本發(fā)明屬于多克隆抗體領(lǐng)域，具體涉及龍膽苦苷半抗原、人工抗原、多克隆抗體制備及其elisa檢測方法的建立。

背景技術(shù)：

龍膽苦苷(gentiopicroside，gtp)為裂環(huán)環(huán)烯萜苷類化合物，屬于半萜類物質(zhì)，分子式為c16h20o9，分子量為356.32，白色針狀晶體，易溶于甲醇。是藥用植物秦艽中最主要有效成分，存在于龍膽科龍膽屬植物中，具有特殊的藥理活性，主要包括鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎、抗病毒、保肝利膽、健胃、降壓等功效。

龍膽苦苷目前在臨床中應(yīng)用極為廣泛，隨著對龍膽苦苷藥理作用的不斷開發(fā)利用，使得其野生資源保有量急劇下降，中藥秦艽已被列為國家三級保護藥材，市場上難免會有假冒偽劣的秦艽藥材出現(xiàn)，所以，建立簡單高效的中藥有效成分檢測技術(shù)為成為當(dāng)務(wù)之急。

酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)對于小分子化合物的檢測與分析是一種新興技術(shù)，目前，在中藥有效成分的檢測分析中得以廣泛應(yīng)用。建立elisa方法的基本路線是通過中藥有效成分人工抗原的合成制備多克隆抗體或單克隆抗體，并建立elisa法檢測技術(shù)。相比于傳統(tǒng)的檢測分析方法，elisa法具有很大的優(yōu)勢，該法具有高靈敏性和高特異性，操作簡單，樣品的前處理過程得以極大程度的簡化，無需使用昂貴的儀器設(shè)備，對操作人員的技能要求不高，適合推廣應(yīng)用于基層。

現(xiàn)有技術(shù)中尚不存在龍膽苦苷人工抗原的制備及其elisa檢測方法的報道。而小分子化合物人工抗原的制備是建立其elisa檢測方法的難點，不同的分子結(jié)構(gòu)偶聯(lián)載體蛋白的位置、種類互不相同，為了實現(xiàn)檢測方法的靈敏度高、特異性強的特點還需要對免疫抗原、包被抗原條件進行優(yōu)化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種龍膽苦苷的人工抗原制備及間接競爭elisa檢測的建立方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

一種龍膽苦苷人工抗原，該人工抗原包括含有羧基的龍膽苦苷半抗原分子以及通過所述羧基與該半抗原分子偶聯(lián)的載體蛋白，所述載體蛋白選自牛血清白蛋白bsa或雞卵清蛋白ova，所述半抗原分子的結(jié)構(gòu)如式i所示：

上述龍膽苦苷人工抗原的制備方法，包括以下步驟：

1)采用琥珀酸酐法對龍膽苦苷進行結(jié)構(gòu)修飾

將55～60mg龍膽苦苷、95～105mg琥珀酸酐及3～5ml吡啶混合后于100～115℃回流7～13h，得反應(yīng)液，將反應(yīng)液以及3～5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)36～38％鹽酸與18～22ml的≤4℃蒸餾水混合后用氯仿萃取，除去氯仿層后通過減壓蒸餾(≤160℃)得棕色粉末，即為龍膽苦苷半抗原(式i)，記為gtp-sa；

2)利用混合酸酐法將龍膽苦苷半抗原與載體蛋白偶聯(lián)

2.1)將15～25mggtp-sa、0.4～0.6ml二甲基甲酰胺以及70～80μl三正丁胺混合后冷卻至0～1℃，得混合物，向混合物中加入15～25μl氯甲酸異丁酯后于9～11℃下攪拌25～35min，得到反應(yīng)液a；

2.2)將65～75mg牛血清白蛋白bsa和65～75mg雞卵清蛋白ova分別加入至5～7ml二甲基甲酰胺:水的體積比為1:3～5的混合溶劑中，得到含有bsa的反應(yīng)液b1和含有ova的反應(yīng)液b2；

2.3)將反應(yīng)液a平均分成2份，分別加入至反應(yīng)液b1和b2中于0～1℃攪拌混勻，得到混合后的反應(yīng)液a-b1和a-b2，將a-b1和a-b2置于3～5℃下攪拌10～12h；

