專利名稱：用于檢測(cè)高危型hpv 的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)高危型HPV的試劑盒和方法，尤其是一種用于檢測(cè)HPV16亞型和HPV18亞型的試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
臨床研究表明，人類乳頭狀瘤病毒(HPV)是目前為止唯一明確的致癌病毒，其持續(xù)性感染將導(dǎo)致宮頸癌變和子宮頸上皮內(nèi)瘤變。經(jīng)過近30年的大量研究表明，宮頸的高危型HPV持續(xù)感染是引起宮頸癌及癌前病變的直接原因。預(yù)防高危型HPV感染就可以預(yù)防宮頸癌前病變，從而避免晚期癌癥發(fā)生。高危型HPV中，其中，HPV16(53%)、HPV18(15%)等的感染是引起宮頸癌變的重要因素，因此進(jìn)行該病毒的篩查是預(yù)防子宮疾病和宮頸癌的最有效方法。目前，臨床上應(yīng)用的HPV DNA檢測(cè)方法主要有以下幾種:雜交捕獲檢測(cè)法、PCR檢測(cè)法、PCR結(jié)合雜交檢測(cè)法和ELISA方法。雜交捕獲檢測(cè)法的代表產(chǎn)品為QIAGEN(Gaithersburg，Inc.)公司的高危型人乳頭瘤病毒檢測(cè)試劑盒(Hybrid Capture2 High-Risk HPV DNA Test)。此種方法檢測(cè)價(jià)格昂貴，無法在基層醫(yī)院普及應(yīng)用，且該產(chǎn)品只能對(duì)13種高危型HPV的DNA進(jìn)行定性檢測(cè)，檢測(cè)覆蓋病毒型別較少，在HPV篩查檢測(cè)中應(yīng)用有一定的局限性。

近年來發(fā)展了實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-time PCR)檢測(cè)方法。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)使PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析的全過程均在單管封閉條件下進(jìn)行，并通過微機(jī)控制，實(shí)現(xiàn)了對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)和自動(dòng)分析結(jié)果，PCR與雜交共享的方法避免了單純使用PCR所造成的假陽(yáng)性，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的特異性。但此種方法檢測(cè)HPV的型別一般只包括一部分常見高危型別的HPV，檢測(cè)型別覆蓋范圍較小，且配套設(shè)備價(jià)格昂貴，同樣無法在基層醫(yī)院普及。PCR結(jié)合雜交檢測(cè)法進(jìn)行基因診斷靈敏、快捷，結(jié)果可靠。核酸雜交法的靈敏度和特異性均顯著高于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，并且可應(yīng)用特異性探針對(duì)HPV分型，已有的商業(yè)化檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品包括人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)和人乳頭狀瘤病毒核酸擴(kuò)增分型檢測(cè)試劑盒。這些試劑盒在檢測(cè)的同時(shí)還對(duì)所檢測(cè)到的病毒進(jìn)行分型，方便臨床診斷，但由于HPV 16和18兩種亞型是最主要的高危病毒亞型，因此對(duì)于每份樣品如果都使用能夠區(qū)分出各種亞型的試劑盒或基因芯片來檢測(cè)的話，無疑會(huì)造成資源的浪費(fèi)。此外，還有歐洲Innogenetics的INNO-LiPA HPV分型試劑盒、羅氏(Roche)的Line Blot HPV試劑盒，是以條形膜作傳統(tǒng)雜交分型，也相當(dāng)費(fèi)時(shí)而手段繁復(fù)。以ELISA類型分析方法如羅氏(Roche)的AMPLICOR HPV MWP試劑盒因?yàn)榉€(wěn)定性、靈敏度等問題，未能得到廣泛應(yīng)用。有鑒于此，需要提供一種更加便利、實(shí)用、穩(wěn)定和節(jié)約型的檢測(cè)方法和試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供了一種特異性檢測(cè)樣品中是否存在HPV 16亞型或18亞型的試劑盒，所述試劑盒包括:(i)如SEQ ID NO:1和2所示的用于擴(kuò)增HPV16亞型DNA的第一引物對(duì)；(ii)如SEQ ID N0:3和4所示的用于擴(kuò)增HPV18亞型DNA的第二引物對(duì)；以及(iii)如SEQ ID N0:5和6所示的用于與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的一對(duì)探針或與SEQ ID N0:5和6所示的序列互補(bǔ)的序列的一對(duì)探針。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒中還包含(iv)如SEQ ID NO: 7和8所示的用于擴(kuò)增人類β_球蛋白基因的片段的引物對(duì)；以及如SEQ ID NO: 9所示的用于與人類β-球蛋白擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述引物均在5’端標(biāo)記有生物素。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述探針均在5’端連接有氨基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒中還包含(V)如SEQ ID NO: 10所示的一段3’端經(jīng)生物素修飾的隨機(jī)寡核苷酸探針。