開始和/或在癌癥減輕過程中降低復發(fā)的風險。還可以在組合療法中施用her2抗體，即與其他與待治療疾病或狀況相關的治療劑組合。因此，在一個實施方案中，包含抗體的藥物用于和一種或多種進一步的治療劑如細胞毒性劑、化療劑或抗血管生成劑組合。這種組合的施用可以同時、分別或順次進行。對于同時施用，可以合適地作為一種組合物或者作為分開的組合物施用藥物。因此，本發(fā)明還提供了用于治療上述涉及表達her2的細胞的病癥的方法，該方法包括施用與一種或多種如下所述的額外治療劑組合的本發(fā)明的her2抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于在受試者中治療涉及表達her2的細胞的病癥的方法，該方法包括將治療有效量的本發(fā)明的her2抗體和任選地至少一種額外的治療劑或結合與所述her2抗體不同的表位的抗體施用于需要其的受試者。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療或預防癌癥的方法，該方法包括將治療有效量的本發(fā)明her2抗體和至少一種額外的化療劑施用于需要其的受試者。在一個實施方案中，這種額外的治療劑可以選自抗代謝物，例如氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達拉濱、5-氟尿嘧啶、decarbazine、羥基脲、天冬酰胺酶、吉西他濱或克拉屈濱。在另一個實施方案中，這種額外的治療劑可以選自烷基化試劑，如氮芥、塞替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法侖、卡氯芥(bsnu)、環(huán)己亞硝脲(ccnu)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈唑霉素、達卡巴嗪(dtic)、丙卡巴肼、絲裂霉素c、順鉑和其他鉑衍生物，如卡鉑。在另一個實施方案中，這種額外的治療劑可以選自抗有絲分裂劑，如紫杉烷類(taxanes)，例如多西紫杉醇(docetaxel)和紫杉醇，和長春花生物堿，例如長春地辛、長春新堿、長春花堿和長春瑞濱。在另一個實施方案中，這種額外的治療劑可以選自拓撲異構酶抑制劑，如托泊替康或伊立替康，或抑制細胞生長的藥物，如依托泊苷和替尼泊苷。在另一實施方案中，這種額外的治療劑可以選自生長因子抑制劑，如erbb1(egfr)的抑制劑(如egfr抗體，例如zalutumumab，西妥昔單抗、帕尼單抗或尼妥珠單抗，或其他egfr抑制劑，如吉非替尼或埃羅替尼)，另一種erbb2的抑制劑(her2/neu)(如her2抗體，例如曲妥珠單抗、曲妥珠單抗-dm1或帕妥珠單抗)或egfr和her2兩者的抑制劑，如拉帕替尼)。在另一個實施方案中，這種額外的治療劑可以選自酪氨酸激酶抑制劑，如伊馬替尼(glivec，gleevecsti571)或拉帕替尼，ptk787/zk222584。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于在受試者中治療涉及表達her2的細胞的病癥的方法，該方法包括將治療有效量的本發(fā)明的her2抗體和至少一種血管生成、新血管化和/或其他血管化的抑制劑施用于需要其的受試者。這種血管生成抑制劑的例子是尿激酶抑制劑、基質金屬蛋白酶抑制劑(如馬立馬司他、新伐司他、bay129566、ag3340、bms275291和類似藥物)、內皮細胞遷移和增殖的抑制劑(如tnp470、角鯊胺、2-甲氧雌二醇、考布他汀類(combretastatins)、內皮他丁、血管抑素、青霉胺、sch66336(schering-ploughcorp，madison，nj)、r115777(janssenpharmaceutica，inc，titusville，nj)和類似藥物)、血管生成生長因子的拮抗劑(如zd6474、su6668、針對血管生成劑和/或它們的受體(如vegf(例如貝伐單抗)，bfgf，和血管生成素1)的抗體、沙利度胺、沙利度胺類似物(如cc5013)、sugen5416、su5402、抗血管生成核酶(如angiozyme)、干擾素α(如干擾素α2a)、蘇拉明和類似藥物)、vegf-r激酶抑制劑和其他抗血管生成酪氨酸激酶抑制劑(如su011248)、內皮特異性整合素/生存信號傳遞抑制劑(如vitaxin和類似藥物)、銅拮抗劑/螯合劑(如四硫鉬酸鹽、卡托普利和類似藥物)、羧胺三唑(carboxyamido-triazole，cai)、abt627、cm101、白介素12(il-12)、im862、pnu145156e以及抑制血管生成的核苷酸分子(如反義-vegf-cdna、編碼血管抑素的cdna、編碼p53的cdna和編碼缺陷型vegf受體2的cdna)。這種血管生成、新血管化和/或其他血管化的抑制劑的其他例子是抗血管生成肝素衍生物(如肝素酶iii(heperinaseiii))、替莫唑胺、nk4、巨噬細胞遷移抑制因子、環(huán)氧合酶-2抑制劑、缺氧誘導因子1的抑制劑、抗血管生成的大豆異黃酮、奧替普拉、煙曲霉素及其類似物、生長抑素類似物、戊聚糖多硫酸酯、替可加蘭鈉、達肝素、腫瘤抑素(tumstatin)、血小板反應蛋白(thrombospondin)、nm-3、combrestatin、血管能抑素(canstatin)、阿伐他汀(avastatin)、針對其他相關目標的抗體，如抗-α-v/β-3整合素和抗-kininostatin抗體。在一個實施方案中，用于和her2抗體組合用于治療上述病癥的治療劑可以是抗癌免疫原，如癌抗原/腫瘤相關抗原(例如上皮細胞粘附分子(epcam/tacstd1)、粘蛋白1(muc1)、癌胚抗原(cea)、腫瘤相關的糖蛋白72(tag72)、gp100、melan-a、mart1、kdr、rcas1、mda7、癌癥相關的病毒疫苗(例如人乳頭瘤病毒疫苗)、或腫瘤來源的熱休克蛋白。在一個實施方案中，用于和her2抗體組合用于治療上述病癥的治療劑可以是抗癌細胞因子、趨化因子或其組合。合適的細胞因子和生長因子的例子包括ifnγ、il-2、il-4、il-6、il-7、il-10、il-12、il-13、il-15、il-18、il-23、il-24、il-27、il-28a、il-28b、il-29、kgf、ifnα(例如，infα2b)、ifnβ、gm-csf、cd40l、flt3配體、干細胞因子、安西司亭和tnfα。合適的趨化因子可以包括glu-leu-arg(elr)-陰性趨化因子，如來自人cxc和c-c趨化因子家族的ip10、mcp3、mig和sdf-1α。合適的細胞因子包括細胞因子衍生物、細胞因子變體、細胞因子片段和細胞因子融合蛋白。在一個實施方案中，用于和her2抗體組合用于治療上述病癥的治療劑可以是細胞周期控制/細胞凋亡調節(jié)子(或“調節(jié)劑”)。細胞周期控制/細胞凋亡調節(jié)子可以包括針對并調節(jié)細胞周期控制/凋亡調節(jié)子的分子，例如(i)cdc-25(如nsc663284)，(ii)過度刺激細胞周期的細胞周期蛋白依賴的激酶(如夫拉平度(flavopiridol)(l868275，hmr1275)，7-羥基星孢素(7-hydroxystaurosporine)(ucn-01，kw2401)和roscovitine(r-roscovitine，cyc202))，和(iii)端粒酶調節(jié)子(如bibr1532，sot-095，grn163和在例如us6,440,735和us6,713,055中所述的組合物)。干擾細胞凋亡途徑的分子的非限制性例子包括tnf相關的細胞凋亡誘導配體(trail)/細胞凋亡-2配體(apo-2l)、激活trail受體的抗體、ifn和反義bcl-2(anti-sensebcl-2)。在一個實施方案中，用于和her2抗體組合用于治療上述病癥的治療劑可以是激素調節(jié)劑，如用于抗雄激素和抗雌激素療法的藥物。這種激素調節(jié)劑的例子是他莫昔芬、碘昔芬、氟維司群、屈洛昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、己烯雌酚、乙炔雌二醇/炔雌醇、抗雄激素(antiandrogene)(如氟他米特(flutaminde)/氟他胺(eulexin))、孕酮(如己酸羥孕酮、甲羥孕酮/普維拉、甲地孕酮醋酸酯/梅格施)、腎上腺皮質類固醇(如氫化可的松、潑尼松)、黃體化激素釋放激素(及其類似物或其他lhrh激動劑如布舍瑞林和戈舍瑞林)、芳香酶抑制劑(如阿那曲唑/瑞寧得、氨魯米特/cytraden、依西美坦)或激素抑制劑(例如奧曲肽/善得定)。在一個實施方案中，用于和her2抗體組合用于治療上述病癥的治療劑可以是抗無反應性劑(anti-anergicagent)，這種ascompounds是阻斷ctla-4活性的分子，例如ipilimumab。在一個實施方案中，用于和her2抗體組合用于治療上述病癥的治療劑可以是抗癌核酸或抗癌抑制性rna分子。作為用于和her2抗體組合用于治療上述病癥的治療劑相關的其他抗癌劑的例子是分化誘導劑、視黃酸類似物(如全反式視黃酸、13-順視黃酸和類似藥物)、維生素d類似物(如西奧骨化醇和類似藥物)、如下物質的抑制劑：erbb3、erbb4、igf-ir、胰島素受體、pdgfra、pdgfrβ、flk2、flt4、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、trka、trkc、ron(如抗-ron抗體)、sea、tie、tie2、eph、ret、ros、alk、ltk、ptk7和類似藥物。作為用于和her2抗體組合用于治療上述病癥的治療劑相關的其他抗癌劑的例子是雌莫司汀和表柔比星。作為用于和her2抗體組合用于治療上述病癥的治療劑相關的其他抗癌劑的例子是hsp90抑制劑，如17-烯丙基氨基格爾德霉素，針對腫瘤抗原如psa、ca125、ksa、整合素如整合素β1的抗體或vcam抑制劑。作為用于和her2抗體組合用于治療上述病癥的治療劑相關的其他抗癌劑的例子是鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑(如伐司樸達、psc833和其他mdr-1或p-糖蛋白抑制劑)、tor抑制劑(如西羅莫司、依維莫司和雷帕霉素)，和“淋巴細胞歸巢(1ymphocytehoming)”機制的抑制劑(如fty720)，和對細胞信號傳遞具有影響的試劑如粘附分子抑制劑(如抗-lfa)。在一個實施方案中，本發(fā)明的her2抗體用于和一種或多種其他的治療性抗體組合使用，如ofatumumab、zanolimumab、daratumumab、蘭尼單抗、尼妥珠單抗、帕尼單抗、hu806、達利珠單抗(zenapax)、巴利昔單抗(simulect)、英夫利昔單抗(remicade)、阿達木單抗(humira)、那他珠單抗(tysabri)、奧馬珠單抗(xolair)、依法利珠單抗(raptiva)和/或利妥昔單抗。在另一個實施方案中，組合使用兩種或更多種不同的本文所述的本發(fā)明的抗體用于治療疾病。特別感興趣的組合包括兩種或更多種非阻斷性抗體。這種組合療法可以導致結合增加數量的抗體分子/每個細胞，這可以提供增加的效力，例如通過激活補體介導的裂解。除上以外，本發(fā)明的組合療法的其他實施方案包括如下：對于乳腺癌的治療，her2抗體或其治療性綴合物，與氨甲喋呤、紫杉醇、阿霉素、卡鉑、環(huán)磷酰胺、柔紅霉素、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、伊沙匹隆、密吐霉素、米托蒽醌、長春瑞濱、多西他賽、噻替派、長春新堿、卡培他濱、egfr抗體(例如，zalutumumab、西妥昔單抗、帕尼單抗或尼妥珠單抗)或其他egfr抑制劑(如吉非替尼或埃羅替尼)、另一種her2抗體或綴合物(如，例如，曲妥珠單抗，曲妥珠單抗-dm1或帕妥珠單抗)、egfr和her2兩者的抑制劑(如拉帕替尼)組合，和/或與her3抑制劑組合。