3)龍膽苦苷人工抗原gtp-bsa和gtp-ova的純化

經(jīng)過步驟2)后，將a-b1和a-b2分別裝入截留分子量為8000～14000的透析袋中，以磷酸鹽緩沖液為透析液，在3～5℃下透析3～4天，在透析處理期間，每間隔5～7小時換一次透析液；然后，將透析處理后的a-b1進行冷凍干燥，得龍膽苦苷人工抗原gtp-bsa，將透析處理后的a-b2進行冷凍干燥，得龍膽苦苷人工抗原gtp-ova。

一種龍膽苦苷間接競爭elisa檢測的建立方法，包括以下步驟：

1)利用琥珀酸酐法對龍膽苦苷進行結(jié)構(gòu)修飾，得到含有羧基的龍膽苦苷半抗原(式i)；

2)利用混合酸酐法將龍膽苦苷半抗原分別與牛血清白蛋白bsa及雞卵清蛋白ova偶聯(lián)，制備得到相應(yīng)的兩種龍膽苦苷人工抗原gtp-bsa及gtp-ova；

3)運用兩種龍膽苦苷人工抗原分別對動物進行免疫，結(jié)合利用間接elisa檢測，并以相對應(yīng)的另一種人工抗原為包被抗原測定動物抗血清的效價，從而確定可獲得最優(yōu)抗血清效價的動物免疫方案；

4)以龍膽苦苷為競爭抗原，通過測定龍膽苦苷對抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的競爭抑制率，從而建立針對龍膽苦苷的競爭抑制曲線以及間接競爭elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線。

所述對動物進行免疫具體包括以下步驟：以gtp-bsa或gtp-ova為免疫抗原，將免疫抗原用生理鹽水稀釋至2～4mg/ml，取1～5ml稀釋后的免疫抗原與該免疫抗原體積10～15％的佐劑混勻，然后對以基礎(chǔ)飼料或谷胱甘肽抗應(yīng)激飼料飼喂的動物通過多次肌肉多點注射完成免疫。

所述間接elisa檢測中，包被抗原的包被濃度為1:1000～1:8000，包被液為碳酸鹽緩沖液，封閉液為山羊血清:pbs的體積比為1:8～12的混合液，酶標(biāo)二抗的濃度為1:1000～1:10000。

所述間接競爭elisa檢測中，競爭反應(yīng)時間為10～60min，龍膽苦苷溶劑為體積分?jǐn)?shù)為10～50％的甲醇水溶液。

所述建立方法還包括以下步驟：

根據(jù)龍膽苦苷濃度為橫坐標(biāo)的間接競爭elisa競爭抑制曲線獲得檢測靈敏度；根據(jù)龍膽苦苷濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)的間接競爭elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得其線性回歸方程；根據(jù)龍膽苦苷的檢測靈敏度與其結(jié)構(gòu)相似物的檢測靈敏度比值得到交叉反應(yīng)率。

所述結(jié)構(gòu)相似物選自獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、梔子苷、馬錢苷和橄欖苦苷。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明首先利用琥珀酸酐法對秦艽中有效成分龍膽苦苷結(jié)構(gòu)進行修飾，在分子結(jié)構(gòu)中引入可直接與載體蛋白相結(jié)合的羧基，從而形成半抗原，然后將該半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，制備得到人工抗原。所制備的人工抗原可以用于龍膽苦苷高靈敏度和特異性elisa檢測方法的建立。本發(fā)明通過龍膽苦苷多克隆抗體的制備及龍膽苦苷elisa檢測方法的建立，為有效成分龍膽苦苷的檢測開辟了一條新路徑，提供了一種新思路和一項新技術(shù)。為快速尋找新藥源和快速鑒別藥材真?zhèn)翁峁┝丝赡?，有利于相關(guān)天然藥物的開發(fā)利用，并可以成為儀器分析技術(shù)的補充方法，加速了中醫(yī)藥現(xiàn)代化進程。

