本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種braf基因v600e突變的熒光定量檢測引物和探針。

背景技術(shù)：

braf基因位于染色體臂7q34上。它編碼b-raf，絲氨酸-蘇氨酸激酶是ras-raf-mek-erk-mapk(絲裂原活化蛋白激酶)信號級聯(lián)的一部分。該途徑的激活涉及促進(jìn)細(xì)胞的生長，增殖和分化。

人體中存在三種功能性raf蛋白，即araf、braf和craf。其中，braf具有最高的基礎(chǔ)激酶活性，是mapk通路最有效的激活劑。

braf基因由18個外顯子組成，最常見的活化突變在1799位核苷酸的外顯子15中發(fā)現(xiàn)，涉及將胸腺嘧啶轉(zhuǎn)換為腺嘌呤。這導(dǎo)致在位置600的谷氨酸取代纈氨酸，其被指定為v600e。該突變發(fā)生在b-raf蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)，據(jù)報道其激酶活性高于其正常對應(yīng)物的10倍。因此，它作為癌基因，促進(jìn)細(xì)胞生長，分化和生存。

已經(jīng)鑒定了30多種不同的braf突變。然而，v600e占所有braf突變的約90％，是臨床實(shí)驗(yàn)室通常測試的突變。

braf基因突變在許多不同的癌癥中發(fā)現(xiàn)，報道了各種頻率。發(fā)生率最高的惡性黑色素瘤(27-70％)，甲狀腺乳頭狀癌(36-53％)，結(jié)直腸癌(5-22％)和漿液性卵巢癌(30％)。然而，它也可能發(fā)生在其他癌癥，包括肺癌，膠質(zhì)瘤，室管膜瘤，非霍奇金淋巴瘤，急性淋巴細(xì)胞性白血病，肝癌，胃癌和食管癌中的低頻率(1-3％)。

免疫組化技術(shù)(ihc)用特異性抗體ve1識別v600e突變蛋白來檢測braf突變，且與sanger測序法一致性達(dá)95％以上，即使腫瘤樣本少的標(biāo)本也可檢測，易于判讀，兼具低成本和高效的優(yōu)勢，因此更適合作為初篩手段，正逐漸成為當(dāng)前braf基因突變常用檢測方法。但該方法仍存在一些缺點(diǎn)。因?yàn)椴⒎撬型蛔兌家鹂乖瓉G失，所以檢測的突變種類局限性較大。免疫組化結(jié)果有時因?yàn)閳D像不夠清晰或者抗原抗體反應(yīng)不充分導(dǎo)致結(jié)果很難解釋?？芍貜?fù)性較差，小活檢標(biāo)本存在抽樣誤差。

高通量測序技術(shù)(nextgenerationsequencing)通過對braf基因進(jìn)行深度測序，可以獲得braf整個基因內(nèi)的突變信息，尤其是brafv600e，并且能夠通過測序深度計算突變頻率。但不可避免的存在測序成本高、實(shí)驗(yàn)周期長等缺點(diǎn)，這也導(dǎo)致測序技術(shù)一般不用于初篩，而是作為初篩之后的確定手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高靈敏度、高特異性、可重復(fù)性高、實(shí)驗(yàn)成本低并且能夠快速得到brafv600e突變情況的快速檢測方法。

首先，本發(fā)明提供了一種用于檢測braf基因v600e突變的組合物。

本發(fā)明所提供的用于檢測braf基因v600e突變的組合物，具體由一個引物對和一個探針組成；所述引物對由引物1和引物2組成，所述引物1為序列表中序列1所示的單鏈dna，所述引物2為序列表中序列2所示的單鏈dna；所述探針為序列表中序列3所示的單鏈dna探針。

其中，所述引物對和所述探針也分別屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述探針的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述熒光基團(tuán)具體為fam；所述淬滅基團(tuán)具體為bhq1。

其次，本發(fā)明還提供了一種用于檢測braf基因v600e突變的試劑盒。

本發(fā)明所提供的用于檢測braf基因v600e突變的試劑盒，含有下述a)和b)：

a)所述組合物或所述引物或所述探針；

b)陰性引物；所述陰性引物為序列表中序列4所示的單鏈dna。

在所述組合物中，所述引物1、所述引物2和所述探針的摩爾比為1：1：1。

在所述試劑盒中，所述引物1、所述引物2、所述陰性引物和所述探針的摩爾比為1：1：1：1。

所述組合物或所述引物或所述探針在制備所述試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述組合物或所述引物或所述探針或所述試劑盒在制備用于篩查braf基因v600e突變相關(guān)癌癥的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述組合物或所述引物或所述探針或所述試劑盒和記載有“檢測braf基因v600e突變方法”的可讀性載體在制備用于篩查braf基因v600e突變相關(guān)癌癥的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

其中，所述檢測braf基因v600e突變方法，包括如下步驟：用權(quán)利要求1-7中任一所述的組合物或引物或探針或試劑盒對待測樣品進(jìn)行taqman探針熒光定量rt-pcr反應(yīng)。