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述樣品為宮頸脫落細(xì)胞、液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本或石蠟組織切片。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述PCR擴(kuò)增所用的模板DNA為5 ng至100 ng。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述PCR的擴(kuò)增條件為95°C 9 min ； 95°C 20 s、55°C 30s ,72°C 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)；72°C 5 min ；4 °C保存。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述PCR擴(kuò)增的各步變溫速率為1°C /S。本發(fā)明另一方面提供了一種檢測(cè)樣品中是否存在HPV 16亞型和18亞型的方法，所述方法包括:(a)提取樣品的DNA ； (b)使用SEQ ID NO:1至4的引物對(duì)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(c)利用導(dǎo)流雜交技術(shù)使用SEQ ID NO: 5和6的探針與PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行雜交；以及(d)通過顯色反應(yīng)識(shí)別是否發(fā)生雜交反應(yīng)從而確定樣品中是否存在HPV 16亞型和18亞型。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(b)還包括使用SEQ ID NO: 7和8所示的用于擴(kuò)增人類β_球蛋白基因的片段的引物對(duì)，并在步驟(c)中使用如SEQ ID NO: 9所示的用于與人類β_球蛋白擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(C)還包括使用SEQ ID NO: 10所示的一段3’端經(jīng)生物素修飾的隨機(jī)寡核苷酸探針作為對(duì)照。本發(fā)明方法和試劑盒采用PCR結(jié)合雜交檢測(cè)法，PCR技術(shù)擴(kuò)增HPV DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物通過導(dǎo)流雜交技術(shù)與低密度DNA芯片進(jìn)行反向點(diǎn)雜交，檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)化成肉眼可識(shí)讀信號(hào)。此方法和試劑盒用于檢測(cè)樣本中是否含有高危型(包括16型和18型)HPV DNA，但對(duì)HPV不作具體分型。本發(fā)明在一個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)上同時(shí)檢測(cè)16型和18型HPVDNA，只要檢測(cè)樣本里包含HPV16型和/或18型DNA，并達(dá)到一定的檢測(cè)限，檢測(cè)結(jié)果即為陽(yáng)性。試劑盒的反應(yīng)簡(jiǎn)單，靈敏度高，通量高，并且減少實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間和雜交試劑用量，適用于HPV16、18型感染的臨床篩查。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明及其有益技術(shù)效果進(jìn)行進(jìn)一步說明。
圖1顯示HPV檢測(cè)陰性和陽(yáng)性結(jié)果判讀信號(hào)位置。圖2是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中HPV16、18的臨床樣本檢測(cè)結(jié)果。圖3是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中試劑盒的檢測(cè)結(jié)果。圖4是本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中試劑盒的檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用DNA擴(kuò)增和“導(dǎo)流”反向點(diǎn)雜交技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。首先，利用生物素標(biāo)記的引物來擴(kuò)增HPV基因組特異片段；然后，通過“導(dǎo)流”雜交方法，使生物素標(biāo)記的擴(kuò)增片段被特異性寡核苷酸探針雜交捕獲，而后進(jìn)行信號(hào)放大，以識(shí)別檢測(cè)結(jié)果。
實(shí)施例本發(fā)明提供一種檢測(cè)高危型HPV的試劑盒及其檢測(cè)方法，所述方法主要包括以下步驟:(a)提取樣品的DNA ； (b)使用SEQ ID NO:1至4的引物對(duì)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(c)利用導(dǎo)流雜交技術(shù)使用SEQ ID NO: 5和6的探針與PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行雜交；以及(d)通過顯色反應(yīng)識(shí)別是否發(fā)生雜交反應(yīng)從而確定樣品中是否存在HPV 16亞型和18亞型。以下以宮頸脫落細(xì)胞為例，具體說明本發(fā)明的方法。但應(yīng)理解的是，本發(fā)明的試劑盒和方法仍可適用于其他臨床樣品。(I)樣品/標(biāo)本采集及保存