附圖說明

圖1為gtp-sa的合成路線圖；

圖2為gtp標(biāo)準(zhǔn)品(a)和半抗原gtp-sa(b)的質(zhì)譜圖；

圖3為gtp-bsa和gtp-ova的薄層色譜圖；圖中：1、gtp；2、bsa；3、ova；4、gtp-bsa；5、gtp-ova；

圖4為gtp-sa、bsa、ova、gtp-bsa、gtp-ova的紫外圖譜；其中：(a)為gtp-sa、bsa和gtp-bsa的全波長掃描結(jié)果；(b)為gtp-sa、ova和gtp-ova的全波長掃描結(jié)果；

圖5為龍膽苦苷人工抗原和載體蛋白的ir圖譜；

圖6為載體蛋白和人工抗原的sds-page圖；圖中：1、gtp-ova；2、ova；3、gtp-bsa；4、bsa；

圖7為抗體產(chǎn)生的動態(tài)曲線圖；

圖8為沖擊免疫后4組大白兔抗血清的p/n值。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明。

本發(fā)明選用琥珀酸酐法對龍膽苦苷進行結(jié)構(gòu)修飾，通過薄層色譜法(thinlayerchromatography，tlc)、紅外光譜法(infraredspectroscopy，ir)、紫外-可見分光光度計法(ultravioletandvisiblespectrophotpmetry，uv)、質(zhì)譜法(ms)等進行鑒定分析，經(jīng)過修飾獲得含有羧基的半抗原分子(即龍膽苦苷半抗原，gtp-sa)。再利用混合酸酐法將gtp-sa分別與兩種載體蛋白，即牛血清白蛋白(bsa)和雞卵清蛋白(ova)進行偶聯(lián)，獲得兩種人工抗原(gtp-bsa和gtp-ova)，并且經(jīng)過tlc、uv、三硝基苯磺酸法(tnbs)、ir和sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(sds-polyacrylamidegelelectrophoresis，sds-page)進行鑒定分析。用兩種人工抗原gtp-bsa和gtp-ova對新西蘭大白兔進行免疫，并對兔子的血清效價、靈敏度和特異性等方面進行分析，確定免疫抗原和包被抗原等必要參數(shù)，從而建立基于間接競爭elisa的龍膽苦苷檢測方法。

(一)龍膽苦苷多克隆抗體的制備

(1)龍膽苦苷半抗原gtp-sa的合成、純化與鑒定

參見圖1，取50mg龍膽苦苷、100mg琥珀酸酐置于反應(yīng)瓶中，并加入3ml無水吡啶，混合后加熱(100～115℃)回流反應(yīng)10h。在反應(yīng)期間，利用tlc法進行監(jiān)測，待龍膽苦苷基本反應(yīng)完后停止反應(yīng)。將反應(yīng)液移至20ml的冰蒸餾水(4℃左右)中，并加入3ml鹽酸(36％～38％)，用適量氯仿萃取3次，除去下層的氯仿層，將剩余的反應(yīng)液通過減壓蒸餾(100～120℃)制得棕色粉末，以獲得龍膽苦苷半抗原(結(jié)構(gòu)如式i所示)，利用tlc、ir、ms、uv等進行鑒定。

從式i可以看出，gtp-sa屬于琥珀酸單酯衍生物；

tlc的具體步驟為：將龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品和gtp-sa配制成1mg/l的甲醇溶液，在同一硅膠g254薄層板上點樣，在以乙酸乙酯、甲醇與水的混合液(v乙酸乙酯:v甲醇:v水＝10:2:1)為展開劑的展開體系中進行展開，取出晾干，置于紫外燈(254nm)下檢視。對gtp和gtp-sa的比移值(rf值)進行測算，公式如下：

結(jié)果表明，成功合成了新物質(zhì)。結(jié)合ir和ms(圖2)以及uv(圖4)等進一步確定合成的新物質(zhì)為目標(biāo)化合物(式i)。

