一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法
【專利摘要】一種SYBR?Green?I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法，包括以下步驟：(1)引物合成，(2)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品制備，(3)待測(cè)樣品制備，(4)SYBR?Green?I熒光定量PCR，(5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線，(6)結(jié)果判定。本發(fā)明的有益之處在于：采用SYBR?Green?I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法整個(gè)過(guò)程僅需要3小時(shí)就能得出準(zhǔn)確結(jié)果，而且一次可以進(jìn)行96個(gè)樣品的檢測(cè)，較其他方法具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)、通量高等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)榧膊〉闹委熀鸵咔榈目刂铺峁┍Ｕ稀?br> 【專利說(shuō)明】-種SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種兔須癬毛癬菌感染的檢測(cè)方法，具體涉及一種SYBR Green I熒光 定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 須癬毛癬菌是家兔等多種動(dòng)物皮膚真菌病的最常見(jiàn)病原之一，主要侵害皮膚及其 附屬物，表現(xiàn)皮屑增多、結(jié)痂、脫毛、滲出、毛囊炎及癢感等癥狀，導(dǎo)致兔營(yíng)養(yǎng)不良、生長(zhǎng)遲緩 等，給養(yǎng)兔業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。更嚴(yán)重的是，該病還能傳染給人，引起人畜共患傳染病。所 以需要找到一種快速，準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，以便及時(shí)治療和控制疫情。
[0003]目前，常見(jiàn)的檢測(cè)方法包括：病料直接顯微觀察法、病原分離培養(yǎng)法。病料直接顯 微觀察法雖然簡(jiǎn)單、快速，但卻無(wú)法鑒別真菌的種類，而且有5-15%的假陰性率；病原分離 培養(yǎng)雖然通過(guò)菌落、菌絲、孢子的形態(tài)，結(jié)合生化試驗(yàn)，可以明確真菌種類，但耗時(shí)長(zhǎng)，一般 為3-4周，而且有40 %的假陰性率。
[0004] 隨著技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)方法檢測(cè)真菌感染得到了一定的應(yīng)用，包括染色體 DNA G+C的含量、總DNA同源性、線粒體DNA限制酶斷片長(zhǎng)度多態(tài)分析、隨機(jī)引物PCR、隨機(jī)擴(kuò) 增DNA多態(tài)性分析、PCR指紋等。其中，采用核糖體DNA區(qū)及rRNA小亞基序列分析，特別是 ITS(analysis of internal transcribed spacer)區(qū)分析比對(duì)編碼rRNA小亞基（18SrRNA) 基因更適應(yīng)對(duì)皮膚真菌的檢測(cè)，目前，把核糖體DNA區(qū)的ITS區(qū)序列分析稱為皮膚癬菌鑒定 的金標(biāo)準(zhǔn)。此方法主要是利用常規(guī)PCR的方法對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后利用電泳觀察，基 因序列測(cè)定，序列分析等方法，最終通過(guò)同源性差異，對(duì)皮膚真菌病原做出診斷。但是此方 法存在一定的缺陷，主要表現(xiàn)在常規(guī)PCR的靈敏度不是特別高、需要PCR后處理、電泳鑒定 需要使用有毒性EB染料等方面。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果直觀、敏感 度高、定量準(zhǔn)確的SYBR Green I熒光定量PCR方法用于兔須癬毛癬菌的檢測(cè)。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0007] -種SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法，其特征在于，包括以 下步驟：
[0008] (1)引物合成：
[0009] 上游引物 F : 5' -GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG-3'，
[0010] 下游引物 R : 5' -GGAGACCATCTGTGAGAGTTG-3 ;
[0011] (2)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品制備：提取標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性重組菌的質(zhì)粒DNA，稀釋為不同拷貝數(shù)梯 度；
[0012] (3)待測(cè)樣品制備：按Solarbio試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟提取待測(cè)樣品DNA ;
[0013] (4) SYBR Green I熒光定量PCR :以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品和待測(cè)樣品分別為模板，F(xiàn)和R 為引物進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)；
[0014] (5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品進(jìn)行SYBR Green I熒光定量 PCR反應(yīng)結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線；
[0015] (6)結(jié)果判定：當(dāng)待測(cè)樣品SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)曲線呈"S"型，且Ct 值彡36. 5、Tm值介于86. 48°C?86. 65°C之間，判定待測(cè)樣品中含有須癬毛癬菌；若反應(yīng)曲 線為一條直線，則判斷樣品中不含須癬毛癬菌。
[0016] 前述的一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法，在步驟（2)中， 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性重組菌的質(zhì)粒DNA的0D260/0D280介于1. 8?2. 0之間。
[0017] 前述的一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法，在步驟（2)中， 拷貝數(shù)梯度為1.0 Χ?ο9?1.0X10拷貝/yL的9個(gè)梯度。
[0018] 前述的一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法，在步驟（4)中， SYBR Green I 熒光定量 PCR 反應(yīng)體系為：2X 的 SYBR Premix Ex Taql2. 5 μ L，10pmol/L 的 上游引物F、下游引物R各1. 0 μ L，DNA模板2. 0 μ L，用滅菌超純水補(bǔ)足至25. 0 μ L。
