一種時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測方法及其所用的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體而言，涉及一種時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測方法，所述方法兼具了POCT快速定量檢測系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光常規(guī)檢測項(xiàng)目的檢測功能，在操作上快速靈活，準(zhǔn)確性、線性范圍、靈敏度、精密性等性能指標(biāo)均好于層析法膠體金和熒光定量系統(tǒng)。所述的試劑盒包括：熒光微球與反應(yīng)杯；所述熒光微球?yàn)榫郾揭蚁晒馕⑶?；所述聚苯乙烯熒光微球?nèi)部包裹有稀土熒光離子銪，表面包被有與待測物對(duì)應(yīng)的抗體；所述反應(yīng)杯固定包被有與待測物對(duì)應(yīng)的抗體、抗原或待測物本身；所述聚苯乙烯熒光微球表面包被的抗體與反應(yīng)杯固定包被的抗體為待測物的配對(duì)抗體。該試劑盒方便保存和運(yùn)輸，具備化學(xué)發(fā)光大系統(tǒng)的檢驗(yàn)功能。
【專利說明】
一種時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測方法及其所用的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體而言，涉及一種時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測 方法及其所用的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著國民經(jīng)濟(jì)和國家醫(yī)療健康事業(yè)的不斷發(fā)展，心臟標(biāo)志物、感染性疾病、內(nèi)分泌 激素、糖尿病、傳染病、腫瘤標(biāo)記物的臨床檢測量不斷增長，臨床檢測技術(shù)也日益發(fā)展。
[0003] 目前用于檢測心血管疾病標(biāo)志物、炎癥感染標(biāo)志物等臨床需要快速檢測出具結(jié)果 的項(xiàng)目，一般采用層析法的膠體金免疫定量和層析法的熒光免疫定量P0CT快速檢測系統(tǒng)。 POCT(point-〇f-care testing)也常被稱為床旁檢測、醫(yī)生診所檢測、實(shí)驗(yàn)室外檢測、分散 測試、現(xiàn)場替代檢測、"衛(wèi)星化"檢測、患者自我檢測等。其檢測具有時(shí)間短，患者親歷等優(yōu) 點(diǎn)，因而能快速而恰當(dāng)?shù)剡M(jìn)行診療、護(hù)理、病程觀察，進(jìn)而提高醫(yī)療質(zhì)量和患者滿意度，目前 P0CT已經(jīng)廣泛應(yīng)用在ICU、手術(shù)、急診、診所及患者家中，主要應(yīng)用于心臟標(biāo)志物、感染性疾 病、糖尿病等項(xiàng)目的檢測，而大型的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)也不斷在三甲醫(yī)院得到普及使用。
[0004] 層析法的膠體金免疫定量和層析法的熒光免疫定量P0CT快速檢測系統(tǒng)雖然在適 應(yīng)臨床P0CT檢測日益擴(kuò)大的需求方面發(fā)揮了突出的作用，但同時(shí)也存在著準(zhǔn)確性欠佳，重 復(fù)性波動(dòng)大的缺陷。在腫瘤標(biāo)記物、激素、傳染病的臨床定量檢測，目前為主依賴進(jìn)口的化 學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)龐大而復(fù)雜，并且價(jià)格昂貴，一般的中小醫(yī)院難以開展更難普及。 例如目前常用的日本三菱公司的Pathfast?化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)則是小型的化學(xué)發(fā)光 系統(tǒng)，和法國梅里埃的mini vidas酶聯(lián)免疫熒光定量檢測系統(tǒng)，均存在系統(tǒng)復(fù)雜，維護(hù)麻 煩，采用液體系統(tǒng)、需要冷藏等缺點(diǎn)。