(2)龍膽苦苷人工抗原gtp-bsa和gtp-ova的合成、純化與鑒定

取20mggtp-sa溶于0.5ml二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide,dmf)中，加入75μl三正丁胺，冷卻至0℃，再加入20μl氯甲酸異丁酯，10℃攪拌30min，得到反應(yīng)液a；取70mgbsa和70mgova分別溶于5mlvdmf:v水＝1:4的混合液中，得到反應(yīng)液b1和b2。

將反應(yīng)液a平均分成2份，分別逐滴緩慢加入反應(yīng)液b1和b2中，并不斷攪拌(此操作在0℃進行)，將混合后的反應(yīng)液a-b1和a-b2置于4℃下攪拌過夜，初步獲得龍膽苦苷人工抗原gtp-bsa和gtp-ova。

最后，將混合液a-b1和a-b2分別裝入透析袋(截留分子量8000～14000)中，以pbs(ph7.4)為透析液，在4℃下透析3d，在透析處理期間，每間隔6小時換一次透析液。然后，將透析處理后的混合液a-b1和a-b2進行冷凍干燥(-50℃下冷凍干燥2～4h)，保存于-20℃冰箱內(nèi)，備用，獲得純化后的龍膽苦苷人工抗原gtp-bsa和gtp-ova。

利用tlc、uv、ir、sds-page法對兩種龍膽苦苷人工抗原進行分析鑒定，同時利用tnbs法計算出兩種龍膽苦苷人工抗原的結(jié)合比。

其中tlc法通過在紫外燈(254nm)下觀察gtp、bsa、ova、gtp-bsa和gtp-ova的展開和顯色(圖3)，表明gtp可展開并顯色，bsa和ova無法展開同時也不顯色，gtp-bsa和gtp-ova無法展開但可顯色，說明龍膽苦苷半抗原與兩種載體蛋白(bsa和ova)偶聯(lián)成功。

tnbs法是一種定量測定氨基酸的方法，通過測定載體蛋白和人工抗原中游離氨基的含量，計算出載體蛋白與gtp-sa的結(jié)合比，結(jié)合比的公式如下：

od1——載體蛋白單位質(zhì)量濃度光密度

od2——人工抗原單位質(zhì)量濃度光密度

a——每分子載體蛋白游離氨基酸個數(shù)

結(jié)果顯示，龍膽苦苷半抗原與兩種載體蛋白偶聯(lián)成功；計算得出，gtp-bsa的結(jié)合比為9:1，gtp-ova的結(jié)合比為6:1。

通過不同分析方法，用不同的指標(biāo)，進一步驗證龍膽苦苷半抗原與兩種載體蛋白偶聯(lián)成功(圖4、圖5、圖6)。

(3)實驗動物免疫

以上述gtp-bsa、gtp-ova分別作為免疫抗原，以基礎(chǔ)飼料、谷胱甘肽抗應(yīng)激飼料(配方見表1)將12只純種雄性新西蘭大白兔預(yù)飼養(yǎng)3d，觀察大白兔的外觀狀態(tài)和精神狀態(tài)。待觀察無異樣后，將12只大白兔編號，并對每只大白兔進行耳靜脈采血1～2ml，37℃靜置1～2h后，于4℃靜置過夜，將其于2500r/min離心5min，吸取血清，作為陰性對照血清，保存于-20℃冰箱內(nèi)，備用。

表1.飼料配方

根據(jù)飼料和免疫抗原種類的不同，將上述經(jīng)預(yù)飼養(yǎng)后的12只大白兔分為4組(每組3只)，結(jié)果如表2：

表2.大白兔分組

用生理鹽水將免疫抗原稀釋至2mg/ml，取2ml免疫抗原與10％的antigenwrap佐劑混合，搖勻，其中antigenwrap佐劑為新型水溶性佐劑，說明書要求與抗原按體積比1:10混合，震蕩2～3min即可混勻。再通過腿部肌肉多點注射免疫對應(yīng)組大白兔，具體免疫方案參見表3。