[0019] 前述的一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法，在步驟（4) 中，SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性60s ;94°C變性30s，54°C退火30s， 72°C延伸50s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
[0020] 本發(fā)明的有益之處在于：采用SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方 法整個(gè)過(guò)程僅需要3小時(shí)就能得出準(zhǔn)確結(jié)果，而且一次可以進(jìn)行96個(gè)樣品的檢測(cè)，較其他 方法具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)、通量高等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)榧膊〉闹委熀?疫情的控制提供保障。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中獲得的SYBR Green I熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0022] 圖2是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中獲得的SYBR Green I熒光定量PCR溶解曲線；
[0023] 圖3是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中獲得的一組SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè) 結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 1.引物合成
[0025] 參照GenBank已發(fā)表的須癬毛癬菌基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物：
[0026] 上游引物 F : 5' -GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG-3'，
[0027] 下游引物 R : 5' -GGAGACCATCTGTGAGAGTTG-3。
[0028] 預(yù)期擴(kuò)增片段大小288bp。
[0029] 2.標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品制備：
[0030] (1)準(zhǔn)菌株DNA提取
[0031] 將須癬毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株接種在土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基，28°C搖床培養(yǎng)72h，離心收集 菌絲，冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。將菌絲解凍，用液氮研磨，然后按Solarbio試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟 提取DNA。
[0032] (2)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性重組菌的構(gòu)建
[0033] 以提取的標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為模板，F(xiàn)和R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：Mix 25 4匕引物各1.(^1^模板0嫩4.(^1^加(1(1!120補(bǔ)足25以匕反應(yīng)程序?yàn)椋?41：預(yù)變性 3min ;94°C變性 30s，54°C退火 30s，72°C延伸 50s，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C再延伸 lOmin，于 4°C 終止反應(yīng)，保存?zhèn)溆谩?br> [0034] 取5yL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，在288bp出觀察到條帶，然后由上海生 工生物工程技術(shù)服務(wù)公司序列測(cè)定正確。
[0035] 將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后，與pMDIS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到 重組菌。
[0036] 將重組菌經(jīng)雙酶切和PCR鑒定為陽(yáng)性，得到標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性重組菌。
[0037] (3)提取標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性重組的質(zhì)粒DNA，稀釋為不同拷貝數(shù)梯度
[0038] 按Solarbio試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟提取標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性重組菌的DNA，測(cè)定0D260值和 0D280值，0D260/0D280值介于1. 8?2. 0的準(zhǔn)陽(yáng)性重組的質(zhì)粒DNA可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0039] 根據(jù)0D260值計(jì)算質(zhì)粒濃度，并換算成拷貝數(shù)，然后以10倍梯度稀釋成 1.0X10 9?1.0X10拷貝/yL的9個(gè)梯度?？截悢?shù)=(濃度X阿伏加德羅常數(shù)V(-個(gè) 堿基對(duì)的平均分子量X總長(zhǎng)度）。以稀釋的不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品為模板進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR。
[0040] 3.待測(cè)樣品制備
[0041] 將臨床分離的待測(cè)菌株接種在土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基，28°C搖床培養(yǎng)72h，離心收 集菌絲，冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。將菌絲解凍，用液氮研磨，然后按Solarbio試劑盒說(shuō)明書(shū)的步 驟提取DNA，作為待測(cè)樣品組模板進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR。
[0042] 4. SYBR Green I 熒光定量 PCR