對于非小細胞肺癌的治療，her2抗體與egfr抑制劑，如egfr抗體，例如zalutumumab、西妥昔單抗、帕尼單抗或尼妥珠單抗或其他egfr抑制劑(如吉非替尼或埃羅替尼)組合，或與另一種her2藥物(如her2抗體，例如曲妥珠單抗、曲妥珠單抗-dm1或帕妥珠單抗)組合或與egfr和her2兩者的抑制劑如拉帕替尼組合，或與her3抑制劑組合。對于結腸直腸癌的治療，her2抗體與選自如下的一種或多種化合物組合：吉西他濱、貝伐單抗、folfox、folfiri、xelox、ifl、奧沙利鉑、伊立替康、5-fu/lv、卡培他濱、uft、egfr靶向劑如西妥昔單抗、帕尼單抗、扎魯木單抗(zalutumumab)；vegf抑制劑、或酪氨酸激酶抑制劑如舒尼替尼。對于前列腺癌的治療，her2抗體與選自如下的一種或多種化合物組合：激素/抗激素治療劑；如抗雄激素、黃體化激素釋放激素(lhrh)激動劑，和化療劑如紫杉烷類、米托蒽醌、雌莫司汀、5fu、長春花堿和伊沙匹隆。放射療法-手術在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于在受試者中治療涉及表達her2的細胞的病癥的方法，該方法包括將治療有效量的her2抗體如本發(fā)明的her2抗體和放射療法施用于需要其的受試者。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療或預防癌癥的方法，該方法包括將治療有效量的her2抗體如本發(fā)明的her2抗體和放射療法施用于需要其的受試者。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了her2抗體，如本發(fā)明的her2抗體在制備用于和放射療法組合施用以治療癌癥的藥物組合物中的用途。放射療法可以包括放射或者提供了將放療藥物施用于患者的相關施用方法。放射源可以在待治療患者的體外或者體內(放射治療可以例如是外部射束放射療法(ebrt)或近程放射治療(bt)的形式)?？捎糜趯嵤┻@些方法的放射活性元素包括例如鐳、銫-137、銥-192、镅-241、金-198、鈷-57、銅-67、锝-99、碘-123、碘-131和銦-111。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療或預防癌癥的方法，該方法包括與手術組合將治療有效量的her2抗體，如本發(fā)明的her2抗體施用于需要其的受試者。診斷用途本發(fā)明的her2抗體還可以用于診斷目的。因此，在進一步的方面，本發(fā)明涉及包含如本文定義的her2抗體的診斷組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明的her2抗體可以用于通過檢測her2的水平或在細胞膜表面上包含her2的細胞的水平而在體內或體外診斷疾病，在該疾病中激活的表達her2的細胞在疾病發(fā)生中發(fā)揮活躍作用?？梢酝ㄟ^例如在允許抗體和her2之間形成復合物的條件下將待測樣品，任選地與對照樣品一起，與her2抗體接觸而實現這一點。因此，在進一步的方面，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中her2抗原或表達her2的細胞的存在的方法，包括：-在允許抗體與her2之間形成復合物的條件下，將樣品與本發(fā)明的her2抗體接觸；和-分析是否形成了復合物。在一個實施方案中，該方法在體外實施。更具體地，本發(fā)明提供了用于鑒別、診斷侵襲性細胞和組織，以及本發(fā)明的her2抗體針對的其他細胞的方法，以及用于監(jiān)測治療性處理的進展、治療后狀態(tài)、發(fā)生癌癥的風險、癌癥進程等的方法。用于這種技術中使用的her2抗體和/或二級抗體的合適的標記是本領域中公知的。在進一步的方面，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中her2抗原或表達her2的細胞的存在的試劑盒，包括-本發(fā)明的her2抗體或本發(fā)明的雙特異性分子；和-試劑盒的使用說明書。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于診斷癌癥的試劑盒，包括容器，所述容器包含her2抗體和一種或多種用于檢測her2抗體與her2結合的試劑。試劑可以包括例如熒光標簽、酶標簽、或其他可檢測的標簽。試劑還可以包括用于酶反應的二級或三級抗體或試劑，其中酶反應產生可以被可視化的產物?？?獨特型抗體在進一步的方面，本發(fā)明涉及抗-獨特型抗體，其與如本文所述的本發(fā)明的her2抗體結合?？?獨特型(id)抗體是如下抗體，其識別一般與抗體的抗原結合位點相關的獨特決定簇?？梢酝ㄟ^用要制備抗-id的mab免疫動物而制備id抗體，其中所述動物的物種和遺傳類型與her2mab的來源的物種和遺傳類型相同。被免疫的動物通?？梢宰R別免疫的抗體的獨特型決定簇，并且通過產生針對這些獨特型決定簇的抗體(抗-id抗體)而對其應答。還可以使用抗-id抗體作為“免疫原”而在另一個動物內誘導免疫應答，產生所謂的抗-抗-id抗體?？?抗-id可能和誘導抗-id的最初mab在表位上相同。因此，通過使用針對mab的獨特型決定簇的抗體，可能鑒別出表達具有相同特異性的抗體的其他克隆。本發(fā)明進一步通過如下實施例進行舉例說明，但它們不應視為對本發(fā)明范圍的進一步限制。本發(fā)明進一步通過如下實施例進行舉例說明，但它們不應視為對本發(fā)明范圍的進一步限制。實施例實施例1-her2和her2變體的表達構建體產生用于表達全長her2(1255aa，swissprotp04626)、her2的胞外結構域(ecd)(her2-ecdhis，具有c-末端的his6標簽的aa1-653)、天然存在的her2剪接變體(her2-delex16，產生外顯子16缺失并缺乏aa633-648)和her2受體的截短形式(her2-粗短的(her2-stumpy)，aa648-1256)的完全密碼子優(yōu)化的構建體。該構建體包含用于克隆的合適的限制性位點和最優(yōu)的kozak序列(kozak，m.，gene1999；234(2)：187-208.)。將構建體克隆進哺乳動物表達載體pee13.4(lonzabiologics；bebbington，c.r.，等，biotechnology(ny)1992；10(2)：169-75)中，并完全測序以驗證構建體的正確性。實施例2-帕妥珠單抗c1和f5的表達構建體產生了用于在hek細胞中表達igg1抗體帕妥珠單抗、c1和f5的重鏈(hc)和輕鏈(lc)的完全密碼子優(yōu)化構建體。這些構建體編碼的可變區(qū)與在美國專利號6,949,245對于帕妥珠單抗重鏈和輕鏈以及美國專利號7,244,826對于c1和f5重鏈和輕鏈描述的那些是相同的。對于c1和f5，使用分別包含人igg1重鏈(同種異型f)、人κ輕鏈或人λ輕鏈的完全密碼子優(yōu)化的恒定區(qū)的哺乳動物表達載體p33g1f和p33k或p33l(pcdna3.3(invitrogen))。對于帕妥珠單抗，使用分別包含人igg1重鏈(同種異型f)和人κ輕鏈的完全密碼子優(yōu)化的恒定區(qū)的哺乳動物表達載體pg1f(pee12.4(lonzabiologics)和pkappa(pee6.4(lonzabiologics)。使用，例如，美國專利號7,632,924中所述的重鏈和輕鏈序列，可以以相同的方式產生曲妥珠單抗實施例3-在hek-293或cho細胞中瞬時表達從invitrogen獲得freestyletm293-f(一種適應懸浮生長和化學確定的freestyle培養(yǎng)基的hek-293亞克隆，(hek-293f))細胞，并根據制造商的說明書使用293fectin(invitrogen)以適當的質粒dna進行轉染。在抗體表達的情況下，共表達適當的重鏈和輕鏈表達載體。使用freestylemax轉染試劑(invitrogen)將pee13.4her2、pee13.4her2-delex16和pee13.4her2-stumpy瞬時轉染進freestyletmcho-s(invitrogen)細胞系。通過如下文所述的facs分析，檢測her2和her2-delex16的表達。實施例4-ns0中穩(wěn)定的多克隆合并物的表達通過核轉染(nucleofection，amaxa)將pee13.4her2、pee13.4her2-delex16和pee13.4her2-stumpy穩(wěn)定轉染進ns0細胞?；谡系墓劝滨０泛铣擅负Y選標記在谷氨酰胺依賴性生長選擇后，建立穩(wěn)定轉染的細胞的合并物(barnes，l.m.，等.，cytotechnology2000；32(2)：109-123)。實施例5-his標簽的her2的純化在hek-293f細胞中表達her2ecdhis。her2ecdhis中的his-標簽幫助固定化金屬親和色譜的純化，因為his-標簽的蛋白與樹脂珠粒強烈結合，而培養(yǎng)上清液中存在的其他蛋白則不會強烈結合。在該過程中，使固定在色譜樹脂上的螯合劑帶上co2+陽離子。將包含her2ecdhis的上清液與樹脂以分批模式(即溶液)孵育。孵育之后，從上清液中回收珠粒，并填充進柱子中。清洗柱子以除去弱結合的蛋白。然后用包含咪唑的緩沖液洗脫強結合的her2ecdhis蛋白，其中咪唑與his競爭結合co2+。通過在脫鹽柱上進行緩沖液交換而從蛋白中除去洗脫液。實施例6-轉基因小鼠的免疫操作從下列免疫獲得抗體001，019，021，025，027，032，033，035，036，049，050，051，054，055，084，091，094，098，100，105，123和124：通過以腹膜內(ip)的her2ecd瞬時轉染的5×106ns0細胞和在尾部皮下(sc)20μg偶聯(lián)于半抗原鑰孔戚血藍蛋白(klh)的her2ecdhis交替進行(間隔14天)而免疫三只雌性hco12小鼠，一只雄性和兩只雌性hco12-balb/c小鼠，一只雄性hco17小鼠和一只雄性hco20小鼠(medarex，sanjosé，ca，usa)。每只小鼠最多進行八次免疫(四次ip和四次sc免疫)。在完全弗氏佐劑(cfa；difcolaboratories，detroit，mi，usa)中完成使用細胞的第一次免疫。對于所有其他免疫，ip注射pbs中的細胞，而用不完全弗氏佐劑(ifa；difcolaboratories，detroit，mi，usa)sc注射klh偶聯(lián)的her2ecd。從下列免疫獲得抗體125，127，129，132，152，153和159：通過以ipher2delex16ip瞬時轉染的5×106ns0細胞和在尾部sc20μg偶聯(lián)于半抗原鑰孔戚血藍蛋白(klh)的her2ecdhis蛋白交替進行(間隔14天)而免疫一只雄性和兩只雌性hco12-balb/c小鼠，一只雌性hco20小鼠和一只雌性hco12小鼠(medarex)。每只小鼠最多進行八次免疫(四次ip和四次sc免疫)。在完全弗氏佐劑(cfa；difcolaboratories，detroit，mi，usa)中完成使用細胞的第一次免疫。對于所有其他免疫，ip注射pbs中的細胞，而用不完全弗氏佐劑(ifa；difcolaboratories，detroit，mi，usa)sc注射klh偶聯(lián)的her2ecd。