表3.免疫方案

首次免疫之后的每次免疫，3～4天后，通過耳靜脈采血1～2ml，利用間接elisa方法監(jiān)測其血清效價。待血清效價變化進入平臺期時，進行最后一次沖擊免疫，4～6天后，通過心臟采血法采集血液，防止長時間后抗體效價出現(xiàn)回落趨勢。將采集得到的血液于37℃靜置1～2h，待血液凝固后，于4℃靜置過夜，2500r/min離心15min，收集上層血清，再加入具有防腐作用的0.02％nan3。最后，用西林瓶進行分裝，標(biāo)記，并保存于-20℃冰箱內(nèi)，備用。

由于免疫血清中含有的雜質(zhì)蛋白相對較多，所以需要進行分離純化處理。目前，常用的蛋白分離純化方法是鹽析法，此法操作簡單、技術(shù)成熟、且使用的分離試劑對抗體的影響較小。本研究采用辛酸-硫酸銨鹽析法進行抗體純化。

經(jīng)過數(shù)次免疫后，再分別以gtp-ova、gtp-bsa作為包被抗原，建立間接elisa檢測法對抗體效價進行測定，對兩種免疫抗原的免疫效果進行比較，以獲得高效價的龍膽苦苷多克隆抗體。

(4)間接elisa方法測定抗龍膽苦苷多克隆抗體的效價

間接elisa法的優(yōu)化條件：包被抗原的包被濃度為1:2000(采用棋盤滴定法，選擇od450nm值大約為1.0時所對應(yīng)的抗原稀釋倍數(shù)作為包被抗原的最適工作濃度)，包被液為碳酸鹽緩沖液(cbs，ph9.6)，封閉液為山羊血清(10ml山羊血清溶于100ml的pbs中)，抗血清的稀釋液為pbs+0.5％bsa，酶標(biāo)二抗的濃度為1:3000。

多抗效價測定的具體步驟為：以加強免疫后采集的兔血清作為陽性血清，以未經(jīng)免疫時采集的兔血清為陰性對照，以pbs為空白對照。

a.抗原包被：用最適包被液cbs將包被抗原(當(dāng)免疫抗原為gtp-bsa時，以gtp-ova作為包被抗原；當(dāng)免疫抗原為gtp-ova時，以gtp-bsa作為包被抗原)稀釋至其最適包被濃度(1:2000)，以100μl/孔加至酶標(biāo)板中，于4℃下孵育過夜，傾去板內(nèi)包被液，每孔加入200μl洗滌液pbst(含0.05％吐溫-20的pbs緩沖液)，洗板3～4次，每次輕晃2～3min，吸水紙上拍干。

b.封閉：每孔加入150μl最適封閉液，于37℃下孵育1.5h，傾去板內(nèi)封閉液，每孔加入200μl洗滌液pbst，洗板3～4次，每次輕晃2～3min，吸水紙上拍干。

c.加樣：將收集的血清經(jīng)梯度稀釋成系列濃度，并以未免疫時新西蘭大白兔血清作為陰性對照，以pbs作為空白對照。分別以每孔100μl加入酶標(biāo)板中，于37℃下孵育1h，傾去板內(nèi)血清和pbs，每孔加入200μl洗滌液pbst，洗板3～4次，每次輕晃2～3min，吸水紙上拍干。

d.加二抗：將羊抗兔酶標(biāo)二抗稀釋(稀釋液為pbs)至其最適工作濃度(1:3000)，以每孔100μl加入酶標(biāo)板中，于37℃下孵育1h，傾去板內(nèi)酶標(biāo)二抗，每孔加入200μl洗滌液pbst，洗板3～4次，每次輕晃2～3min，吸水紙上拍干。

e.加顯色液：每孔加入100μl的四甲基聯(lián)苯胺(tmb)底物液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，避光條件下，37℃顯色20min。

f.加終止液：每孔快速加入50μl的反應(yīng)終止液。

g.酶標(biāo)儀測定：在450nm處讀出吸光度。

通過觀察谷胱甘肽對實驗動物的外觀指標(biāo)及精神狀態(tài)的變化，測定實驗動物的進食量和體重的變化，結(jié)果表明，谷胱甘肽對新西蘭大白兔的免疫應(yīng)激反應(yīng)具有明顯的緩解作用。通過對龍膽苦苷免疫血清效價的動態(tài)監(jiān)測，以免疫次數(shù)為橫坐標(biāo)，od450nm值為縱坐標(biāo)，得到了抗體產(chǎn)生的動態(tài)曲線(圖7)。

