專利名稱：一種熒光定量pcr檢測aapb的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種熒光定量PCR (聚合酶鏈式反應) 檢測AAPB的方法。
背景技術(shù)：
好氧不產(chǎn)氧光合細菌，Aerobic anoxygenic phototrophic bacteria (AAPB)是一類能利用光能進行光合作用的細菌。AAPB有著獨特的生理生態(tài)特征(1)專性好氧；(2) 營光合作用生長卻不全依賴于光；(3)細菌葉綠素a (BChla)含量比厭氧光合細菌低很多， 含有類胡蘿卜素。AAPB在水生態(tài)系統(tǒng)中有著特殊的意義，現(xiàn)有的文獻表明(I)AAPB分布廣泛，在海洋、酸性礦山污水、熱泉、江河和河口以及湖泊中都有發(fā)現(xiàn)；( 在水生生態(tài)系統(tǒng)中占有較大比例，如在海洋中占總細菌的10%，(通過熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)在太平洋中占總原核細胞數(shù)的 5%，在大西洋中則是2%-16%)，河口中占34%，在某些高山淡水湖泊中則超過50%，但是也有文獻表明AAPB在15公里的近海的18個點位中一般只在1%左右，最多也不超過3% ； (3) AAPB在海洋生態(tài)系統(tǒng)的碳循環(huán)中有重要作用。將Bchla (細菌葉綠素a)產(chǎn)生的光合能量轉(zhuǎn)換為呼吸消耗所需的相應的碳量， 在陸架海和大洋分別為0.27 mgC m_3 day—1和0.11 mgC πΓ3 day—1相當于各自海區(qū)初級生產(chǎn)力的2. 4%和5.4%。根據(jù)政府間氣候委員會(IPCC)的模型，海洋吸收和釋放二氧化碳的差值大約是2%，所以基于BChla的光能利用足以改變一個海區(qū)碳的“匯” “源”格局 (Jiao et al. , 2010 "Significant roles of bacteriochlorophylla supplemental to chlorophylla in the ocean” The ISME Journal, 4(4) : 595-597)?，F(xiàn)在世界各國極其關(guān)注全球碳排放。截止到2009年2月，一共有183個國家通過了《京都議定書》。因此研究 AAPB對于我們理解全球碳排放、氣候變化、溫室效應等有重要現(xiàn)實意義。但是以上研究幾乎都是針對海洋而針對湖泊，水庫，河流的研究較少，對AAPB在淡水水生態(tài)系統(tǒng)中碳循環(huán)作用知之甚少?，F(xiàn)有技術(shù)使用流式細胞儀檢測AAPB，需要大型儀器流式細胞儀。流式細胞儀檢測方法主要運用于海洋水體中，相對于海洋水體湖泊、河流等水體中顆粒性物質(zhì)濃度更高，粒徑更大對流式細胞儀有較大損耗；而且流式細胞儀價格昂貴一般科研機構(gòu)不具備。 使用的試劑DAPI染料等是強烈致癌物質(zhì)，對人體和環(huán)境都不友好，現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種快捷簡便、安全的檢測AAPB的方法。因此，AAPB檢測方法還有待發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種熒光定量PCR檢測AAPB的方法，旨在解決現(xiàn)有的檢測AAPB的技術(shù)操作困難并對環(huán)境不友好的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種熒光定量PCR檢測AAPB的方法，其中，根據(jù)AAPB的基因片段設計出的引物，進行實時熒光定量PCR檢測；其中，所述引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 1 的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO. 2的核苷酸序列。所述的熒光定量PCR檢測AAPB的方法，其中，所述熒光定量PCR檢測AAPB的方法具體包括以下步驟
51、采集水體DNA樣品將采集到的水體樣品經(jīng)過過濾，得到水體中的細菌，并對細菌進行總DNA的提取純化，得到水體樣品DNA ；