[0005] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測方法，該方法操作簡 單、快速，易于掌握。
[0007] 本發(fā)明的第二目的在于提供所述時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測方法所用的試劑盒， 所述的試劑盒檢測準(zhǔn)確性好，重復(fù)性性好，反應(yīng)體系簡單，維護(hù)方便。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
[0009] -種時(shí)間分辨免疫焚光定量檢測方法，包括：
[0010] 1)、吸取待測樣本，加入熒光微球并溶解混勻；
[0011]所述焚光微球?yàn)?聚苯乙稀焚光微球的內(nèi)部包裹有稀土焚光離子銪，表面包被有 與待測物對(duì)應(yīng)的抗體；
[0012] 2)、吸取步驟1)中得到的混合液體，加入到固定包被有與待測物對(duì)應(yīng)的抗體或抗 原的反應(yīng)杯中進(jìn)行反應(yīng)；
[0013] 3)、反應(yīng)結(jié)束后移除反應(yīng)杯中內(nèi)的液體并用洗滌緩沖液對(duì)反應(yīng)杯的內(nèi)含物進(jìn)行洗 滌；
[0014] 4)、洗滌完成后，移除洗滌緩沖液并檢測反應(yīng)杯內(nèi)的熒光值，計(jì)算得到待測樣本中 的待測物濃度。
[0015] 本申請(qǐng)的反應(yīng)原理可簡述為：
[0016] 先將待測樣本溶液稀釋至合適濃度后與聚苯乙烯熒光微球反應(yīng)(實(shí)際是與包被在 微球表面的抗體進(jìn)行結(jié)合），形成微粒-抗體-待測物的復(fù)合物；
[0017] 將所述微粒-抗體-待測物的復(fù)合物加入到反應(yīng)杯內(nèi)時(shí)，反應(yīng)杯的內(nèi)含物（即包被 有與待測物對(duì)應(yīng)的抗體、抗原或待測物本身)會(huì)將相應(yīng)的復(fù)合物抓取并固定在反應(yīng)杯內(nèi)。經(jīng) 洗滌后洗去所有未結(jié)合的物質(zhì)。
[0018] 反應(yīng)結(jié)束后，用紫外光源(340nm)對(duì)反應(yīng)杯掃描檢測，反應(yīng)杯內(nèi)熒光納米微球發(fā)出 高強(qiáng)度的熒光(615nm)，且衰變時(shí)間也較長。利用延緩測量時(shí)間，待樣品基質(zhì)中自然發(fā)生的 短壽命熒光（1~l〇ns)全部衰變后，再測量稀土元素的特異性熒光，這樣就可以完全排除特 異本底焚光的干擾。
[0019] 再將得到的熒光值代入事先計(jì)算好的由待測物標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度的濃度值與其 對(duì)應(yīng)的熒光值建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式，即可分析出樣品中待測物的濃度。
[0020] 其中，當(dāng)待測物為抗原物質(zhì)時(shí)，與聚苯乙烯熒光微球反應(yīng)形成微粒-抗體-抗原的 復(fù)合物;反應(yīng)杯內(nèi)可包被待測物本身或與包被在聚苯乙稀熒光微球上的抗體結(jié)合位點(diǎn)不同 的第二抗體(即其配對(duì)抗體）。
[0021] a)、當(dāng)反應(yīng)杯內(nèi)包被待測物本身時(shí)，反應(yīng)杯拉取到的為未與樣本溶液中的待測物 結(jié)合的微球上的抗體(相當(dāng)于反應(yīng)杯內(nèi)的待測物與樣本溶液中的待測物程競爭關(guān)系），即測 試得到的熒光信號(hào)與樣本溶液中的待測物濃度成反比。
[0022] b)、當(dāng)反應(yīng)杯內(nèi)包被第二抗體時(shí)，反應(yīng)杯拉取到的為微粒-抗體-抗原復(fù)合物，即測 試得到的熒光信號(hào)與樣本溶液稀釋中的待測物濃度成正比。
[0023] 當(dāng)待測物本身即為抗體物質(zhì)時(shí)（為描述方便，聚苯乙烯熒光微球上包被的抗體稱 為抗體微*，反應(yīng)杯內(nèi)包被的抗體稱為抗體》)與聚苯乙烯熒光微球反應(yīng)形成微粒-抗體Π 抗體的復(fù)合物;反應(yīng)杯內(nèi)可包被待測物本身或與包被在聚苯乙烯熒光微球上的抗體結(jié)合位 點(diǎn)不同的第二抗體(即其配對(duì)抗體），或待測物對(duì)應(yīng)的抗原。