從下列免疫獲得抗體143，160，161，162，166和169：通過以20μg偶聯(lián)于半抗原鑰孔戚血藍蛋白(klh)的her2ecdhis蛋白ip和在尾部sc交替進行(間隔14天)而免疫一只雌性和一只雄性hco12小鼠，一只雌性hco12-balb/c小鼠，一只雌性hco17小鼠和一只雄性hco20小鼠(medarex)。每只小鼠最多進行八次免疫(四次ip和四次sc免疫)。在完全弗氏佐劑(cfa；difcolaboratories，detroit，mi，usa)中ip完成第一次免疫。使用不完全弗氏佐劑(ifa；difcolaboratories，detroit，mi，usa)注射其他免疫。在抗原特異性fmat篩選測定(如實施例7中所述)中具有針對tc1014-her2、tc1014-her2delex16或tc1014-her2stumpy的至少兩個連續(xù)的滴度的小鼠被認為是陽性的并且融合。實施例7-同種抗原特異性篩選測定使用熒光微體積測定技術(fluorometricmicrovolumeassaytechnology，fmat；appliedbiosystems，fostercity，ca，usa)通過同種抗原特異性篩選測定(四分式)測定免疫的小鼠的血清或humab(人單克隆抗體)雜交瘤或轉染瘤培養(yǎng)物上清液中her2抗體的存在。為此，使用4個基于細胞的測定的組合。測定與tc1014-her2(瞬時表達her2受體的hek-293f細胞；如上所述產生)、tc1014-her2delex16(瞬時表達her2-delex的胞外結構域(her2受體的16個氨基酸缺失的突變體；如上所述產生)的hek-293f細胞和tc1014-her2stumpy(瞬時表達her2受體的胞外粗短結構域的hek-293f細胞；如上所述產生)以及hek293野生型細胞(不表達her2的陰性對照細胞)的結合。將樣品添加至細胞以允許與her2結合。隨后，用熒光綴合物(山羊抗-人igg-cy5；jacksonimmunoresearch)檢測humab的結合。使用th1014-帕妥珠單抗(在hek-293f細胞中產生的)作為陽性對照，使用humab-小鼠合并的血清和humab-klh作為陰性對照。使用appliedbiosystems8200細胞檢測系統(tǒng)(8200cds)掃描樣品，并使用‘計數×熒光(countsxfluorescence)’作為讀出。當計數高于50并且計數×熒光比陰性對照至少3倍更高時，樣品被規(guī)定為陽性的。實施例8-humab雜交瘤產生處死具有足夠抗原特異性滴度產生(如上定義)的humab小鼠，收集脾臟和腹主動脈和腔靜脈側翼的淋巴結?；旧细鶕圃焐痰恼f明書使用ceef50電融合系統(tǒng)(cytopulsesciences，glenburnie，md，usa)通過電融合進行脾細胞和淋巴結細胞與小鼠骨髓瘤細胞系的融合。接下來，使用clonepix系統(tǒng)(genetix，hampshire，uk)對初始孔進行亞克隆。為此，將特定的初始孔雜交瘤接種于由40％clonemedia(genetix，hampshire，uk)和60％hyq2×完全培養(yǎng)基(hyclone，waltham，usa)制備的半固體培養(yǎng)基中。如實施例7中所述在抗原特異性結合測定中重新測試亞克隆，使用octet(fortebio，menlopark，usa)測定igg水平以選擇每個初始孔最特異并且最佳的生產克隆用于進一步的擴增?；跇藴史桨高M行產生的humab雜交瘤的進一步擴增和培養(yǎng)(例如，如在coliganj.e.，bierer，b.e.，margulies，d.h.，shevach，e.m.和strober，w.，eds.currentprotocolsinimmunology，johnwiley&sons，inc.，2006中所述)。將通過這個過程產生的克隆命名為pc1014。實施例9-純化的抗體的質譜使用包含蛋白g樹脂的phytip柱(phynexusinc.，sanjose，usa)在sciclonealh3000工作站(caliperlifesciences，hopkinton，usa)上純化來自6孔或hyperflask階段的0.8ml包含抗體的上清液的小份。根據制造商的說明書使用phytip柱，盡管用結合緩沖液pbs(b.braun，medicalb.v.，oss，netherlands)和洗脫緩沖液0.1m甘氨酸-hclph2.7(flukariedel-de，buchs，germany)替代緩沖液。純化后，用2mtris-hclph9.0(sigma-aldrich，zwijndrecht，netherlands)中和樣品?；蛘?，在一些情況下，使用mabselectsure純化更大體積的培養(yǎng)上清液。純化后，將樣品置于384-孔板(waters，100μl方孔板，part#186002631)中。用n-糖苷酶f(roche目錄號11365177001在37℃將樣品去糖基化過夜。加入dtt(15mg/ml)(1μl/孔)并在37℃孵育1h。樣品(5或6μl)在acquityuplctm(waters，milford，usa)上用beh300c18，1.7μm，2.1×50mm柱在60℃進行脫鹽。使用都包含0.1％甲酸(fluka，目錄號56302，buchs，germany)的mq水和lc-ms級乙腈(biosolve，目錄號01204101，valkenswaard，thenetherlands)分別作為洗脫液a和b。在以陽離子模式操作的microtoftm質譜儀(bruker，bremen，germany)上在線記錄飛行時間電噴霧離子化質譜。分析之前，用es調節(jié)混合物(estuningmix)(agilenttechnologies，santaclara，usa)校準900-3000m/z刻度。使用搜索5-80kda之間的分子量的最大熵值算法(maximalentropyalgorithm)，以dataanalysistm軟件v.3.4(bruker)對質譜去卷積。去卷積之后，將獲得的全部樣品的重鏈和輕鏈質量進行比較，以發(fā)現重復的抗體。這有時是由于額外輕鏈的存在，但是在重鏈的比較中，也考慮可能存在c-末端賴氨酸變體。這導致了一系列獨特的抗體，即，特定重鏈和輕鏈的獨特組合。在發(fā)現重復抗體的情況下，基于來自其他測試的結果選擇獨特的抗體。實施例10-her2抗體可變結構域的序列分析并克隆于表達載體中從5×106個雜交瘤細胞制備her2humabs的總rna，根據制造商的說明書使用smartracecdna擴增試劑盒(clontech)從100ng總rna制備5’-race-互補dna(cdna)。通過pcr擴增vh和vl編碼區(qū)并通過不依賴于連接的克隆(aslanidis，c.和p.j.dejong，nucleicacidsres1990；18(20)：6069-74)將所述vh和vl編碼區(qū)直接同框地(inframe)克隆進pg1f和pkappa表達載體。將通過這個過程產生的克隆命名為th1014。對于每種抗體，對16個vl克隆和8個vh克隆進行測序。選擇預測的重鏈和輕鏈質量與相同抗體的雜交瘤來源的材料的質量(如通過質譜法所測定的)一致的克隆用于進一步研究和表達。獲得的序列如圖1和2以及序列表中所示。下文也更詳細地描述了選擇的序列。根據imgt定義cdr序列(lefrancmp.等，nucleicacidsresearch，27，209-212，1999和brochetx.nucl.acidsres.36，w503-508(2008))。表1、表2和表3給出了抗體序列信息或種系序列的概述，而表4顯示了共有序列。表1：humabs169、050、084、025、091、129、127、159、098、153和132的重鏈可變區(qū)(vh)、輕鏈可變區(qū)(vl)和cdr序列。表2：選擇的humabs的小鼠來源和重鏈和輕鏈序列同源物humab：小鼠：品系：種系vh：種系vl：169361494hco20ighv1-18-01igkv3-11-01050350633hco12ighv3-23-01igkv1-12-01084350615hco12-ba1bcighv1-69-04igkv1-12-01025350631hco12ighv4-34-01igkv1d-16-01091350630hco12ighv4-34-01igkv1d-16-01129359783hco12-ba1bcighv3-30-3-01igkv3-11-01127359783hco12-ba1bcighv5-51-01igkv1d-8-01159363503hco12ighv5-51-01igkv1d-16-01098350659hco17ighv3-23-01igkv1d-16-01153359785hco12-ba1bcighv3-30-3-01igkv1d-16-01132361487hco20ighv1-18-01igkv3-11-01表3：humabs049、051、055、123、161、124、001、143、019、021、027、032、035、036、054、094的重鏈可變區(qū)(vh)，輕鏈可變區(qū)(vl)序列。對于vh和vl序列，各自的cdrs分別對應于圖1和2中下劃線表示的那些序列。表4：基于圖1和2中所示的序列比對的共有cdrs。實施例11-抗體的純化將培養(yǎng)上清液通過0.2μm盲端過濾器(dead-endfilter)過濾，上樣至5mlmabselectsure柱(gehealthcare)上，用0.1m檸檬酸鈉-naoh，ph3洗脫。立即用2mtris-hcl，ph9中和洗脫物，并過夜透析至12.6mmnah2po4，140mmnacl，ph7.4(b.braun)?；蛘撸兓?，將洗脫物上樣至hiprep脫鹽柱，將抗體交換進12.6mmnah2po4，140mmnacl，ph7.4(b.braun)緩沖液中。緩沖液透析或交換之后，樣品通過0.2μm盲端過濾器無菌過濾。通過sds-page確定純度，并通過比濁法和280nm吸光度測量濃度。將純化的抗體保存在4℃。進行質譜法來鑒別由如實施例9所述雜交瘤表達的抗體重鏈和輕鏈的分子量。實施例12-通過facs分析測定her2克隆與表達膜結合的her2的腫瘤細胞的結合使用流式細胞儀(facscantoii，bdbiosciences)測試her2抗體與au565細胞(購于atcc，crl-2351)和a431細胞(購于atcc，crl-1555)的結合。qifi分析(dako，glostrup，denmark)表明，au565細胞表達平均1,000,000拷貝的her2蛋白/細胞，而a431細胞表達平均15,000拷貝/細胞。使用藻紅蛋白(pe)綴合的山羊-抗-人igg抗體(jackson)檢測her2抗體的結合。使用曲妥珠單抗(臨床級)作為陽性對照抗體，使用同種型對照抗體作為陰性對照抗體。使用graphpadprismv4.03軟件(graphpadsoftware，sandiego，ca，usa)通過非線性回歸(具有可變斜率的s型劑量-應答)測定ec50值。如圖3中所示，所有測試的her2抗體都以劑量依賴的方式結合au565和a431細胞兩者上表達的her2。結合的ec50值對于au565細胞在0.336-2.290μg/ml之間變化，對于a431細胞在0.068-1.135μg/ml之間變化。尤其在a431細胞上，在測試的抗體之間觀察到ec50值的較大差異。然而，抗體098在兩種類型的細胞上都具有最佳(即最低)的ec50值。在au565和a431細胞上，在不同抗體之間也觀察到最大結合水平的一些差異。