52、建立AAPB熒光定量PCR標準曲線取好氧不產(chǎn)氧光合細菌作為標準菌株，提取其 DNA并稀釋成多個濃度梯度，用好氧不產(chǎn)氧異養(yǎng)細菌基因引物對，分別以各個濃度的 DNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，根據(jù)得到的各個濃度梯度的循環(huán)閾C(t)值繪制熒光定量PCR標準曲線；
53、建立水體總細菌熒光定量PCR標準曲線
將大腸桿菌作為標準菌株，提取DNA并稀釋成多個濃度梯度，按照步驟S2的實時熒光定量PCR的反應體系和反應程序，用總菌引物分別以各個濃度的DNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增根據(jù)得到的各個濃度梯度的循環(huán)閾C(t)值繪制熒光定量PCR標準曲線；
54、樣品檢測
取步驟Sl中得到的水體樣本DNA作為模板，按步驟S2的實時熒光定量PCR的反應體系和反應程序，分別用總菌引物和風/#基因引物，進行實時熒光定量PCR儀上進行擴增，并同時進行陰性對照和陽性對照的擴增；其中陰性對照采用去離子水，陽性對照采用好氧不產(chǎn)氧光合細菌的DNA ；將DNA樣本的循環(huán)閾值C (t)與標準曲線對照，得到DNA樣本中的pufM 基因片段拷貝濃度。所述的熒光定量PCR檢測AAPB的方法，其中，所述步驟Sl具體為
將采集到的水體樣品經(jīng)過5 μ m的微孔濾膜過濾，得到的濾液再用0. 2 μ m的微孔濾膜進行過濾；對0. 2 μ m微孔濾膜上的物質(zhì)進行細菌的總DNA提取純化，得到水體樣品DNA。所述的熒光定量PCR檢測AAPB的方法，其中，所述步驟S3中的總菌引物，其正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 3的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO. 4的核苷酸序列。 所述的熒光定量PCR檢測AAPB的方法，其中，步驟S2中所述熒光定量PCR檢測的反應體系為
20 μ L SYBR-Green Master Mix, 1 μ L純化后的DNA樣品，用于擴增的引物對，每條引物濃度10 pmol、添加量為0. 4 μ L，以去離子水補足至25 μ L的終體積。所述的熒光定量PCR檢測AAPB的方法，其中，步驟S2中所述實時熒光定量PCR的反應程序為50°C 2 min,95°C 30 s，接著進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C 10 s,54°C 20 s 和 72°C 10 s。有益效果本發(fā)明所提供的檢測AAPB的方法與流式細胞儀檢測方法相比，準確度更高，容易操作，成本低廉，效率高而且更加安全，無毒無害，更加適合應用于湖泊、河流等顆粒性物質(zhì)濃度高、顆粒粒徑大的水體AAPB的檢測中。本發(fā)明方法定量檢測重復性好，可以對樣品進行高通量的檢測且僅需2個小時左右就能完成。


圖1為本發(fā)明實施例2中熒光定量PCR敏感度檢測的熒光信號圖。圖2為本發(fā)明實施例2中熒光定量PCR熔鏈曲線圖。圖3為本發(fā)明實施例2中AAPB熒光定量PCR標準曲線。圖4為本發(fā)明實施例3中總細菌熒光定量PCR標準曲線。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種熒光定量PCR檢測AAPB的方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明提供的一種熒光定量PCR檢測AAPB的方法，能快速準確地定量檢測水體中 AAPB，能用于對湖泊、水庫、河流等淡水水體中AAPB的檢測。本方法具有操作簡單、對環(huán)境友好、檢測結(jié)果準確等優(yōu)點，采用本方法建立的標準曲線靈敏度高、重復性好，在AAPB的鑒定領(lǐng)域具有良好的應用前景。本發(fā)明所提供的熒光定量PCR檢測AAPB的方法，是利用根據(jù)AAPB的基因片段設計出的引物，進行實時熒光定量PCR檢測，其中所述引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 1的核苷酸序列，forward (5，-TATAAYCCATTTCAYGC-3，)；反向引物具有序列表中 SEQ ID NO. 2 的核苷酸序列，reverse (5' -GCRAACCACCAAGCCCA-3')。本發(fā)明的方法主要步驟包括采集和處理，過濾水體樣品并提取DNA，應用STOR Green I嵌合熒光法針對基因片段進行實時熒光定量PCR檢測，應用計算機獲取標準曲線，計算待測樣品中基因片段拷貝數(shù)和AAPB的數(shù)量。本發(fā)明的方法具體包括以下具體步驟 Si、采集水體DNA樣品