[0024] 當(dāng)反應(yīng)杯內(nèi)包被待測物本身時(shí)，情況同a)，即測試得到的熒光信號(hào)與樣本溶液稀 釋中的待測物濃度成反比；
[0025] 當(dāng)反應(yīng)杯內(nèi)包被第二抗體時(shí)，情況同b)，即測試得到的熒光信號(hào)與樣本溶液稀釋 中的待測物濃度成正比；
[0026] 當(dāng)反應(yīng)杯內(nèi)包被待測物對(duì)應(yīng)的抗原時(shí)，情況同b)，即測試得到的熒光信號(hào)與樣本 溶液稀釋中的待測物濃度成正比，但注意此時(shí)抗體微政吉合待測物的Fc段，以防止干擾待測 物與其抗原結(jié)合。
[0027] 優(yōu)選的，如上所述的時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測試劑盒的使用方法，在步驟1)中， 加入所述熒光微球之前，還包括將待測樣本加入稀釋液并混勻。
[0028] 優(yōu)選的，如上所述的時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測試劑盒的使用方法，在步驟1)中， 所述混勻具體為用移液槍的吸頭吹打混勻。
[0029] 優(yōu)選的，如上所述的時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測試劑盒的使用方法，在步驟3)中， 所述反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間為10~20min。
[0030] 實(shí)施如上所述的時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測方法的試劑盒，所述試劑盒包括：
[0031] 熒光微球與反應(yīng)杯；
[0032]所述熒光微球?yàn)?聚苯乙烯熒光微球內(nèi)部包裹稀土熒光離子銪，表面包被與待測 物對(duì)應(yīng)的抗體；
[0033] 所述反應(yīng)杯固定包被有與待測物對(duì)應(yīng)的抗體、抗原或待測物本身；
[0034] 所述聚苯乙烯熒光微球表面包被的抗體與反應(yīng)杯固定包被的抗體為待測物的配 對(duì)抗體。
[0035]本發(fā)明兼具了POCT(point-〇f-care testing)快速定量檢測系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光常規(guī) 檢測項(xiàng)目的檢測功能，在操作上快速靈活，在性能上比目前的膠體金或熒光的層析定量法 明顯高一檔次，準(zhǔn)確性、線性范圍、靈敏度、精密性等性能指標(biāo)均好于層析法膠體金和熒光 定量系統(tǒng)，達(dá)到了化學(xué)發(fā)光定量檢測的大系統(tǒng)的性能水平。
[0036] 與經(jīng)典的時(shí)間分辨焚光免疫分析方法DELFIA法不同，時(shí)間分辨焚光免疫層析技術(shù) 采用熒光納米微球作為標(biāo)記物，每個(gè)微球中可包裹成千上萬個(gè)熒光分子，大大提高了標(biāo)記 效率，有效的提高了靈敏度;同時(shí)納米熒光微球表面修飾有合適密度的羧基，用于與蛋白或 抗體的共價(jià)偶聯(lián)，提高標(biāo)記物的穩(wěn)定性。
[0037] 優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述聚苯乙烯熒光微球?yàn)楣虘B(tài)，所述反應(yīng)杯的內(nèi)含物 為固態(tài)。
[0038] 本申請(qǐng)的主要反應(yīng)試劑及最終的檢測體系均為固相。其中，熒光標(biāo)記物和反應(yīng)杯 中都包被有大量的抗體或抗原物質(zhì)，若以液體環(huán)境進(jìn)行運(yùn)輸或保存，必須采用干冰降溫或 冰箱保存，會(huì)導(dǎo)致整體成本攀升。而本申請(qǐng)所用試劑經(jīng)過凍干處理，常溫保存即可，維護(hù)更 加簡單可靠，對(duì)應(yīng)用條件要求相對(duì)較低，適用于床旁即時(shí)診斷的需求。