[0043] 以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品待測(cè)樣品分別為模板，F(xiàn)和R為引物，進(jìn)行SYBR Green I熒光定 量 PCR 反應(yīng)。SYBR Green I 熒光定量 PCR 反應(yīng)體系為：2X 的 SYBR Premix Ex Taql2. 5 μ L， 10pm〇l/L的上游引物F、下游引物R各1. 0 μ L，DNA模板2. 0 μ L，用滅菌超純水補(bǔ)足至 25. 0 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性60s ;94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸50s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。
[0044] 5.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線：
[0045] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果，采用軟件自動(dòng)分析 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1)和溶解曲線（見(jiàn)圖2)。
[0046] 6.結(jié)果判定：
[0047] 待測(cè)樣品SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)曲線呈"S"型（見(jiàn)圖3)，而且結(jié)合標(biāo)準(zhǔn) 曲線和溶解曲線得出：Ct值彡36. 5,且Tm值介于為86. 48°C?86. 65°C之間，所以判定待測(cè) 樣品中含有須癖毛癖囷。
[0048] 7. SYBR Green I熒光定量PCR的敏感性和特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
[0049] (1)敏感性試驗(yàn)
[0050] 分別取稀釋的1. OX 109?1. 0X 10拷貝/ μ L的9個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品1 μ L為 模板進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR和普通PCR，測(cè)定SYBR Green I熒光定量PCR的敏感 性，并與普通PCR進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法能檢出10拷貝/ μ L的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品，而常規(guī) PCR只能檢出103拷貝/ μ L的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品，即SYBR Green I熒光定量PCR的敏感性是常 規(guī)PCR的100倍。
[0051] ⑵特異性實(shí)驗(yàn)
[0052] 用兔須癬毛癬菌、犬小孢子菌、絮狀表皮癬菌、紅毛癬菌、白色念珠菌分離菌株和 兔須癬毛癬菌的臨床樣品的DNA做為模板進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR。結(jié)果顯示：兔 須癬毛癬菌的分離株和兔須癬毛癬菌的臨床樣品的反應(yīng)曲線呈"S"型，CT值為18?25之 間；而犬小孢子菌、絮狀表皮癬菌、紅毛癬菌、白色念珠菌的分離菌株的反應(yīng)曲線為一條直 線，為陰性結(jié)果（見(jiàn)圖3)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)Ct值變異系數(shù)小于5%，表明SYBR Green I熒光定量 PCR的特異性強(qiáng)。
【權(quán)利要求】
1. 一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 引物合成： 上游引物 F :5' -GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG-3'， 下游引物 R :5' -GGAGACCATCTGTGAGAGTTG-3 ; (2) 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品制備：提取標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性重組菌的質(zhì)粒DNA，稀釋為不同拷貝數(shù)梯度； (3) 待測(cè)樣品制備：按Solarbio試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟提取待測(cè)樣品DNA ; (4) SYBR Green I熒光定量PCR :以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品和待測(cè)樣品分別為模板，F(xiàn)和R為引 物進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)； (5) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR反 應(yīng)結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線； (6) 結(jié)果判定：當(dāng)待測(cè)樣品SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)曲線呈"S"型，且Ct值 彡36. 5、Tm值介于86. 48°C?86. 65°C之間，判定待測(cè)樣品中含有須癬毛癬菌；若反應(yīng)曲線 為一條直線，則判斷樣品中不含須癬毛癬菌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法， 其特征在于，在步驟（2)中，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性重組菌的質(zhì)粒DNA的0D260/0D280介于1. 8?2. 0之 間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的 方法，其特征在于，在步驟（2)中，拷貝數(shù)梯度為1.0 X109?1.0X10拷貝/ yL的9個(gè)梯 度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法， 其特征在于，在步驟（4)中，SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)體系為：2X的SYBR Premix Ex Taql2. 5 μ L，10pmol/L的上游引物F、下游引物R各1. 0 μ L，DNA模板2. 0 μ L，用滅菌超純 水補(bǔ)足至25. 0 μ L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)兔須癬毛癬菌的方法， 其特征在于，在步驟（4)中，SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性60s ;94°C 變性30s，54°C退火30s，72°C延伸50s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104195263SQ201410493854
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】劉彥威, 劉娜, 劉利強(qiáng), 杜鵑, 劉建釵, 張永英, 朱美霞, 劉貴巧 申請(qǐng)人:河北工程大學(xué)