結(jié)果顯示，4個實驗組的新西蘭大白兔均能產(chǎn)生免疫應(yīng)答，且應(yīng)答趨勢基本一致。這表明已成功合成了龍膽苦苷人工抗原(指gtp-bsa和gtp-ova)，且能有效刺激機體產(chǎn)生針對龍膽苦苷人工抗原的抗體。

依據(jù)抗血清效價的判斷標(biāo)準(zhǔn)(當(dāng)陽性血清od450nm值與陰性血清od450nm值之比大于2.1，即p/n＞2.1時，將此時最大稀釋倍數(shù)定義為血清效價)，本研究中4個實驗組抗血清的效價判定結(jié)果(圖8)顯示，4個實驗組的效價均達(dá)到1:12800以上，且免疫抗原gtp-bsa所產(chǎn)生的抗血清效價明顯高于免疫抗原gtp-ova所產(chǎn)生的抗血清效價，這表明gtp-bsa為理想的免疫抗原；在基礎(chǔ)飼料中添加谷胱甘肽的實驗組所產(chǎn)生的抗血清效價高于基礎(chǔ)飼料組所產(chǎn)生的抗血清效價，這表明在基礎(chǔ)飼料中添加谷胱甘肽，不僅可作為抗應(yīng)激反應(yīng)因子對大白兔產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)有所緩解，而且對提升免疫效果也有所幫助。綜上可知，實驗組3的免疫效果最佳。

(二)間接競爭龍膽苦苷-elisa方法的建立及優(yōu)化

針對龍膽苦苷多克隆抗體的靈敏度和特異性，建立的龍膽苦苷檢測方法為間接競爭elisa法，并對其工作條件(競爭反應(yīng)時間、有機溶劑及其濃度、洗滌液ph值)進行優(yōu)化，以期獲得最適的間接競爭elisa檢測體系。通過在加樣過程中混入不同濃度的龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品，以期檢測出4個實驗組的靈敏度(ic50)、競爭抑制曲線、競爭抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程。選擇獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、梔子苷、馬錢苷和橄欖苦苷作為龍膽苦苷的結(jié)構(gòu)相似物，測定龍膽苦苷多克隆抗體與其結(jié)構(gòu)相似物的交叉反應(yīng)率，以檢驗間接競爭elisa反應(yīng)體系的特異性是否良好。

(1)間接競爭龍膽苦苷-elisa方法的建立

由于間接競爭elisa方法與間接elisa方法的操作過程相似，本實驗以間接elisa方法中優(yōu)化后的工作條件為基礎(chǔ)，在包被抗原、抗體的最適工作濃度下，在加樣步驟中，將系列濃度的龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)溶液加入抗血清中。

具體操作步驟：

a.包被：分別將包被抗原用cbs稀釋至最適包被濃度(1:2000)，以100μl/孔加至酶標(biāo)板中，4℃下孵育過夜，傾去板內(nèi)包被液，以200μl/孔的洗滌液pbst洗板3～4次，每次輕晃2～3min，吸水紙上拍干。

b.封閉：用山羊血清作為封閉液，以150μl/孔加至酶標(biāo)板中，37℃下孵育1.5h后，傾去板內(nèi)封閉液，以200μl/孔的洗滌液pbst洗板3～4次，每次輕晃2～3min，吸水紙拍干。

c.加樣：每孔加入抗血清和系列濃度的龍膽苦苷甲醇溶液各50μl，37℃下孵育1h后(競爭反應(yīng))，傾去板內(nèi)血清和龍膽苦苷甲醇溶液的混合液，以200μl/孔的洗滌液pbst洗板3～4次，每次輕晃2～3min，吸水紙上拍干。

d.加二抗：將羊抗兔酶標(biāo)二抗稀釋至其最適工作濃度(1:3000)，以100μl/孔加入酶標(biāo)板中，37℃下孵育1h后，以200μl/孔的洗滌液pbst洗板3～4次，每次輕晃2～3min，吸水紙上拍干。