測試的抗體中，抗體098在au565細胞上也具有最高的最大結合水平，而抗體025在a431細胞上具有最高的最大結合水平。實施例13-通過facs分析測定her2抗體與獼猴上皮細胞上表達的膜結合的her2的結合為了測定與獼猴her2的交叉反應性，使用流式細胞儀(facscantoii，bdbiosciences)測試her2抗體與her2-陽性獼猴上皮細胞(購于atcc的4mbr-5)的結合。使用藻紅蛋白綴合的山羊-抗-人igg抗體(jackson)作為二級綴合物。使用同種型對照抗體作為陰性對照抗體。如圖4中所示，所有測試的her2抗體都與獼猴her2交叉反應。在兩個測試的濃度(1μg/ml和10μg/ml)，her2抗體都能夠特異性結合獼猴her2?？贵w127在1μg/ml濃度表現出較差的結合，但在10μg/ml的濃度表現出良好的結合?？贵w098在兩個抗體濃度都具有最高的結合水平。沒有觀察到與同種型對照抗體的任何結合。實施例14-在夾心-elisa中測定her2抗體競爭與可溶性her2ecdhis的結合以下列方式確定測試的her2抗體的最佳包被濃度和最佳her2ecdhis濃度：以在pbs中系列稀釋的her2humabs(2倍稀釋中0.125-8μg/ml)在4℃將elisa孔包被過夜。接下來，用pbst(補充0.05％吐溫-20[sigma-aldrich，zwijndrecht，thenetherlands]的pbs)洗滌elisa孔，用pbstc(補充2％[v/v]雞血清[gibco，paisley，scotland]的pbs)在室溫(rt)封閉1小時。然后用pbst洗滌elisa孔，并用pbstc中系列稀釋的her2ecdhis(2倍稀釋中0.25-2μg/ml)在rt孵育1小時。用pbst洗去未結合的her2ecdhis，用0.25μg/ml生物素化的兔-抗-6xhis-biot(abcam，cambridge，uk)在rt下孵育結合的her2ecdhis1小時。其后，用pbst洗滌該板，用pbst中稀釋的0.1μg/ml鏈霉親和素-聚-hrp(sanquin，amsterdam，thenetherlands)孵育1小時。洗滌后，通過避光在rt與2，2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(abts：在50mlabts緩沖液中稀釋的abts片劑(rochediagnostics，almere，thenetherlands))孵育15分鐘而使反應可視化。通過加入等體積的草酸(sigma-aldrich，zwijndrecht，thenetherlands)終止顯色。在微量滴定板讀數器(biotekinstruments，winooski，usa)上測定405nm處的熒光。測定導致每種抗體的次最佳結合的抗體濃度并用于以下的交叉阻斷實驗。以如上所述測定的次最佳劑量將每種her2抗體包被至elisa孔。elisa孔封閉后，在過量的第二(競爭劑)her2抗體存在或不存在的情況下，以預定濃度的1μg/ml生物素化的her2ecdhis孵育孔。然后如上所述進行elisa。將her2ecdhis與包被的抗體的殘余結合表示為相對于不存在競爭劑抗體的情況下觀察的結合的百分比。然后，百分比競爭確定為100減去抑制百分比。75％競爭被視為完全的交叉阻斷，而25-74％競爭被視為部分交叉阻斷，0-24％競爭被視為未阻斷。如表5中所示，發(fā)現所有her2抗體都能夠，至少部分地，阻斷它們自身與her2ecdhis的結合。將抗體分為3個主要的交叉阻斷組之后，測試所有抗體與來自每個組的至少一種代表性抗體的競爭。第一組包括曲妥珠單抗和抗體169、050和084，其彼此阻斷與her2ecdhis的結合，但不交叉阻斷來自其他組的抗體。第二組包括帕妥珠單抗和抗體025、091和129，其彼此阻斷與her2ecdhis的結合，除了抗體129和091都交叉阻斷帕妥珠單抗和025，但彼此不阻斷。沒有任何第2組的抗體阻斷來自其他組的抗體。第三組包括抗體c1、f5、127、098、132、153和159，其沒有交叉阻斷來自其他組的任何抗體。在該第3組中，觀察到一些變化。抗體127是能夠交叉阻斷該組中所有其他抗體結合her2ecdhis的唯一抗體；抗體159交叉阻斷該組中所有其他抗體，除了132；克隆098交叉阻斷第3組中所有抗體，除了132和153；抗體153交叉阻斷127、132和159結合her2ecdhis，但不能交叉阻斷098、c1或f5；克隆132交叉阻斷127、132和153。當作為競爭劑抗體加入時，f5和c1僅僅表明彼此的交叉阻斷。然而，相反的反應還表明與抗體127、098和159，但不是153和132的競爭?？赡艿兀@些差異可能是由于抗體c1和f5對于her2ecdhis的低親和力導致的?？梢酝ㄟ^親合力效應和包含兩種非競爭抗體的抗體-her2ecdhis復合物的形成解釋高于100％的值。表5：her2抗體對于與her2ecdhis的結合的競爭和交叉阻斷示出的值是兩個獨立的實驗中相對于在競爭抗體不存在的情況下觀察到的結合的結合的平均百分比。進行一次用hek產生的th1014-c1和th1014-f5的競爭實驗。還檢測了曲妥珠單抗(臨床級)和hek產生的帕妥珠單抗(th1014-pert)。實施例15-抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)收獲sk-br-3細胞(購于atcchtb-30)(5×106細胞)，洗滌(在pbs中洗滌2次，1500rpm，5min)，并收集在補充10％加強型小牛血清(ccs)(hyclone，logan，ut，usa)的1mlrpmi1640培養(yǎng)基中，其中添加200μci51cr(鉻-51；amershambioscienceseuropegmbh，roosendaal，thenetherlands)。將混合物在振蕩水浴中37℃孵育1.5小時。洗滌細胞(pbs中洗滌2次，1500rpm，5min)后，將細胞重懸于補充10％ccs的rpmi1640培養(yǎng)基中，通過臺盼藍排斥計數并稀釋至1x105細胞/ml的濃度。同時，根據制造商的說明書使用標準ficoll密度離心(淋巴細胞分離介質；lonza，verviers，france)從新鮮棕黃層(buffycoat)(sanquin，amsterdam，thenetherlands)分離外周血單核細胞(pbmcs)。將細胞重懸在補充10％ccs的rpmi1640培養(yǎng)基中后，通過臺盼藍排斥計數細胞，并濃縮至1x107細胞/ml。在cho細胞中生產曲妥珠單抗，導致12.4％的(增加的)非核心巖藻糖基化級別，而在hek細胞中產生其他her2抗體，導致平均4％的非核心巖藻糖基化。對于adcc實驗，50μl51cr-標記的sk-br-3細胞(5.000細胞)與15μg/mlher2抗體(igg1，κ)在96-孔微量滴定板中補充10％ccs的100μlrpmi培養(yǎng)基的總體積中預先孵育。在rt15min后，加入50μlpbmcs(500,000細胞)，產生100：1的效應物與目標的比例。通過將50μl51cr-標記的sk-br-3細胞(5000細胞)與100μl5％triton-x100孵育而測定細胞裂解的最大數量。通過在沒有任何抗體或效應物細胞的情況下在150μl培養(yǎng)基中孵育500051cr-標記的sk-br-3細胞而測定自發(fā)裂解的量。通過在沒有抗體的情況下將5000sk-br-3細胞與500,000pbmcs孵育而測定抗體非依賴性細胞裂解的水平。隨后，在37℃，5％co2孵育細胞4hr。為了確定細胞裂解的量，將細胞離心(1200rpm，3min)并將75μl上清液轉移至細微管(micronictubes)，其后用γ計數器計數釋放的51cr。如下使用測得的每分鐘計數(cpm)來計算抗體介導的裂解的百分比：(cpm樣品-cpm抗體非依賴性裂解)/(cpm最大裂解-cpm自發(fā)裂解))x100％如圖5中所示，來自交叉阻斷組1和2的her2抗體通過adcc誘導sk-br-3細胞的有效裂解。組3中，抗體153是誘導有效的adcc的唯一的抗體，抗體132誘導約10％adcc，克隆098、159和127沒有誘導adcc。實施例16-au565細胞的配體非依賴性增殖的抑制測試her2抗體體外抑制au565細胞的增殖的能力。由于au565細胞上的高her2表達水平(如實施例12中所述的～1,000,000拷貝/細胞)，her2在這些細胞中具有組成型活性，因此不依賴于配體誘導的異源二聚化。在96孔組織培養(yǎng)板(greinerbio-one，frickenhausen，germany)中，在10μg/mlher2抗體存在的情況下在無血清的細胞培養(yǎng)基中每孔接種9000au565細胞。作為對照，在沒有抗體的情況下在無血清的培養(yǎng)基中接種細胞。3天后，根據制造商的說明書以阿爾瑪藍(biosourceinternational，sanfrancisco，us)定量活細胞的量。以標準的阿爾瑪藍設置使用envision2101multilabelreader(perkinelmer，turku，finland)監(jiān)測熒光。將抗體處理的細胞的阿爾瑪藍信號繪制為相對于未處理的細胞的百分比。應用dunnett`s檢驗用于統(tǒng)計學分析。結果如圖6中所示，表示her2抗體處理后的au565細胞相比于未處理的細胞(設置為100％)的百分比增殖。在測試的第1組抗體中，曲妥珠單抗、050和169表現出au565細胞增殖的顯著抑制(p＜0.05)，而084沒有任何影響。來自第2組的測試的抗體(帕妥珠單抗、025、092和129)中沒有一種能夠抑制au565細胞增殖。來自第3組的測試的抗體(098和153)沒有抑制au565增殖。與此相反，兩種抗體都誘導了相比于未處理的細胞的au565細胞的增強的增殖(098超過153)。增強增殖在adc-綴合物的一些治療應用中可以是有利的，例如，當藥物的細胞毒性作用依賴于細胞增殖，或被細胞增殖增強時。對于曲妥珠單抗和帕妥珠單抗，這與juntilla等(cancercell2009；15(5)：353-355)所述的結果相一致。實施例17-mcf-7細胞的配體誘導的增殖的抑制由于her2是孤兒受體，其信號主要依賴于其他erbb家族成員如egfr和her3的活化。配體結合后，這兩種受體可以結合并活化her2受體，導致，例如增殖。各種出版物描述了帕妥珠單抗有效地抑制調蛋白-β1誘導的增殖(franklinmc.cancercell2004/landgrafr.bcr2007)。對于曲妥珠單抗，已經描述了它對于調蛋白-β1誘導的her2/her3異源二聚化和增殖的影響很小(larsenss.，等，breastcancerrestreat2000；58：41-56；agusdb.，等，cancercell2002；2：127-137；wehrman等(2006)，同上)。為了研究本發(fā)明的人her2抗體干擾調蛋白-β1誘導的her2/her3異源二聚體的能力，進行調蛋白-β1誘導的增殖測定。因此，在96孔組織培養(yǎng)板(greinerbio-one)中在完全細胞培養(yǎng)基中接種表達～20.000her2分子/細胞的mcf7細胞(購于atcc，htb-22)(2,500細胞/孔)。4小時后，用包含1％加強型小牛血清(ccs)和10μg/mlher2抗體的饑餓培養(yǎng)基替代細胞培養(yǎng)基。接下來，將在包含1％ccs的饑餓培養(yǎng)基中稀釋的調蛋白-β1(peprotech，princetonbusinesspark，us)加入孔中至1.5ng/ml的終濃度。4天孵育后，根據制造商的說明書以阿爾瑪藍(biosourceinternational)定量活細胞的量。