本發(fā)明屬于分子生物學和醫(yī)學檢測領域，涉及一種用于熒光定量pcr檢測的快速提取核酸方法，具體是指采用簡便可靠的方法抽提臨床樣本dna，再采用熒光定量pcr方法對抽提的核酸進行檢測。

背景技術：

核酸是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質基礎。無論是進行核酸結構還是功能研究，首先需要從復雜多樣的生物樣本中迅速有效地分離和提取所需要的基因組核酸，而且抽提后的核酸質量及其完整性都會直接影響到隨后的實驗結果。目前，提取核酸常用的傳統(tǒng)的基于溶液的抽提方法包括：堿抽提法、異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法和溴化十六烷基三甲胺(ctab)抽提法。

堿抽提方法是用堿和十二烷基磺酸鹽使細胞裂解，堿可以在保持共價閉合環(huán)狀dna雙鏈狀態(tài)的同時，使高分子量染色體dna變性，十二烷基磺酸鹽與細胞蛋白、破碎的細胞壁和變性的染色體dna形成復合物，離心后這些復合物沉淀，而質粒dna存在于上清中。這種方法只適用于提取質粒dna，具有局限性。

異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法是用異硫氰酸胍裂解細胞后，用酚使蛋白變性，同時抑制了dnase的降解作用，而蛋白分子溶于酚相，dna溶于水相。氯仿能夠去除核酸溶液中殘留的酚，加速有機相和液相分離。但這種方法中酚和氯仿對人體傷害較大。

ctab抽提法是用ctab溶解細胞膜,并結合核酸，使核酸便于分離，再用酚-氯仿去除蛋白質和糖類。這種方法雖然提取的dna純度較高，但操作繁瑣，耗時較長。

chelex-100對高價金屬離子有很高的親和力和螯合作用，能夠抑制核酸酶對dna的消化作用，防止了dna在煮沸過程中的降解,同時在高溫、低離子強度條件下還有催化dna釋放的作用，這樣的處理過程既達到了分離提取dna的目的，同時除去了一些對擴增反應有抑制作用的因子(如重金屬離子)，提高了pcr擴增的效率。該方法簡便快速，提取過程始終在同一試管中進行，可減少dna的損失。同時，由于操作步驟簡單，減少了樣本之間交叉污染的機會。目前，該方法已廣泛應用于微量血液、精斑、組織塊、牙齒、毛發(fā)和骨骼等材料dna的提取。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提出一種快速提取核酸的方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，所采用的技術方案為本發(fā)明涉及一種快速提取核酸的方法，所述的方法包括以下步驟：

1.取少量生物樣本，所述生物樣本選自血斑精斑或精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、尿液樣本、積液樣本、組織細胞樣本；

2.將樣本10000-13000rpm離心3-10min，棄上清；

3.加入1ml生理鹽水重懸沉淀，10000-13000rpm離心3-10min，棄上清；

4.在沉淀中加入50μl含5％chelex-100，0.5％-1％np40，0.5％-1％tritonx-100，1mmedta，ph＝9-12的核酸提取液，重懸沉淀；

5.80-90℃下加熱5-15min；

6.10000-13000rpm離心3-10min，收集上清為用于pcr反應；

其中，本發(fā)明的第一優(yōu)先技術方案為，所述的核酸提取液中np40為0.5％-1％，優(yōu)選0.5％-0.7％；

本發(fā)明的第二優(yōu)先技術方案為，所述的核酸提取液中tritonx-100為0.5％-1％，優(yōu)選0.5％-0.7％。

本發(fā)明的第三優(yōu)先技術方案為，所述的核酸提取液的ph為9-12，優(yōu)選11-12。

本發(fā)明的第四優(yōu)先技術方案為，所述的加熱溫度為80-90℃，優(yōu)先80-85℃。

本發(fā)明的第五優(yōu)先技術方案為，所述的加熱時間為5-15min，優(yōu)選8-10min。

本發(fā)明的的第六優(yōu)選技術方案為，所述的離心轉速為10000-13000rpm，優(yōu)選11000-12000rpm。

本發(fā)明的第七優(yōu)先技術方案為，所述的離心時間為3-10min，優(yōu)先4-6min。

其中，本發(fā)明的生物樣本選自血斑精斑或精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、尿液樣本、積液樣本、組織細胞樣本；

本發(fā)明的技術優(yōu)勢為：

1.本發(fā)明操作簡單，時間短。傳統(tǒng)方法中需用溶菌酶裂解細胞，蛋白酶k來去除樣本中的蛋白質，這個過程需耗時1-2小時，再進行柱純化dna，離心步驟多。本發(fā)明的方法操作簡單，采用高溫加熱來裂解樣本，使樣本中的蛋白質變性，dna釋放出來，直接離心即可得到dna。裂解時間僅為10min，大大縮短了所需時間。