將采集到的水體樣品經(jīng)過5 μ m的微孔濾膜過濾，得到的濾液再用0. 2 μ m的微孔濾膜進行過濾；對0. 2 μ m微孔濾膜上的物質(zhì)進行細菌總DNA的提取純化，得到水體DNA樣
P
BFI οS2、建立AAPB熒光定量PCR標準曲線
取已知的好氧不產(chǎn)氧光合細菌作為標準菌株，提取其DNA并按10倍稀釋法稀釋成 IO3 IO8拷貝每微升的6個濃度梯度，每個稀釋梯度重復3次，用好氧不產(chǎn)氧異養(yǎng)細菌基因引物對，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，反應結(jié)束后，根據(jù)得到的各個濃度梯度的循環(huán)閾C(t)值采用計算機自動繪制熒光定量PCR標準曲線。S3、建立水體總細菌熒光定量PCR標準曲線
通過確定總細菌的16S rRNA gene的拷貝數(shù)，可確定水體總菌數(shù)。將大腸桿菌作為標準菌株，提取DNA并按10倍稀釋法稀釋成10° IO5拷貝每微升的6個濃度梯度，每個稀釋梯度重復3次，按照步驟S2的實時熒光定量PCR的反應體系和反應程序，用總菌引物在實時熒光定量PCR儀上進行擴增；反應結(jié)束后，根據(jù)得到的各個濃度梯度的循環(huán)閾C(t)值采用計算機自動繪制熒光定量PCR標準曲線。所使用的總菌引物，正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 3的核苷酸序列，(5' -CCTACGGGAGGCAGCAG-3')，反向引物具有序列表中SEQ ID NO. 4 的核苷酸序列，(5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，)。S4、樣品檢測取步驟Sl中得到的DNA樣本作為模板，按步驟S2的實時熒光定量PCR的反應體系和反應程序，分別用總菌引物和基因引物，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，并同時進行陰性對照和陽性對照的擴增。其中陰性對照采用去離子水，陽性對照采用好氧不產(chǎn)氧光合細菌的DNA。反應結(jié)束后，將DNA樣本的循環(huán)閾值C(t)與標準曲線對照，得到DNA樣本中的基因片段拷貝濃度，據(jù)此得到原水樣中的/7 /#基因拷貝濃度，進而得到原水樣中好氧不產(chǎn)氧光合細菌數(shù)量和占總細菌的比例。在本發(fā)明方法中，所述熒光定量PCR檢測的反應體系可以為
20 μ L SYBR-Green Master Mix, 1 μ L純化后的DNA樣品，用于擴增的引物對，每條引物濃度10 pmol、添加量為0.4 μ L，以去離子水補足至25 μ L的終體積。所述實時熒光定量PCR的反應程序可為
500C 2 min，95°C 30 s，接著進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C 10 s,54°C 20 s和 72°C 10 s。PCR完成后，按0. 1°C每秒的升溫速率從72°C升至95°C進行溶解曲線的分析驗證。本發(fā)明方法優(yōu)點明顯，與流式細胞儀檢測方法相比準確度更高，容易操作，成本低廉，效率高而且更加安全，無毒無害。流式細胞儀檢測方法主要運用于海洋水體中，相對于海洋水體湖泊、河流水體中顆粒性物質(zhì)濃度更高，粒徑更大對流式細胞儀有較大損耗；而且流式細胞儀價格昂貴一般科研機構(gòu)不具備。采用本發(fā)明的方法對湖泊、河流等水體AAPB進行檢測則不存在這些問題，定量檢測重復性好，可以對樣品進行高通量的檢測且僅需2個小時左右就能完成。實施例1樣品的采集與預處理
對TH湖主要入湖河流水體的水樣進行AAPB的定量。采集水體樣品TH廣9，將得到的水體樣品分別經(jīng)過5 μ m的微孔濾膜過濾后再用0.2 μ m的膜過濾濾液，壓力小于100 mbar; 然后對0. 2 μ m濾膜上的物質(zhì)進行總DNA的提取純化，得到水體DNA樣品TH廣9。實施例2建立AAPB熒光定量PCR標準曲線
取已知的好氧不產(chǎn)氧光合細菌作為標準菌株，提取其DNA并按10倍稀釋法稀釋成 IO3 IO8拷貝每微升的6個濃度梯度，用好氧不產(chǎn)氧異養(yǎng)細菌/^//#基因引物對，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。本實施例中是采用STORGreen I嵌合熒光法進行實時熒光定量 PCR0將上述各濃度梯度DNA作為模板，進行擴增反應每個濃度加入3個反應管同時進行。所述熒光定量PCR檢測的反應體系為