以無菌棉拭子或?qū)m頸刷刷取患者的宮頸脫落細(xì)胞，以及用于活檢的組織標(biāo)本或疣組織，置于低溫冰箱(_70°C或-20°C )保存。(II) DNA 提取
加入Iml無菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，吸取全部液體轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，12000rpm離心5分鐘,去上清,沉淀用QIAampc Blood Mini試劑盒(QIAGEN)按照Blood and bodyFluid Spin操作規(guī)程進(jìn)行DNA的提取。將提純DNA存放在_20°C _15°C備用。(III)目的DNA的擴(kuò)增
每個(gè)PCR反應(yīng)的總體積是25 μ I,反應(yīng)體系如下表I所示。表1.PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種特異性檢測(cè)樣品中是否存在HPV16亞型或18亞型的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括:(i)如SEQ ID NO:1和2所示的用于PCR擴(kuò)增HPV16亞型DNA的第一引物對(duì)；(ii)如SEQ ID N0:3和4所示的用于PCR擴(kuò)增HPV18亞型DNA的第二引物對(duì)；以及(iii)如SEQ ID NO: 5和6所示的用于與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的一對(duì)探針或與SEQ ID NO: 5和6所示的序列互補(bǔ)的序列的一對(duì)探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包含(iv)如SEQID NO:7和8所示的用于PCR擴(kuò)增人類β-球蛋白基因的片段的引物對(duì)；以及如SEQ ID NO: 9所示的用于與人類β_球蛋白擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述引物均在5’端標(biāo)記有生物素。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還包含(V)如SEQIDNO: 10所示的一段3’端經(jīng)生物素修飾的隨機(jī)寡核苷酸探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于:所述探針均在5’端連接有氨基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述樣品為宮頸脫落細(xì)胞、液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本或石蠟組織切片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述樣品為宮頸脫落細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增所用的模板DNA為5ng至 100 ng。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述PCR的擴(kuò)增條件為95°C9 min ；95°C 20 s、55°C 30 s ,72°C 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)；72°C 5 min ;4°C保存。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所 述的試劑盒，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的各步變溫速率為1°C/S。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性檢測(cè)樣品中是否存在HPV16亞型和18亞型的試劑盒，所述試劑盒包括(i)如SEQ ID NO:1和2所示的用于PCR擴(kuò)增HPV16亞型DNA的第一引物對(duì)；(ii)如SEQ ID NO:3和4所示的用于PCR擴(kuò)增HPV18亞型DNA的第二引物對(duì)；以及(iii)如SEQ ID NO:5和6所示的用于與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的一對(duì)探針或與SEQ ID NO:5和6所示的序列互補(bǔ)的序列的一對(duì)探針。本發(fā)明在一個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)上同時(shí)檢測(cè)16型和18型HPVDNA，只要檢測(cè)樣本里包含HPV16型和/或18型DNA并達(dá)到一定的檢測(cè)限，檢測(cè)結(jié)果即為陽(yáng)性。試劑盒的反應(yīng)簡(jiǎn)單，靈敏度高，通量高，并且可減少實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間和雜交試劑用量，適用于HPV16、18型感染的臨床篩查。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103173564SQ201110432629
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者曾慶, 張中滿, 張穎芬, 羅曉蘭 申請(qǐng)人:廣州好芝生物科技有限公司