[0039] 優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述試劑盒還包含有洗滌緩沖液、稀釋液和代碼條中 的一種或多種。
[0040] 進(jìn)一步優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述洗滌緩沖液為5~15mM PBST。
[0041 ] PBST即常規(guī)的磷酸鹽吐溫緩沖液，由PBS(Phosphate Buffered Saline)和Tween-20配制而成4!17.0~7.4。
[0042] 試劑盒內(nèi)可包含PBST，也可不包含，由實(shí)驗(yàn)室人員自行配制。
[0043] 進(jìn)一步優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述稀釋液的配方為：
[0044] 0.8 ~1.2%BSA、0.08 ~0.12%Triton-X405、0.8 ~1.2% 蔗糖，溶劑為 45 ~55mM PBS〇
[0045] BSA(Bovine Serum Albumin)即牛血清白蛋白，PBS (Phosphate Buffered Saline)即磷酸緩沖鹽溶液。
[0046] 其中，本發(fā)明所采用的稀釋液和洗滌緩沖液均為工作液，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可根 據(jù)需要替換為母液，使用時(shí)稀釋即可。
[0047] 進(jìn)一步優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述代碼條中記錄有由待測物標(biāo)準(zhǔn)品的不同 濃度的濃度值與其對(duì)應(yīng)的熒光值建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式信息。
[0048] 所述代碼條上印有條形碼或二維碼，在使用試劑前需讓檢測儀器讀取代碼條內(nèi)的 信息，然后才能正常檢測，檢測儀器可自動(dòng)將讀取得到的熒光值代入代碼條中記載的方程 式得到測試結(jié)果。當(dāng)然，為方便人工讀取，代碼條上也可直接印上標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，供人工計(jì) 算得到結(jié)果。
[0049] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0050] 1)、本發(fā)明兼具了P0CT快速定量檢測系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光常規(guī)檢測項(xiàng)目的檢測功能， 在操作上快速靈活，在性能上比目前的膠體金或熒光的層析定量法明顯高一檔次，準(zhǔn)確性、 線性范圍、靈敏度、精密性等性能指標(biāo)均好于層析法膠體金和熒光定量系統(tǒng)。
[0051] 2)、本申請(qǐng)的主要反應(yīng)試劑及最終的檢測體系均為固相。其中，熒光標(biāo)記物和反應(yīng) 杯中都包被有大量的抗體或抗原物質(zhì)，若以液體環(huán)境進(jìn)行運(yùn)輸或保存，必須采用干冰降溫 或冰箱保存，會(huì)導(dǎo)致整體成本攀升。而本申請(qǐng)所用試劑常溫保存即可，維護(hù)更加簡單可靠， 對(duì)應(yīng)用條件要求相對(duì)較低，適用于床旁即時(shí)診斷的需求。
[0052] 3)、可通過系統(tǒng)的模塊擴(kuò)充，具備化學(xué)發(fā)光大系統(tǒng)的檢驗(yàn)功能，適用腫瘤標(biāo)記物、 傳染病、內(nèi)分泌激素等項(xiàng)目的檢測需求。
[0053] 4)、與傳統(tǒng)的P0CT技術(shù)相比，僅需要檢測一次反應(yīng)杯內(nèi)的熒光值即可(P0CT需要同 時(shí)檢測檢測線與對(duì)照線處的熒光值），減小了系統(tǒng)誤差，檢測結(jié)果更精確可靠。
【附圖說明】