以標準的阿爾瑪藍設置使用envision2101multilabelreader(perkinelmer)監(jiān)測熒光。將her2抗體處理的配體誘導的細胞的阿爾瑪藍信號繪制為相比于沒有her2抗體的情況下孵育的配體誘導的細胞的百分比信號。應用dunnett`s檢驗用于統(tǒng)計學分析。圖7顯示了相對于在不存在her2抗體的情況下以調蛋白-β1刺激后的活細胞(設置為100％)，以調蛋白-β1刺激并用指定的her2抗體處理的活mcf7細胞的百分比。還描述了在調蛋白-β1和抗體兩者都不存在的情況下mcf-7的增殖(沒有增殖)?？贵w025、091、129、153和帕妥珠單抗(th1014-pert)表明了調蛋白-β1誘導的mcf-7增殖的顯著抑制(p＜0.05)。曲妥珠單抗也顯示mcf-7細胞的調蛋白-β1誘導的增殖的一些抑制，盡管沒有和其他測試的her2抗體一樣有效。已經報道了her2的結構域iv參與穩(wěn)定egfr/her2異源二聚體，但沒有關于其對her2/her3異源二聚體的貢獻的詳細信息(wehrman等，同上)?？贵w050、084、169和098對于mcf-7細胞的調蛋白-β1誘導的增殖沒有統(tǒng)計學顯著的影響。不局限于理論，這表明這些抗體沒有抑制配體誘導的her2/her3異源二聚化。實施例18-抗-к-eta’測定為了研究her2抗體對于抗體-藥物綴合物方法的適用性，開發(fā)了使用к-定向的假單胞菌-外毒素a(抗-к-eta′)的通用體外基于細胞的殺死測定法。該測定使用高親和力的綴合于假單胞菌-外毒素a的截短形式的抗-к結構域抗體。內化后，抗-к-eta′結構域抗體經歷蛋白水解和二硫鍵還原，使催化結構域與結合結構域分離。催化結構域經由kdel保留基序從高爾基體運送至內質網，隨后轉位至胞質溶膠，其中它抑制了蛋白合成并誘導細胞凋亡(參見kreitmanrj.biadrugs2009；23(1)：1-13)。在該測定中，為了鑒別能夠內化并且通過毒素殺死的her2受體，在與her2-陽性細胞孵育之前將her2抗體與抗-κ-eta′預先綴合。首先，對于每種細胞系測定抗-κ-eta′的最佳濃度，即，不會導致誘導非特異性的細胞死亡的最大耐受劑量。在96孔組織培養(yǎng)板(greinerbio-one)中正常細胞培養(yǎng)基中接種au565細胞(7500細胞/孔)和a431細胞(2500細胞/孔)并允許粘附至少4小時。接下來，細胞與正常的細胞培養(yǎng)基中100，10，1，0.1，0.01，0.001和0μg/ml抗-κ-eta′稀釋液孵育。3天后，根據制造商的說明書以阿爾瑪藍(biosourceinternational，sanfrancisco，us)定量活細胞的量。以標準的阿爾瑪藍設置使用envision2101multilabelreader(perkinelmer，turku，finland)監(jiān)測熒光。使用不能自身殺死細胞的最高濃度的抗-κ-eta’用于下列實驗(對于au565為0.5μg/ml，對于a431為1μg/ml)。接下來，對于不同的her2抗體測試抗體介導的內化和通過毒素的殺死。如上所述接種細胞。將系列稀釋的her2抗體與預定濃度的抗-κ-eta′預先孵育30分鐘，然后將它們加入細胞。孵育3天后，如上所述定量活細胞的量。將抗-κ-eta′綴合的抗體處理的細胞的阿爾瑪藍信號繪制為相比于僅用抗體處理的細胞的百分比。使用23.4μg/ml星形孢菌素作為細胞殺死的陽性對照。使用同種型對照抗體作為陰性對照。如圖8a、b和圖6中所示，所有抗-κ-eta′綴合的her2抗體能夠以劑量依賴的方式殺死au565細胞。與抗-κ-eta′綴合的曲妥珠單抗和抗-κ-eta′綴合的帕妥珠單抗(th1014-pert)兩者相比，所有測試的抗-κ-eta′綴合的her2抗體表現出au565細胞的更好的殺死。而且，與抗-κ-eta′綴合的曲妥珠單抗(31.9％)和抗-κ-eta′綴合的帕妥珠單抗(47.51％)相比，抗-κ-eta′綴合的her2抗體的殺死的au565細胞的百分比更高(70.3-49.9％)，并且ec50值增加了。與抗-κ-eta′綴合的曲妥珠單抗(78.49ng/ml)和抗-κ-eta′綴合的帕妥珠單抗(117.8ng/ml)相比，抗-κ-eta′綴合的her2抗體的ec50值的范圍為12.12ng/ml和46.49ng/ml之間?？贵w159具有最高百分比的細胞殺死，098具有最低的ec50。表6：顯示的數據是一次代表性實驗中測定的以抗-κ-eta′綴合的her2抗體處理的au565細胞的ec50值和最大百分比細胞殺死。將星形孢菌素誘導的細胞殺死設置為100％，將未處理的細胞的mfi設置為0％。ndet＝未檢測到?？贵w％殺死的細胞ec50ng/mlpc1014-15970.334.93pc1014-12769.034.46pc1014-13261.639.35pc1014-12960.830.85pc1014-15360.332.26pc1014-02560.016.71pc1014-09858.712.12pc1014-08458.126.97pc1014-05052.412.71pc1014-09150.646.49pc1014-16949.935.62th1014-pert47.5117.8曲妥珠單抗31.978.49同種型對照ndetndet如圖8c、d和表7中所示，抗體025、091、098、129和153能夠誘導a431細胞的有效殺死(≥75％)?？贵w098顯示了最高百分比的細胞殺死和最低的ec50。當綴合于抗-κ-eta′時，曲妥珠單抗和同種型對照抗體沒有誘導a431細胞的殺死?？贵w169、084和帕妥珠單抗誘導了不超過約50％的百分比的細胞殺死。用未綴合的her2抗體沒有觀察到任何細胞殺死。表7：顯示的數據是一次代表性實驗中測定的以抗-κ-eta′綴合的her2抗體處理的a431細胞的ec50值和最大百分比細胞殺死。將星形孢菌素誘導的細胞殺死設置為100％，將未處理的細胞的mfi設置為0％?！皀det”意味著未檢測到。抗體％殺死的細胞ec50ng/mlpc1014-02586.7～9.77pc1014-08450.5ndpc1014-09183.3～9.86pc1014-09887.21.65pc1014-12975.9～10.60pc1014-15382.4～10.11pc1014-16934.0ndth1014-pert37.061.58曲妥珠單抗ndetndet同種型對照ndetndet實施例19-用基于fmat的fab-cypher5e分析測定her2抗體的內化為了研究前面實施例中所述的к-毒素-eta’測定中觀察的au565細胞的增強的殺死是否與her2抗體的增強的內化相關，進行基于fab-cypher5e的內化測定。cypher5e是ph敏感性染料，在堿性ph(胞外：培養(yǎng)基)無熒光，在酸性ph值(細胞內：溶酶體)有熒光，酸解離常數(pka)為7.3。在384-孔組織培養(yǎng)板(greinerbio-one)中在補充240ng/mlfab-cypher5e(根據制造商的說明書進行山羊-fab-抗-人igg[jackson]與cypher5e[gehealthcare，eindhoven，thenetherlands]的綴合)的正常細胞培養(yǎng)基中以3000細胞/孔的密度接種au565細胞。接下來，在正常的細胞培養(yǎng)基中系列稀釋her2抗體，加入細胞，并置于室溫9小時。使用8200fmat(appliedbiosystems，nieuwerkerka/dijssel，thenetherlands)測定胞內cypher5e的平均熒光強度(mfi)，并使用‘計數x熒光’作為讀出。使用同種型對照抗體作為陰性對照抗體。使用graphpadprismv4.03軟件(graphpadsoftware，sandiego，ca，usa)通過非線性回歸(具有可變斜率的s型劑量-應答)測定ec50值和最大mfi。結果顯示于表8中，描述了在用au565細胞的cypher5e內化測定中對于所有測試的her2抗體的ec50和最大mfi值。最大mfi值表明在抗體結合后多少her2受體被內化。與曲妥珠單抗(35,000)和帕妥珠單抗(th1014-pert)(32,366)相比，所有her2抗體顯示更高的最大mfi值(137,904-38,801)，表明測試的her2抗體誘導了增強的受體內化。尤其地，和與曲妥珠單抗或th1014-pert競爭的受體相比，不與曲妥珠單抗或th1014-pert競爭的抗體誘導更多的受體內化，其中抗體098和127獲得了最高的mfi。不局限于理論，這可能對于沒有抑制her2異源二聚化的能力是固有的。表8：her2抗體的基于cypher-5的內化測定。顯示的數據是使用以fab-cypher5e-標記的her2抗體處理的au565細胞的兩次實驗中一次代表性實驗的mfi和ec50值。不能計算一些ec50值(nd)。實施例20：通過2-mea-誘導的fab-臂交換產生雙特異性抗體wo2008119353(genmab)中描述了并且vanderneut-kolfschoten等.(science.2007sep14；317(5844)：1554-7)中報道了用于產生雙特異性抗體的體外方法。本文中，通過在輕度還原條件下孵育后兩種單特異性igg4-或igg4-樣抗體之間的“fab-臂”或“半分子”交換(重鏈和結合的輕鏈的交換(swapping))而形成雙特異性抗體。這種fab-臂交換反應是二硫鍵的異構化反應的結果，其中還原單特異性抗體的鉸鏈區(qū)中的重鏈間的二硫鍵，產生的游離半胱氨酸與具有不同特異性的另一種抗體分子的半胱氨酸殘基形成新的重鏈間二硫鍵。產生的產物是具有序列不同的兩個fab臂的雙特異性抗體。在新的發(fā)明中，調整這種自然的igg4fab-臂交換的知識以產生生產穩(wěn)定的基于igg1的雙特異性抗體的方法。通過下面描述的這種方法產生的雙特異性抗體產物將不再參與igg4fab-臂交換。這種方法的基礎是使用互補的(complimentary)ch3結構域，其在特定測定條件下促進異源二聚體的形成。為了實現通過這種方法生產雙特異性抗體，產生在ch3結構域中攜帶某些突變的igg1分子：在一種母體igg1抗體中，t350i，k370t和f405l突變，在另一種母體igg1抗體中，f405l突變。為了產生雙特異性抗體，將這兩種母體抗體，每種抗體的最終濃度為0.5mg/ml(等摩爾濃度)，與100μlte總體積中的25mm2-巰基乙胺-hcl(2-mea)在37℃孵育90分鐘。根據制造商的方案，當通過使用離心柱(microcon離心過濾器，30k，millipore)去除還原劑2-mea時，還原反應終止。實施例21-在體外κ-定向的eta′殺死測定中測試her2×her2雙特異性抗體本實施例顯示，在使用к-定向的假單胞菌-外毒素a(抗-κ-eta′)的通用體外基于細胞的殺死測定中，在內化后，her2×her2雙特異性抗體可以將細胞毒性劑遞送進入腫瘤細胞。該測定使用綴合于假單胞菌-外毒素a的截短形式的高親和力抗-к結構域抗體。以前已經報道了抗體結合蛋白(來自鏈球菌蛋白a或蛋白g的igg結合基序)和白喉毒素或假單胞菌外毒素a的類似融合蛋白(mazory.等，j.immunol.methods2007；321：41-59)；kuosr.等，2009bioconjugatechem.2009；20：1975-1982)。與抗-κ-eta′相反，這些分子結合完整抗體的fc部分。內化和內吞分選(endocyticsorting)后，抗-κ-eta′結構域抗體經歷蛋白水解和二硫鍵還原，使催化結構域與結合結構域分離。然后催化結構域經由kdel保留基序從高爾基體運送至內質網，隨后轉位至胞質溶膠，其中它抑制蛋白合成并誘導細胞凋亡(kreitmanrj.