20 μ L SYBR-Green Master Mix, 1 μ L純化后的DNA樣品，用于擴增的引物對，每條引物濃度10 pmol、添加量為0.4 μ L，以去離子水補足至25 μ L的終體積。所述引物對為
正向引物/^I forward (5，- TATAAYCCATTTCAYGC-3，)； 反向引物pufM reverse (5，-GCRAACCACCAAGCCCA-3')。所述實時熒光定量PCR的反應程序為
500C 2 min，95°C 30 s，接著進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C 10 s,54°C 20 s和 72°C 10 s。PCR完成后，按0. 1°C每秒的升溫速率從72°C升至95°C進行溶解曲線的分析驗證。反應結(jié)束后，根據(jù)得到的各個濃度梯度的循環(huán)閾C(t)值采用計算機自動繪制熒光定量PCR標準曲線。AAPB陽性克隆DNA中基因片段拷貝濃度(拷貝/ μ L)按照如下方法進行計算
DNA中的風/對考貝濃度(拷貝/mL) = [6. 02 X IO23 (拷貝/mol)]X [DNA濃度(g/mL)]/ [一個基因組的摩爾質(zhì)量(g/mol)]。以初始模板DNA量的對數(shù)為橫坐標，以PCR反應過程中每個稀釋樣品的C(t)值為縱坐標，分別繪制AAPB及總菌的標準曲線，如圖3和圖4所示。實施例中熒光信號的采集和相關(guān)數(shù)據(jù)處理都由實時熒光定量PCR儀所帶的軟件完成。 按0. 1°C每秒的升溫速率從72°C升至95°C進行溶解曲線的分析驗證。圖1熒光定量PCR敏感度檢測的熒光信號圖，說明經(jīng)過40個循環(huán)待測樣品PCR都進入平臺期，循環(huán)數(shù)再增加不會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。圖2熒光定量PCR熔鏈曲線圖，熔鏈溫度在86°C左右，熔鏈曲線的峰單一，說明PCR擴增反應過程中沒有非目的片段擴增；擴增效率高、特異性好。3為本實施例中AAPB熒光定量PCR標準曲線，y = -3. 260 X log (conc) + 8. 041 (注conc表示反應體系中的標準質(zhì)?？截悢?shù))。實施例3建立總細菌熒光定量PCR標準曲線
將大腸桿菌作為標準菌株，提取DNA并按10倍稀釋法稀釋成10° IO5拷貝每微升的 6個濃度梯度，按照實施例2中的實時熒光定量PCR的反應體系和反應程序，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。將上述各濃度梯度DNA作為模板，進行擴增反應每個濃度加入3個反應管同時進行。所使用的總菌引物
正向引物(5' -CCTACGGGAGGCA GCAG-3，)； 反向引物(5，-ATTACCGCGGCTG CTGG-3，)。反應結(jié)束后，根據(jù)得到的各個濃度梯度的循環(huán)閾C(t)值采用計算機自動繪制熒光定量PCR標準曲線。圖4為本實施例中總細菌熒光定量PCR標準曲線，y = -2. 936 X log (conc) + 8. 601 (注conc表示反應體系中的標準質(zhì)粒拷貝數(shù))。實施例4樣品檢測
以實施例1提取的TH湖入湖河流的水樣DNA樣品TH1、為模板，按實施例2的實時熒光定量PCR的反應體系和反應程序，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。反應體系和擴增條件與作標準曲線時一致，每個樣品重復3次，同時做陽性對照(以克隆的AAPB菌株DNA 替代待測樣品DNA)和陰性對照(以去離子水代替待測樣品DNA)。反應結(jié)束后根據(jù)樣品的循環(huán)閾值C(t)值，用標準曲線方程計算出總菌及風/#基因片段的初始拷貝數(shù)，兩者之比即為AAPB在樣品中的豐度。
所測水樣中AAPB的豐度如下表所示
權(quán)利要求