[0054] 為了更清楚地說明本發(fā)明【具體實(shí)施方式】或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體 實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的 附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前 提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0055] 圖1為本申請(qǐng)?zhí)峁┑脑噭┖性囉脮r(shí)的操作示意圖。
[0056] 附圖標(biāo)記：
[0057] 101移液槍的tip頭；
[0058] 102待測樣本；
[0059] 103 稀釋液；
[0060] 104洗滌緩沖液；
[0061] 105凍干的熒光微球；
[0062] 106 反應(yīng)杯。
【具體實(shí)施方式】
[0063]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0064] 實(shí)施例1
[0065] 定量檢測人血清樣本中AFP(甲胎蛋白）含量。
[0066] 本實(shí)施例還提供了詳細(xì)的代碼條的制備方法。
[0067] 將 AFP 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋為 Ong/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ ml這幾個(gè)濃度。
[0068]待測樣本濃度未知。
[0069]取出試劑盒中的反應(yīng)板(如圖1所示），其中熒光微球10 5及反應(yīng)杯10 6內(nèi)的孔內(nèi)預(yù) 先裝有固體內(nèi)含物。使用時(shí)將稀釋液和洗滌緩沖液預(yù)先加到孔103和104中。
[0070] 操作步驟：
[0071] 1、用移液槍101吸取50yL樣本102,加入到稀釋液孔103內(nèi)，吹吸3次混勻；
[0072] 2、用移液槍101吸取100yL已稀釋的樣本，加入到標(biāo)記有一株AFP單克隆抗體的熒 光微球的孔105內(nèi)，吹吸3次溶解混勻；
[0073]所述熒光微球?yàn)榫郾揭蚁晒馕⑶騼?nèi)部包裹稀土熒光離子銪，表面包被與待測物 對(duì)應(yīng)的抗體后得到；
[0074]所述稀釋液的配方為：
[0075] 1.0%BSA、0.10%Triton-X405、0.8~1.2%蔗糖，溶劑為45~55mM PBS〇
[0076] 3、用移液槍吸取50yL熒光標(biāo)記物孔105內(nèi)的液體，加入到已包被有另一株AFP單克 隆抗體(與聚苯乙烯熒光微球上標(biāo)記的單克隆抗體互為配對(duì)抗體）的反應(yīng)杯106中，反應(yīng)15 分鐘；
[0077] 4、反應(yīng)時(shí)間到后，用移液槍101吸取去除反應(yīng)杯106內(nèi)液體，再用干凈的tip頭101， 依次吸取于洗滌緩沖液104的孔內(nèi)吸取300yL 10Mm PBST，每次用tip頭101吹打3次后，吸取 到廢液桶廢棄;重復(fù)洗滌3~5次；
[0078] 5、洗滌完畢后，移除PBST溶液，用熒光檢測儀檢測反應(yīng)杯106內(nèi)的熒光值。
[0079 ]注:每次吸取不同溶液之前需要更換t ip頭101。
[0080] 測試結(jié)果如表1所示：
[0081] 表1反應(yīng)杯焚光值結(jié)果
[0084]在實(shí)際應(yīng)用中，標(biāo)準(zhǔn)曲線是事先做好的，并記錄在代碼條中，不需要使用者自行制 作該線性方程。
[0085] 待測樣本反應(yīng)杯內(nèi)的熒光值為5767,將y = 5767代入線性方程，得到待測樣本濃度 為394.8ng/ml。
[0086] 實(shí)施例2
[0087] 定量檢測人血清樣本中sAg含量。
[0088]本實(shí)施例還提供了詳細(xì)的代碼條的制備方法。
[0089]取出試劑盒中的反應(yīng)板(如圖1所示），其中熒光微球10 5及反應(yīng)杯10 6內(nèi)的孔內(nèi)預(yù) 先裝有固體內(nèi)含物。使用時(shí)將稀釋液和洗滌緩沖液預(yù)先加到孔103和104中。
[0090] 操作步驟：
[0091] 1、在使用試劑前需讓檢測儀器讀取代碼條內(nèi)的信息，以獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，及確 認(rèn)待測物對(duì)應(yīng)的試劑盒無誤。