等，biodrugs2009；23：1-13)。本實施例中使用的抗-her2抗體是和。此外，使用下列序列的完全人單克隆的igg1，κ抗體：使用下列抗體作為初始材料：igg1-005-itl＝igg1，κ，其在350位具有ile，在370位具有thr以及在405位具有l(wèi)euigg1-005-k409r＝igg1，κ，其在409位具有argigg1-025-itl＝igg1，к，其在350位具有ile，在370位具有thr以及在405位具有l(wèi)euigg1-153-itl＝igg1，к，其在350位具有ile，在370位具有thr以及在405位具有l(wèi)euigg1-153-k409r＝igg1，κ，其在409位具有argigg1-169-k409r＝igg1，κ，其在409位具有arg以下面的操作類似地產生下列雙特異性抗體。igg1-005-itl×igg1-169-k409riggl-025-itl×igg1-005-k409rigg1-025-itl×igg1-153-k409rigg1-025-itl×igg1-169-k409rigg1-153-itl×igg1-005-k409rigg1-153-itl×igg1-169-k409r根據實施例20中描述的操作生產雙特異性抗體。將包含最終濃度為0.5mg/ml的每種抗體的抗體混合物與100μlte總體積中的25mm2-巰基乙胺hcl(2-mea)在37℃孵育90分鐘。為了終止還原反應，根據制造商的推薦通過使用離心柱(microcon離心過濾器，30k，millipore)將樣品脫鹽而去除還原劑2-mea。將her2×her2雙特異性抗體與抗-κ-eta′預先孵育，然后與a431細胞孵育。a431細胞表達～15,000her2抗體/細胞(通過qifi分析確定)并對‘裸’her2抗體處理不敏感。首先，對于每種細胞系測定抗-κ-eta′的最佳濃度，即，不會導致誘導非特異性的細胞死亡的最大耐受劑量。在96孔組織培養(yǎng)板(greinerbio-one)中正常細胞培養(yǎng)基中接種a431細胞(2500細胞/孔)并允許粘附至少4小時。這些細胞與正常的細胞培養(yǎng)基中100，10，1，0.1，0.01，0.001和0μg/ml抗-κ-eta′系列稀釋液孵育。3天后，根據制造商的說明書以阿爾瑪藍(biosourceinternational，sanfrancisco，us)定量活細胞的量。以標準的阿爾瑪藍設置使用envision2101multilabelreader(perkinelmer，turku，finland)監(jiān)測熒光。使用不能自身殺死細胞的最高濃度的抗-κ-eta’(對于a431細胞為1μg/ml)用于下列實驗。接下來，測試與抗-κ-eta′預先孵育的her2×her2雙特異性抗體和her2單特異性抗體的效果以分析它們誘導細胞殺死的能力。如上所述接種a431細胞。制備her2特異性抗體的稀釋系列(單特異性和雙特異性抗體)并與預定濃度的抗-κ-eta′預先孵育30分鐘，然后將它們加入細胞。在37℃孵育3天后，如上所述定量活細胞的量。將與抗體預先孵育的抗-κ-eta′處理的細胞的阿爾瑪藍信號繪制為相比于在沒有抗體處理的情況下處理的細胞的百分比。使用graphpadprism5軟件計算ec50值和最大的細胞死亡。使用星形孢菌素(23.4μg/ml)作為細胞殺死的陽性對照。使用同種型對照抗體(igg1/κ；igg1-3g8-qitl)作為陰性對照。圖9和表9顯示，所有與her2雙特異性抗體預先孵育的抗-κ-eta′都能夠以劑量依賴的方式殺死a431細胞。這些結果表明，在抗-κ-eta′測定中，大多數測試的her2雙特異性抗體比組合中存在的單特異性抗體更有效。此外，雙特異性抗體005×169，025×169和153×169的效力顯示，可以通過與另一種her2特異性抗體的雙特異性組合增加在這種體外κ-定向的eta′殺死中缺乏活性的單特異性抗體，her2特異性抗體的效力。表9：以抗-κ-eta′綴合的her2×her2雙特異性抗體處理的au565細胞的ec50值和最大百分比細胞殺死?！皀det”意味著未檢測到?？贵w百分比殺死ec50[ng/ml]herceptin2.79ndetigg1-005-itl79.342.57igg1-005-k409r79.832.87igg1-025-itl69.813.76igg1-153-itl70.6612.45igg1-153-k409r72.8415.47igg1-169-k409r16.453.45igg1-005-itlxigg1-169-k409r59.944.28igg1-025-itlxigg1-005-k409r63.454.27igg1-025-itlxigg1-153-k409r80.827.66igg1-025-itlxigg1-169-k409r45.887.97igg1-153-itlxigg1-005-k409r80.054.51igg1-153-itlxigg1-169-k409r84.6829.14實施例22-通過與針對不同her2表位的雙特異性抗體的孵育下調her2受體her2×her2雙特異性抗體可以結合兩個空間上不同的her2受體上的兩個不同的表位。這允許其他her2×her2雙特異性抗體結合這些受體上的剩余的表位。這可以導致多價受體交聯(lián)(與通過單價抗體誘導的二聚化相比)，并因此增強受體下調。為了研究her2×her2雙特異性抗體是否誘導her2的增強的下調，將au565細胞與抗體和雙特異性抗體孵育3天。測定her2的總水平和抗體結合的her2的水平。將au565細胞接種于24孔組織培養(yǎng)板(100.000細胞/孔)中的正常細胞培養(yǎng)基中，并在10μg/ml具有itl或k409r突變的her2抗體或her2×her2雙特異性抗體存在的情況下在37℃培養(yǎng)3天。作為對照，還測試了終濃度為10μg/ml的兩種具有未修飾的igg1骨架的單特異性her2抗體的組合(1∶1)。用pbs洗滌后，通過在室溫下用25μlsurefire裂解緩沖液(perkinelmer，turku，finland)孵育細胞30min而裂解細胞。根據制造商的方案使用二喹啉甲酸(bca)蛋白測定試劑(pierce)定量總蛋白水平。使用her2特異性夾心elisa分析裂解物中的her2蛋白水平。使用兔-抗-人her2胞內結構域抗體(cellsignaling)來捕獲her2，使用生物素化的山羊-抗人her2多克隆抗體r&dsystems，minneapolis，usa)以及隨后的鏈霉親和素-聚-hrp來檢測結合的her2。使用2，2′-連氮基-雙3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(在50mlabts緩沖液中稀釋的abts片劑[rochediagnostics，almere，thenetherlands])使反應可視化并用草酸(sigma-aldrich，zwijndrecht，thenetherlands)終止。在微量滴定板讀數器(biotekinstruments，winooski，usa)上測定405nm處的熒光，her2的量表示為相對于未處理的細胞的百分比。結果如圖10和表10中所示，其中顯示了所有測試的her2×her2雙特異性抗體誘導≥40％的her2下調。有趣的是，所有her2×her2雙特異性抗體顯示了與它們的單特異性對應物相比的增加的her2下調。表10：表示為與未處理的細胞相比的百分比her2的her2×her2雙特異性誘導的her2的下調?？贵w與未處理的細胞相比的her2的％herceptin71igg1-005-itl54igg1-005-k409r50igg1-025-itl64igg1-153-itl43igg1-153-k409r40igg1-169-k409r64igg1-005-itlxigg1-169-k409r29igg1-025-itlxigg1-005-k409r38igg1-025-itlxigg1-153-k409r29igg1-025-itlxigg1-169-k409r34igg1-153-itlxigg1-005-k409r23igg1-153-itlxigg1-169-k409r28igg1-005+igg1-16928igg1-025+igg1-00528igg1-025+igg1-15323igg1-025+igg1-16925igg1-153+igg1-00523igg1-153+igg1-16923同種型對照108實施例23-通過共聚焦顯微鏡分析her2×her2雙特異性抗體與溶酶體標記lamp1的共定位如實施例22中描述的her2下調測定表明，her2×her2雙特異性抗體能夠增加her2的溶酶體降解。為了驗證這些發(fā)現，應用共聚焦顯微鏡技術。使au565細胞在玻璃蓋玻片(厚度為1.5微米，thermofisherscientific，braunschweig，germany)上的標準組織培養(yǎng)基中在37℃生長3天。將細胞與50μg/ml亮抑酶肽(sigma)預先孵育1小時以阻斷溶酶體活性，其后加入10μg/mlher2單特異性抗體或her2×her2雙特異性抗體。還測試了終濃度為10μg/ml的兩種單特異性igg1抗體的組合(1∶1)。將細胞在37℃孵育額外的3或18小時。此后用pbs洗滌細胞，用4％甲醛(klinipath)在室溫孵育30分鐘。用封閉緩沖液(補充0.1％皂苷[roche]和2％bsa[roche]的pbs)洗滌載玻片，用包含20mmnh4cl的封閉緩沖液孵育20分鐘以淬滅甲醛。用封閉緩沖液再次洗滌載玻片，與小鼠-抗-人cd107a(lamp1)(bdpharmingen)在室溫孵育45min以染色/鑒別溶酶體。用封閉緩沖液洗滌之后，用二級抗體；山羊-抗-小鼠igg-cy5(jackson)和山羊-抗-人igg-fitc(jackson)的雞尾酒在室溫孵育玻片30min。用封閉緩沖液再次洗滌玻片，用20μl封固介質(將6克甘油[sigma]和2.4克mowiol4-88[omnilabo]溶解于6ml蒸餾水中，其中加入12ml0.2mtris[sigma]ph8.5，隨后在50-60℃孵育10分鐘。將封固介質等分并存儲在-20℃)在顯微玻片上封固過夜。用配備63x1.32-0.6浸油物鏡和las-af軟件的leicaspe-ii激光共聚焦顯微鏡(leicamicrosystems)對玻片成像。為了允許定量重疊的像素強度，應該避免像素的飽和。因此，將fitc激光強度下降至10％，將smartgain設置在830v，將smartoffset設置在-9.48％。通過使用這些設置，在沒有像素飽和的情況下清晰地顯示雙特異性抗體，但是單特異性抗體有時難以檢測。為了比較單特異性和雙特異性抗體之間的溶酶體共定位，對于所有分析的共聚焦玻片將這些設置保持相同。使用軟件(版本metaseries6.1，moleculardevicesinc，sunnyvalecalifornia，usa)對12位灰度tiff圖像分析共定位。將fitc和cy5圖像作為堆棧(stacks)導入，減去背景。對于所有fitc圖像和所有cy5圖像使用相同的閾值設置(手動設定)。共定位表示為在重疊區(qū)域(roi)中的fitc像素強度，其中roi由所有cy5陽性區(qū)域構成。為了比較用數種her2抗體、her2xher2雙特異性抗體或兩種不同的單特異性抗體的組合染色的不同的玻片，用cy5的像素強度對圖像進行歸一化。使用山羊-抗-小鼠igg-cy5來染色溶酶體標記lamp1(cd107a)。在測試的各種her2抗體或her2xher2雙特異性抗體之間的lamp1的像素強度不應該不同(一個細胞具有約200.000的cy5像素強度)。