1.一種熒光定量PCR檢測AAPB的方法，其特征在于，根據(jù)AAPB的基因片段設計出的引物，進行實時熒光定量PCR檢測；其中，所述引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 1的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO. 2的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR檢測AAPB的方法，其特征在于，所述熒光定量 PCR檢測AAPB的方法具體包括以下步驟51、采集水體DNA樣品將采集到的水體樣品經(jīng)過過濾，得到水體中的細菌，并對細菌進行總DNA的提取純化，得到水體樣品DNA ；52、建立AAPB熒光定量PCR標準曲線取好氧不產(chǎn)氧光合細菌作為標準菌株，提取其 DNA并稀釋成多個濃度梯度，用好氧不產(chǎn)氧異養(yǎng)細菌基因引物對，分別以各個濃度的 DNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，根據(jù)得到的各個濃度梯度的循環(huán)閾C(t)值繪制熒光定量PCR標準曲線；53、建立水體總細菌熒光定量PCR標準曲線將大腸桿菌作為標準菌株，提取DNA并稀釋成多個濃度梯度，按照步驟S2的實時熒光定量PCR的反應體系和反應程序，用總菌引物分別以各個濃度的DNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增根據(jù)得到的各個濃度梯度的循環(huán)閾C(t)值繪制熒光定量PCR標準曲線；54、樣品檢測取步驟Sl中得到的水體樣本DNA作為模板，按步驟S2的實時熒光定量PCR的反應體系和反應程序，分別用總菌引物和風/#基因引物，進行實時熒光定量PCR儀上進行擴增，并同時進行陰性對照和陽性對照的擴增；其中陰性對照采用去離子水，陽性對照采用好氧不產(chǎn)氧光合細菌的DNA ；將DNA樣本的循環(huán)閾值C (t)與標準曲線對照，得到DNA樣本中的pufM 基因片段拷貝濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光定量PCR檢測AAPB的方法，其特征在于，所述步驟Sl具體為將采集到的水體樣品經(jīng)過5 μ m的微孔濾膜過濾，得到的濾液再用0. 2 μ m的微孔濾膜進行過濾；對0. 2 μ m微孔濾膜上的物質(zhì)進行細菌的總DNA提取純化，得到水體樣品DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光定量PCR檢測AAPB的方法，其特征在于，所述步驟S3中的總菌引物，其正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 3的核苷酸序列，反向引物具有序列表中 SEQ ID NO. 4的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光定量PCR檢測AAPB的方法，其特征在于，步驟S2中所述熒光定量PCR檢測的反應體系為20 μ L SYBR-Green Master Mix, 1 μ L純化后的DNA樣品，用于擴增的引物對，每條引物濃度10 pmol、添加量為0.4 μ L，以去離子水補足至25 μ L的終體積。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光定量PCR檢測AAPB的方法，其特征在于，步驟S2中所述實時熒光定量PCR的反應程序為50°C 2 min,95°C 30 s，接著進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括 94°C 10 s，54°C 20 s 和 72°C 10 s。
全文摘要
本發(fā)明公開一種熒光定量PCR檢測AAPB的方法，所述熒光定量PCR檢測AAPB的方法是根據(jù)AAPB的pufM基因片段設計出的引物，進行實時熒光定量PCR檢測；其中，所述pufM引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO.1的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQIDNO.2的核苷酸序列。本發(fā)明所提供的檢測AAPB的方法與流式細胞儀檢測方法相比，準確度更高，容易操作，成本低廉，效率高而且更加安全，無毒無害，更加適合應用于湖泊、河流等顆粒性物質(zhì)濃度高、顆粒粒徑大的水體AAPB的檢測中。本發(fā)明方法定量檢測重復性好，可以對樣品進行高通量的檢測且僅需2個小時左右就能完成。
文檔編號C12Q1/04GK102399902SQ20111043270
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者吳世凱, 杜如虛, 郭亮 申請人:廣州中國科學院先進技術(shù)研究所