[0092] 2、用移液槍101吸取50yL樣本102，加入到稀釋液孔103內(nèi)，吹吸3次混勻；
[0093] 3、用移液槍101吸取100yL已稀釋的樣本，加入到標(biāo)記有抗sAg的單克隆抗體的熒 光微球的孔105內(nèi)，吹吸3次溶解混勻；
[0094]所述熒光微球?yàn)榫郾揭蚁晒馕⑶騼?nèi)部包裹稀土熒光離子銪，表面包被與待測物 對(duì)應(yīng)的抗體后得到；
[0095]所述稀釋液的配方為：
[0096] 0.8%85厶、0.12%1^行〇11-父405、0.8%蔗糖，溶劑為551111?85。
[0097] 4、用移液槍吸取50yL熒光標(biāo)記物孔105內(nèi)的液體，加入到已包被有sAg的反應(yīng)杯 106中，反應(yīng)20分鐘；
[0098] 5、反應(yīng)時(shí)間到后，用移液槍101吸取去除反應(yīng)杯106內(nèi)液體，再用干凈的tip頭101， 依次吸取于洗滌緩沖液104的孔內(nèi)吸取300yL 15Mm PBST，每次用tip頭101吹打3次后，吸取 到廢液桶廢棄;重復(fù)洗滌3~5次；
[0099] 6、洗滌完畢后，移除PBST溶液，用熒光檢測儀檢測反應(yīng)杯106內(nèi)的熒光值。
[0100] 注:每次吸取不同溶液之前需要更換tip頭101。
[0101] 測得待測樣本反應(yīng)杯內(nèi)的熒光值為3154,將熒光值輸入檢測儀器得到待測樣本濃 度為402. lng/ml。
[0102] 實(shí)施例3
[0103] 定量檢測人血清樣本中乙肝表面抗體含量。
[0104] 本實(shí)施例還提供了詳細(xì)的代碼條的制備方法。
[0105] 將乙肝表面抗體標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋為0mIU/ml、50mIU/ml、100mIU/ml、250mIU/ml、 1000mIU/ml、5000mIU/ml，這幾個(gè)濃度。
[0106] 待測樣本濃度未知。
[0107] 取出試劑盒中的反應(yīng)板(如圖1所示），其中熒光微球105及反應(yīng)杯106內(nèi)的孔內(nèi)預(yù) 先裝有固體內(nèi)含物。使用時(shí)將稀釋液和洗滌緩沖液預(yù)先加到孔103和104中。
[0108] 操作步驟：
[0109] 1、用移液槍101吸取50yL樣本102，加入到稀釋液孔103內(nèi)，吹吸3次混勻；
[01 ?0] 2、用移液槍101吸取100yL已稀釋的樣本，加入到標(biāo)記有一株乙肝表面抗原的焚光 微球的孔105內(nèi)，吹吸3次溶解混勻；
[0111]所述熒光微球?yàn)榫郾揭蚁晒馕⑶騼?nèi)部包裹稀土熒光離子銪，表面包被與待測物 對(duì)應(yīng)的抗原后得到；
[0112] 所述稀釋液的配方為：
[0113] 1.0%BSA、0.10%Triton-X405、0.8~1.2%蔗糖，溶劑為45~55mM PBS〇
[01 Μ] 3、用移液槍吸取50yL焚光標(biāo)記物孔105內(nèi)的液體，加入到已包被有另一株乙肝表 面抗原(與聚苯乙烯熒光微球上標(biāo)記的抗原互為配對(duì)抗原）的反應(yīng)杯106中，反應(yīng)15分鐘；
[0115] 4、反應(yīng)時(shí)間到后，用移液槍101吸取去除反應(yīng)杯106內(nèi)液體，再用干凈的tip頭101， 依次吸取于洗滌緩沖液104的孔內(nèi)吸取300yL 10Mm PBST，每次用tip頭101吹打3次后，吸取 到廢液桶廢棄;重復(fù)洗滌3~5次；
[0116] 5、洗滌完畢后，移除PBST溶液，用熒光檢測儀檢測反應(yīng)杯106內(nèi)的熒光值。
[0117] 注:每次吸取不同溶液之前需要更換tip頭101。
[0118] 測試結(jié)果如表2所示：
[0119] 表2反應(yīng)杯焚光值結(jié)果
[0122] 在實(shí)際應(yīng)用中，標(biāo)準(zhǔn)曲線是事先做好的，并記錄在代碼條中，不需要使用者自行制 作該線性方程。
[0123] 待測樣本反應(yīng)杯內(nèi)的熒光值為8976，將y = 8976代入線性方程，得到待測樣本濃度 為611.0mIU/ml。