e.加顯色液：100μl/孔(現(xiàn)配現(xiàn)用)，37℃避光條件下，顯色20min。

f.加終止液：快速加入反應(yīng)終止液，50μl/孔。

g.用酶標(biāo)儀于450nm處讀出吸光度。

(2)間接競爭elisa方法的條件優(yōu)化

利用前期制備且純化的龍膽苦苷多克隆抗體，初步建立間接競爭elisa分析方法，并對主要影響條件(競爭反應(yīng)時間、有機溶劑及其濃度、洗滌液的ph值)進行優(yōu)化，以期建立出更加適合的龍膽苦苷間接競爭elisa方法。

間接競爭elisa方法的優(yōu)化條件為：最佳競爭反應(yīng)時間為40min，最佳的有機溶劑為10％的甲醇溶液，洗滌液pbst的最佳ph值為7.5。

(3)間接競爭elisa的靈敏度和交叉反應(yīng)性

a.靈敏度

基于間接競爭elisa法優(yōu)化的條件，檢測龍膽苦苷對抗體和包被抗原結(jié)合反應(yīng)的競爭抑制作用。在加樣過程中，選用最佳有機溶劑配制濃度為0、0.1、1、10、100、1000、10000ng/ml的龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過間接競爭elisa法，測定其抗體-包被抗原的結(jié)合率和龍膽苦苷對抗體-包被抗原結(jié)合反應(yīng)的競爭抑制率，公式如下：

b：加樣孔的od450nm值，即含競爭抗原(即龍膽苦苷)孔的od450nm值。

b0：陽性對照孔的od450nm值，即龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時的od450nm值。

當(dāng)競爭抑制率為50％時所對應(yīng)的競爭抗原龍膽苦苷的濃度為其靈敏度(即ic50)。

以龍膽苦苷濃度為橫坐標(biāo)，以競爭抑制率為縱坐標(biāo)，繪制間接競爭elisa的競爭抑制曲線，分別獲得4個實驗組的靈敏度(ic50)；以龍膽苦苷濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以競爭抑制率為縱坐標(biāo)，得到間接競爭elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線，并分別得到4個實驗組的線性回歸方程(表4)。

表4.間接競爭elisa抑制曲線的相關(guān)參數(shù)

b.交叉反應(yīng)性

本研究分別選用龍膽苦苷的5種結(jié)構(gòu)相似物(獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、梔子苷、馬錢苷和橄欖苦苷)作為競爭物，進行間接競爭elisa檢測。利用間接競爭elisa檢測方法分別對龍膽苦苷及其5種結(jié)構(gòu)相似物的靈敏度(即ic50)進行檢測，計算測出其交叉反應(yīng)率，并判定間接競爭elisa特異性是否良好。

交叉反應(yīng)率是指龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度與其結(jié)構(gòu)相似物靈敏度的比值，公式如下：

結(jié)果顯示(表5)，4個實驗組與龍膽苦苷的交叉反應(yīng)率均為100％，與獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的交叉反應(yīng)率均＜0.5％，與梔子苷、馬錢苷及橄欖苦苷的交叉反應(yīng)率均＜0.1％，這表明4個實驗組的特異性均良好，尤其是對梔子苷、馬錢苷和橄欖苦苷基本沒有交叉反應(yīng)。

表5.龍膽苦苷抗血清與其結(jié)構(gòu)相似物的交叉反應(yīng)率

本發(fā)明首次成功制備出龍膽苦苷半抗原、人工抗原以及多克隆抗體，并建立了具有良好的靈敏度和特異性的間接競爭elisa檢測方法，為中藥秦艽有效成分龍膽苦苷的檢測開辟了一條新路徑，提供了一種新思路和一項新技術(shù)。為快速尋找新藥源和快速鑒別藥材真?zhèn)翁峁┝丝赡?，為中藥有效成分的檢測分析和質(zhì)量控制評估打下基礎(chǔ)，有利于天然藥物的開發(fā)利用，甚至可以成為儀器分析技術(shù)的補充方法，加速了中醫(yī)藥現(xiàn)代化進程。