對于fitc和cy5的共定位的均一化的值＝[(tpi-fitc×百分比fitc-cy5共定位)/100]×[200.000/tpi-cy5]在此公式中，tpi代表總的像素強度。圖11和表11表示通過與cy5重疊的fitc像素強度測定的各種單特異性her2抗體和her2×her2雙特異性抗體的活細胞的百分比。對于表示的每種抗體或雙特異性分子，從一個玻片分析三個不同的包含～1、3或＞5個細胞的圖像。在每個玻片內的不同圖像之間觀察到顯著的差異。然而，顯然，當與所有her2×her2雙特異性抗體的單特異性對應物相比時，所有her2×her2雙特異性抗體顯示出與溶酶體標記lamp1的共定位。這些結果表明，一旦內化，her2xher2雙特異性抗體有效地向溶酶體區(qū)室分選，使它們適合用于雙特異性抗體藥物綴合方法。表11：描述為任意單位的與cy5重疊的平均fitc像素強度抗體溶酶體中的fitc像素強度[任意單位]herceptin0.218igg1-005-itl0.070igg1-025-itl0.268igg1-153-itl0.102igg1-169-k409r0.220igg1-005-itlxigg1-169-k409r0.531igg1-025-itlxigg1-005-k409r0.347igg1-025-itlxigg1-153-k409r0.582igg1-025-itlxigg1-169-k409r0.439igg1-153-itlxigg1-005-k409r0.494igg1-153-itlxigg1-169-k409r0.604igg1-025+igg1-1690.576igg1-153+igg1-0050.636igg1-153+igg1-1690.626實施例24-與her2單特異性或her2×her2雙特異性抗體孵育后，au565細胞的增殖的抑制測試her2×her2雙特異性抗體體外抑制au565細胞的增殖的能力。由于au565細胞上的高her2表達水平(用qifi-試劑盒測定的～1.000.000拷貝/細胞)，her2在這些細胞中具有組成型活性，因此不依賴于配體誘導的異源二聚化。在96孔組織培養(yǎng)板(greinerbio-one，frickenhausen，germany)中，在10μg/mlher2抗體或her2xher2雙特異性抗體存在的情況下在無血清的細胞培養(yǎng)基中每孔接種9.000au565細胞。作為對照，在沒有抗體或雙特異性抗體的情況下在無血清的培養(yǎng)基中接種細胞。3天后，根據制造商的說明書以阿爾瑪藍(biosourceinternational，sanfrancisco，us)定量活細胞的量。以標準的阿爾瑪藍設置使用envision2101multilabelreader(perkinelmer，turku，finland)監(jiān)測熒光。將抗體處理的細胞的阿爾瑪藍信號繪制為相對于未處理的細胞的百分比。圖12和表12描述了在與her2抗體和her2×her2雙特異性抗體孵育之后au565細胞的阿爾瑪藍的熒光強度。包括(曲妥珠單抗)作為陽性對照，顯示出如juntillatt.等，cancercell2009；15：429-440中所述的增殖的抑制。所有her2×her2雙特異性抗體能夠抑制au565細胞的增殖。雙特異性抗體：在該測定中，與單特異性抗體對應物相比，igg1-005-itl×igg1-169-k409r和igg1-025-itl×igg1-005-k409r更有效。表12：在her2×her2雙特異性抗體處理之后的百分比活au565細胞?？贵w百分比活的細胞herceptin62igg1-005-itl91igg1-005-k409r96igg1-025-itl79igg1-153-itl98igg1-153-k409r97igg1-169-k409r63igg1-005-itlxigg1-169-k409r49igg1-025-itlxigg1-005-k409r61igg1-025-itlxigg1-153-k409r74igg1-025-itlxigg1-169-k409r76igg1-153-itlxigg1-005-k409r71igg1-153-itlxigg1-169-k409r77同種型對照95實施例25-在體外細胞毒性測定中測試her2×cd3雙特異性抗體cd3是成熟t細胞上表達的t細胞受體復合物中的共受體。雙特異性抗體中cd3特異性抗體fab-臂與腫瘤抗原特異性抗體fab-臂的組合會導致t細胞特異性靶向至腫瘤細胞，導致t細胞介導的腫瘤細胞裂解。同樣，cd3陽性t細胞可以靶向至體內其他出軌的(derailed)細胞，靶向至被感染的細胞，或直接靶向至病原體。產生her2×cd3雙特異性抗體。對于her2特異性fab-臂的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列如實施例21中對于抗體153和169所述指明的。使用下列cd3特異性fab-臂的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列：(routledge等，eurjimmunol.1991，21(11)：2717-25所述的序列)(parren等，resimmunol.1991，142(9)：749-63所述的序列。引入較少的氨基酸取代使序列類似于最接近的人種系。)如下將所有抗體表示為在它們的fc區(qū)被修飾的igg1，κ：igg1-her2-153-k409r和igg1-her2-153-n297q-k409r，igg1-her2-169-k409r，igg1-hu-clb-t3/4-f405l和igg1-hu-clb-t3/4-n297q-f405l，igg1-yth12.5-f405l和igg1-yth12.5-n297q-f405l。如實施例20中所述從這些her2和cd3特異性抗體產生雙特異性抗體并使用au565細胞在體外細胞毒性測定中測試。培養(yǎng)au565細胞至接近匯合。用pbs兩次洗滌細胞，在37℃胰蛋白酶消化5分鐘。加入12ml培養(yǎng)基以失活胰蛋白酶，800rpm5min離下細胞。細胞重懸浮于10ml培養(yǎng)基，通過將細胞傳遞通過細胞過濾器而制備單細胞懸浮液。將100μl5x105細胞/ml懸浮液加入96孔培養(yǎng)板的每個孔中，在37℃，5％co2培養(yǎng)細胞至少3小時以允許粘附至板。根據制造商的方案(greinerbio-one)使用leucosep30ml管從健康志愿者的血液分離外周血單核細胞(pbmc)。使用untouchedhumant-cellsdynabead試劑盒(dynal)通過陰性選擇從pbmc制備物分離t細胞。將分離的細胞重懸浮于培養(yǎng)基中至終濃度為約7×106細胞/ml。從粘附的au565細胞除去培養(yǎng)基，用50μl/孔2x濃縮的抗體稀釋液和50μl/孔7×106t細胞/ml替代(效應物∶目標比例＝7∶1)。平板在37℃，5％co2孵育3天。除去上清液，用pbs洗滌平板兩次。將150μl培養(yǎng)基和15μl阿爾瑪藍溶液加入每個孔中。平板在37℃，5％co2孵育4天并測定吸光度(envision，perkinelmer)。圖13和表13顯示，盡管對照抗體(her2單特異性的igg1-，cd3單特異性的igg1-yth12.5和單特異性的igg1-huclb-t3/4，不相關的抗原單特異性igg1-b12和cd3×b12雙特異性抗體)沒有誘導t細胞介導的細胞毒性，雙特異性(duo)her2×cd3抗體huclb/her2-153、huclb/her2-169、yth12.5/her2-153和yth12.5/her2-169誘導了au565細胞的劑量依賴性的t細胞介導的細胞毒性。包含her2-169的雙特異性抗體比包含her2-153的那些抗體更有效。制備包含n297q突變的igg1-hu-clb-t3/4、igg1-yth12.5和her2-153的突變體以除去糖基化位點；在該位點的糖基化對于igg-fcγ受體相互作用是關鍵的(bolts等，eurjimmunol1993，23：403-411)。圖13顯示，her2×cd3雙特異性抗體yth12.5/her2-153和huclb/her2-153的n297q突變和因此不存在fc糖基化不影響誘導au565細胞的劑量依賴性t細胞介導的細胞毒性的能力。表13：her2×cd3雙特異性抗體誘導的細胞殺死的ec50值?！皀det”意味著未檢測到。抗體ec50[ng/ml]herceptinndetduohuclb-q/153-q10.55duohuclb-q/b12-qndethuclb-qndetb12-qndetduoyth12.5-q/153-q10.73duoyth12.5-q/b12-qndetyth12.5-qndetb12-qndet實施例26-her2下調為了研究第3組抗體098和153誘導的增強的her2內化是否也導致增強的受體下調，將au565細胞與her2抗體孵育3天并分析her2的存在。將au565細胞接種于24孔組織培養(yǎng)板(100.000細胞/孔)中的正常細胞培養(yǎng)基中，并在10μg/mlher2抗體存在的情況下在37℃培養(yǎng)3天。用pbs洗滌后，通過在室溫下用25μlsurefire裂解緩沖液(perkinelmer，turku，finland)孵育30min而裂解細胞。根據制造商的方案使用二喹啉甲酸(bca)蛋白測定試劑(pierce)定量總蛋白水平。使用her2特異性夾心elisa分析裂解物中的her2蛋白水平。使用兔-抗-人her2胞內結構域抗體(cellsignaling)來捕獲her2，使用生物素化的山羊-抗-人her2多克隆抗體(r&d)以及隨后的鏈霉親和素-聚-hrp來檢測結合的her2。使用2，2′-連氮基-雙3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(abts：在50mlabts緩沖液中稀釋abts片劑[rochediagnostics，almere，thenetherlands])使反應可視化并用草酸(sigma-aldrich，zwijndrecht，thenetherlands)終止。在微量滴定板讀數器(biotekinstruments，winooski，usa)上測定405nm處的熒光，her2的量表示為相對于未處理的細胞的百分比。圖14和表14中所示的結果表明，兩種第3組抗體(098和153)都誘導了超過50％的her2下調。與此相反，抗體025、169和herceptin勉強地誘導了下調(未處理的細胞的約20％)。這與抗體098和153觀察到的增強的內化相一致。表14：表示為與未處理的細胞相比的百分比her2的抗體誘導的her2的下調。抗體與未處理的細胞相比的her2的％herceptin80igg1-1014-16982igg1-1014-02585igg1-1014-09844igg1-1014-15350同種型對照108實施例27-通過共聚焦顯微鏡分析her2抗體與溶酶體標記lamp1的共定位實施例26中所述的her2下調和實施例19中所述的基于cypher-5e的內化測定表明，與來自來自第1和2組的抗體相比，第3組的her2抗體更有效地內化并靶向至溶酶體。然而，在這些實驗中，進行共焦成像，其設置允許區(qū)分單特異性和雙特異性抗體，但不能區(qū)分不同的單特異性抗體，事實上，使用這些設置，幾乎不能檢測單特異性抗體。為了能夠在不同的單特異性抗體之間比較，使用增加的增益設置(increasedgain)再次測定共聚焦玻片以增加熒光強度。該操作的所有步驟都是和實施例23中所述的相同。