[0124] 最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制;盡 管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其 依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征 進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技 術(shù)方案的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，包括： 1 )、吸取待測樣本，加入熒光微球并溶解混勻； 所述熒光微球?yàn)椋壕郾揭蚁晒馕⑶虻膬?nèi)部包裹有稀土熒光離子銪，表面包被有與待 測物對(duì)應(yīng)的抗體； 2) 、吸取步驟1)中得到的混合液體，加入到固定包被有與待測物對(duì)應(yīng)的抗體或抗原的 反應(yīng)杯中進(jìn)行反應(yīng)； 3) 、反應(yīng)結(jié)束后移除反應(yīng)杯中內(nèi)的液體并用洗滌緩沖液對(duì)反應(yīng)杯的內(nèi)含物進(jìn)行洗滌； 4) 、洗滌完成后，移除洗滌緩沖液并檢測反應(yīng)杯內(nèi)的熒光值，計(jì)算得到待測樣本中的待 測物濃度。2. 如權(quán)利要求1所述的時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，在步驟1)中，加 入所述熒光微球之前，還包括將待測樣本加入稀釋液并混勻。3. 如權(quán)利要求1或2所述的時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，在步驟1)中， 所述混勻具體為用移液槍的吸頭吹打混勻。4. 如權(quán)利要求1所述的時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，在步驟3)中，所 述反應(yīng)的時(shí)間為10~20min。5. 實(shí)施權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測方法的試劑盒，其特征 在于，所述試劑盒包括： 焚光微球與反應(yīng)杯； 所述熒光微球?yàn)椋壕郾揭蚁晒馕⑶騼?nèi)部包裹稀土熒光離子銪，表面包被與待測物對(duì) 應(yīng)的抗體； 所述反應(yīng)杯固定包被有與待測物對(duì)應(yīng)的抗體、抗原或待測物本身； 所述聚苯乙烯熒光微球表面包被的抗體與反應(yīng)杯固定包被的抗體為待測物的配對(duì)抗 體。6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述聚苯乙烯熒光微球?yàn)楣虘B(tài)，所述反應(yīng) 杯的內(nèi)含物為固態(tài)。7. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含有洗滌緩沖液、稀釋液 和代碼條中的一種或多種。8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌緩沖液為5~15mM PBST。9. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，所述稀釋液的配方為： 0.8~1.2%85厶、0.08~0.12%1^行〇11-父405、0.8~1.2%蔗糖，溶劑為45~551111?85。10. 如權(quán)利要求7所述的時(shí)間分辨免疫熒光定量檢測試劑盒，其特征在于，所述代碼條 中記錄有由待測物標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度的濃度值與其對(duì)應(yīng)的熒光值建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式 信息。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK106018818SQ201610515446
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月1日
【發(fā)明人】肖江群, 江應(yīng)玲, 鐘乾興, 王保丹, 樂宜萃
【申請(qǐng)人】安邦（廈門）生物科技有限公司