2.本發(fā)明80-90℃加熱溫度避免了離心管在加熱中崩蓋的現(xiàn)象。傳統(tǒng)熱裂解的溫度多為100℃，離心管很容易發(fā)生崩蓋現(xiàn)象，導致樣本之間的dna交叉污染。本發(fā)明中的加熱溫度為80-90℃，避免了離心管崩蓋導致的樣本dna之間的交叉污染，提高了檢測結果的準確性。

3.本發(fā)明使用chelex-100防止了dna在加熱過程中的降解，減少了dna的損失。

4.本發(fā)明np40和tritonx-100促進了樣本的裂解，np40和tritonx-100都是pcr的增效劑，提高了pcr的擴增效率。

附圖說明

圖1為具體實施方式中兩種不同提取方法所提取dna的熒光定量pcr檢測結果。

附圖標記：

1：1號樣本用天根口腔拭子基因組dna提取試劑盒提取的dna檢測結果；

2：1號樣本用本發(fā)明方法提取的dna檢測結果；

3：2號樣本用天根口腔拭子基因組dna提取試劑盒提取的dna檢測結果；

4：2號樣本用本發(fā)明方法提取的dna檢測結果；

5：3號樣本用天根口腔拭子基因組dna提取試劑盒提取的dna檢測結果；

6：3號樣本用本發(fā)明方法提取的dna檢測結果。

具體實施方式

1.用兩種方法提取尿道分泌物中的dna，分別用這兩種抽提方法同時提取3個樣本，平行比較。

1.1用天根口腔拭子基因組dna提取試劑盒(dp322)抽提尿道分泌物中的dna。

1.1.1取200μl含尿道管分泌物的細胞保存液，加入400μl緩沖液ga。

1.1.2加入20μlproteinasek溶液，旋渦10sec混勻，56℃放置60min，其間每15min渦旋混勻數(shù)次。

1.1.3加入400μl緩沖液gb，充分顛倒混勻，70℃放置10min。此時溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的液滴。

1.1.4加200μl無水乙醇，充分顛倒混勻，簡短離心以去除管蓋內壁的液滴。

1.1.5將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱cr2中(吸附柱cr2放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr2放回收集管中。

1.1.6向吸附柱cr2中加入已加入無水乙醇的500μl緩沖液gd，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr2放回收集管中。

1.1.7向吸附柱cr2中加入600μl已加入無水乙醇的漂洗液pw，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr2放回收集管。

1.1.8重復操作步驟7。

1.1.912,000rpm(～13,400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱cr2室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

1.1.10將吸附柱cr2轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50μl洗脫緩沖液tb，室溫放置5min，12,000rpm(～13,400×g)離心2min。

1.2用本發(fā)明的方法抽提尿道分泌物中的dna。

1.2.1取200μl含尿道管分泌物的細胞保存液，12000rpm離心5min，棄上清。

1.2.2加入1ml生理鹽水重懸沉淀，12000rpm離心5min，棄上清。

1.2.3在沉淀中加入50μl含5％chelex-100(sigma公司)，0.5％np40，0.5％tritonx-100，1mmedta，ph＝11核酸提取液，重懸沉淀。

1.2.485℃下加熱10min。

1.2.512000rpm離心5min，收集上清，取5μl用于pcr反應。

2.dna鑒定方法

選擇人gapdh基因的taqman探針和引物，用熒光定量pcr方法檢測上述兩種不同提取方法所提取dna。引物和探針由primerexpress3.0軟件設計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物探針信息如下：

用于檢測gapdh基因的上游引物為5-gcctcaagatcatcaggtgag-3’(seqidno:1)；

用于檢測gapdh基因的下游引物為5-agaaaggtgggagcctcagt-3’(seqidno:2)；

用于檢測gapdh基因的探針為5-fam-caccaccaactgcttagcacccctg-bhq1-3’(seqidno:3)。

2.1熒光定量pcr檢測

pcr擴增檢測反應條件：37℃5min；95℃5min；95℃15s，60℃60s,40cycles。

3.結果分析

通過對提取產物dna的熒光pcr檢測可發(fā)現(xiàn)，該方法提取產物的擴增檢測ct值均小于天根口腔拭子基因組dna提取試劑盒(dp322)提取產物dna的擴增檢測ct值，而熒光信號值高于天根口腔拭子基因組dna提取試劑盒(dp322)提取產物dna的檢測熒光信號值。

在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應被認為是說明性的而非限制性的。

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