結果如圖15和表15中所示，其顯示了對于各種單特異性her2抗體的與cy5重疊的fitc像素強度。分析每個玻片中包含～1、3或＞5個細胞的三個不同的圖像。在每個玻片內的不同圖像之間觀察到顯著的差異。仍然顯然的是，與025、帕妥珠單抗、169和herceptin相比，抗體098和153更有效地靶向至溶酶體區(qū)室。這與這些抗體誘導的增強的內化和受體降解很好地相關。表15：描述為任意單位的與cy5重疊的平均fitc像素強度抗體溶酶體中的fitc像素強度[任意單位]th1014-0980.522th1014-1530.409th1014-0250.248th1014-pert0.214th1014-1690.255herceptin0.236實施例28-her2胞外結構域改組，人至雞為了進一步定義來自四個不同的交叉競爭組的抗體識別的her2結合區(qū)域，進行her2胞外結構域改組實驗(extracellulardomainshuffleexperiment)。為此，產生具有5個構建體的小基因合成文庫，將人her2的胞外結構域的結構域i、ii、iii或iv的序列交換至雞her2的對應序列(原雞屬原雞同種型bncbi：np_001038126.1)：1)完整的人her2(uniprotp04626)，以下命名為hu-her2，2)具有雞結構域i的hu-her2(用對應的雞her2區(qū)域替換人her2的氨基酸(aa)1-203)，以下命名為hu-her2-ch(i)，3)具有雞結構域ii的hu-her2(用對應的雞her2區(qū)域替換人her2的氨基酸(aa)204-330)，以下命名為hu-her2-ch(ii)，4)具有雞結構域iii的hu-her2(用對應的雞her2區(qū)域替換人her2的aa331-507)，以下命名為hu-her2-ch(iii)，5)具有雞結構域iv的hu-her2(用對應的雞her2區(qū)域替換人her2的aa508-651)，以下命名為hu-her2-ch(iv)。人和雞her2直向同源物(orthologs)顯示它們的胞外結構域中67％同源性，其中結構域i中62％同源性，結構域ii中72％同源性，結構域iii中63％同源性以及結構域iv中68％同源性。根據制造商的說明書，使用freestylemax轉染試劑(invitrogen)將構建體瞬時轉染進freestyletmcho-s(invitrogen)細胞系，培養(yǎng)轉染的細胞20小時。通過流式細胞儀分析her2抗體與轉染的細胞的結合：收獲轉染的cho-s細胞，用facs緩沖液洗滌，并用10μg/mlher2抗體孵育(在冰上30分鐘)。使用藻紅蛋白(pe)-綴合的山羊-抗-人igg抗體(jackson)檢測her2抗體的結合。為了檢查不同批次之間的表達是否相同，固定細胞并根據制造商的說明書用cytofix/cytoperm溶液(bd)通透，使用與兔-抗-人胞內her2抗體(dako)組合的二級的pe-綴合的山羊-抗-兔抗體(jackson)染色。使用同種型對照抗體作為陰性對照。在facscanto-ii(bd)上測定熒光，使用graphpadprismv4.03軟件(graphpadsoftware，sandiego，ca，usa)通過非線性回歸(具有可變斜率的s型劑量-應答)制作結合曲線。使用結合的損失作為讀出，以鑒別不同的抗體識別哪些her2結構域?？贵w153的示例性結合曲線如圖16中所示。所有的結合結果如表16中所示。第1組her2抗體050、084、169和herceptin顯示與hu-her2-ch(iv)的結合的損失，但沒有顯示與具有剩余的改組的結構域之一的蛋白的結合的損失，表明第1組mabs的表位位于her2結構域iv中。第2組抗體025、091、129和帕妥珠單抗僅顯示與hu-her2-ch(ii)的結合的損失，表明表位位于her2結構域ii中?？贵w098和153在交叉競爭中都被定義至第3組，但是在改組實驗中卻顯示一些變化。抗體098清楚地顯示與hu-her2-ch(i)的結合的損失以及與hu-her2-ch(ii)的結合的輕微下降，而153僅顯示與hu-her2-ch(ii)的結合的損失。這些數據提示，第3組mabs098和153也可以，至少部分地，與her2結構域ii結合，該結構域具有可能延伸至her2結構域i的表位，正如098的情況一樣。表16：her2抗體與不同的her2ecd受體構建體的結合的總結。fl；hu-her2，i；hu-her2-ch(i)，ii；hu-her2-ch(ii)，iii；hu-her2-ch(iii)，iv；hu-her2-ch(iv)。+++表示正常結合，++表示與hu-her2觀察的結合相比降低的ec50但相似的最大結合，+表示與hu-her2觀察的結合相比降低的ec50和降低的最大結合，-表示沒有結合。實施例29-在scid小鼠中的nci-n87人胃癌異種移植物中her2humabs091、084和169的體內效力測定her2-humabs091(交叉競爭組2)、084和169(都是交叉競爭組1)對雌性cb.17嚴重聯(lián)合免疫缺陷(scid)小鼠中的nci-n87人胃癌異種移植物模型中腫瘤生長和生存的體內作用。將在50％基質膠中的10×106nci-n87腫瘤細胞s.c.注射進雌性scid小鼠，每組10只小鼠。腫瘤接種后8天，開始用her2-humabs091、084和169或對照抗體humab-hepc的靜脈處理。在圖17(a)中，這表示為第1天，即處理開始的當天。首次劑量為40mg/kg，隨后在處理開始后4、8、11、15、18、22和25天為10mg/kg。每周至少2次測定腫瘤體積。從卡尺(plexx)測量值計算體積(mm3)：(寬度2×長度)/2。結果如圖17a和17b中所示，這表明，與接受陰性對照抗體humab-hepc的小鼠相比，humab084、169和091施用的小鼠顯示更慢的腫瘤生長(a)和更好的生存(b)。所有處理都耐受性良好。實施例30-balb/c裸鼠中的bt-474乳腺腫瘤異種移植物的治療性處理測定五種不同的her2humabs的治療性處理對balb/c裸鼠中的人皮下的bt-474乳腺腫瘤異種移植物的影響。用γ-源(1.8gy，co60，biomep，france)的全身輻射后24-72小時注射bt-474腫瘤細胞。將200μl包含基質膠的rpmi1640(50∶50，v∶v；bdbiosciences)中的2×107bt-474細胞皮下注入雌性balb/c裸鼠的右側。每周兩次記錄小鼠的體重和腫瘤體積。從卡尺(plexx)測量值計算腫瘤體積(mm3)：(寬度2×長度)/2。當腫瘤達到100-200mm3的平均體積時，開始用her2humabs處理。將具有腫瘤的小鼠隨機化進8只小鼠的組中。一組接受對照mabhumab-hepc的每周兩次的靜脈內(i.v.)注射。其他四組接受her2humab025、129、153和091的每周兩次的i.v.注射，首次劑量為20mg/kg，隨后9次劑量為5mg/kg。結果如圖18a和18b中所示，其顯示，用humab129和humab153處理部分抑制了bt-474腫瘤生長(與humab-hepc對照處理相比約30和50％的抑制)。humab-025和humab-091強烈抑制bt-474腫瘤生長，這些抗體顯著延遲了達到800mm3的腫瘤體積的時間。在接受her2humab的小鼠中也改善了生存。序列表<110>genmaba/s<120>針對her2的單克隆抗體<130>p/62.wo<160>174<170>patentinversion3.5<210>1<211>121<212>prt<213>智人<400>1glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr202530glyilesertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glytrpleuseralatyrserglyasnthriletyralaglnlysleu505560glnglyargvalthrmetthrthraspthrserthrthrthralatyr65707580metgluleuargserleuargseraspaspthralavaltyrtyrcys859095alaargaspargilevalvalargproasptyrpheasptyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserser115120<210>2<211>8<212>prt<213>智人<400>2glytyrthrphethrasntyrgly15<210>3<211>8<212>prt<213>智人<400>3leuseralatyrserglyasnthr15<210>4<211>14<212>prt<213>智人<400>4alaargaspargilevalvalargproasptyrpheasptyr1510<210>5<211>107<212>prt<213>智人<400>5gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalsersertyr202530leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile354045tyraspalaserasnargalathrglyileproalaargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglupro65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnargserasntrpproarg859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>6<211>6<212>prt<213>智人<400>6glnservalsersertyr15<210>7<211>9<212>prt<213>智人<400>7glnglnargserasntrpproargthr15<210>8<211>119<212>prt<213>智人<400>8gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530alametasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045seralaileserglyargglyglythrthrtyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr65707580leuglnmetserserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alalysalaargalaasntrpasptyrpheasptyrtrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserser115<210>9<211>8<212>prt<213>智人<400>9glyphethrphesersertyrala15<210>10<211>8<212>prt<213>智人<400>10ileserglyargglyglythrthr15<210>11<211>12<212>prt<213>智人<400>11alalysalaargalaasntrpasptyrpheasptyr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