進(jìn)行所述taqman探針熒光定量rt-pcr反應(yīng)時，反應(yīng)體系中所述引物1和所述引物2的濃度為500nm，所述探針的濃度為500nm。

進(jìn)行所述taqman探針熒光定量rt-pcr反應(yīng)時，反應(yīng)程序中的退火溫度為60℃。具體反應(yīng)程序?yàn)?5℃3min；95℃15s，60℃50s，45個循環(huán)；40℃30s。

本發(fā)明使用熒光定量pcr的方法，設(shè)計特異性的brafv600e檢測引物和探針。相對于免疫組化和高通量測序的檢測方法，熒光定量pcr的方法在保證高靈敏度和高特異性的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)周期更短、成本更低。而特異性的熒光探針相對于普通的pcr，又降低了假陽性，即非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)。針對組織樣本dna和ffpe石蠟切片，本發(fā)明可以進(jìn)行最低50ngdna、突變率最低0.5％的檢測，并且最終的熒光曲線ct值≤36，說明本發(fā)明所提供的引物和探針具有很好的靈敏度。

附圖說明

圖1為使用50ngcfdna，針對36％，10％，5％，1％突變頻率的陽性樣本和陰性樣本的檢測結(jié)果。雖然陰性樣本也有起峰，但可以與1％樣本很好分開。

圖2為使用20ngcfdna，針對10％，5％，1％，0.5％，0.1％突變頻率的陽性樣本和陰性樣本的檢測結(jié)果。雖然陰性樣本也有起峰，但可以與陽性樣本很好分開。

圖3為使用50ngffpe石蠟切片樣本dna，針對5％，1％，0.5％突變頻率的陽性樣本，陰性樣本以及8個正常人樣本的檢測結(jié)果。陰性樣本雖然與正常人樣本存在差異，但可以與陽性樣本很好分開。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、用于檢測braf基因v600e突變的引物和探針的設(shè)計選用

本發(fā)明中用于檢測braf基因v600e突變的引物和探針的設(shè)計原理如下：pcr擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；pcr擴(kuò)增時，taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與pcr產(chǎn)物形成完全同步。如果存在突變，則特異性的引物和探針會與目標(biāo)dna模板結(jié)合，釋放出熒光信號。這個熒光信號被熒光定量pcr儀檢測到并轉(zhuǎn)換為可讀的熒光曲線，再結(jié)合熒光曲線進(jìn)行分析，可知樣本brafv600e的突變情況。

根據(jù)braf基因v600e區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，在研發(fā)初期本發(fā)明的發(fā)明人所在團(tuán)隊曾經(jīng)設(shè)計并試驗(yàn)過一組引物和兩條探針：一條用于檢測v600e突變的探針，一條用于作為陰性對照的探針(即不含有v600e突變)。

正向引物-2：5’-gatccagacaactgttca-3’；

反向引物-2：5’-acacctcagatatatttcttca-3’；

陰性探針-2：cy5-ccatcgagatttcactgtagctagac-bhq2；

突變檢測探針-2：fam-ccatcgagatttctctgtagctagac-bhq1。

使用這組引物探針時，發(fā)現(xiàn)并不能很好的區(qū)分brafv600e突變，在檢測陽性樣本和陰性樣本時，兩條探針都會同等的發(fā)出熒光，雖然熒光曲線和熒光強(qiáng)度有所區(qū)別，但并不能很好的用于brafv600e突變的檢測。

更換思路后，重新設(shè)計檢測引物和探針，將設(shè)計的重點(diǎn)放在了引物的設(shè)計上。一共設(shè)計了三條引物和一條探針，即：

正向引物：5’-gtgattttggtctagctacgga-3’(序列1)；

反向引物：5’-tccacaaaatggatccagac-3’(序列2)；

熒光探針：fam-actgatgggacccactccatcga-bhq1(序列3)；

陰性引物：5’-tcacagtaaaaataggtgattttgg-3’(序列4)。

其中正向引物、反向引物和熒光探針的組合可以用來檢測brafv600e的突變；而陰性引物、反向引物和熒光探針的組合可以用來監(jiān)測brafv600e區(qū)域整體的表達(dá)量，而并非對v600e突變進(jìn)行檢測。這是由于在設(shè)計正向引物時，將引物設(shè)計在v600e突變附近，只有發(fā)生突變才能進(jìn)行正常的pcr反應(yīng)，釋放出熒光。而陰性引物則避開了v600e突變，選擇了沒有發(fā)生突變的區(qū)域，這樣無論樣本是否發(fā)生突變，pcr反應(yīng)都能正常進(jìn)行，釋放出熒光?？梢酝ㄟ^對比正向引物組和陰性引物組擴(kuò)增的熒光曲線來獲悉brafv600e突變的量以及在總dna中的比例。

實(shí)施例2、實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的測試

使用組織樣本和ffpe石蠟切片樣本(ngs檢測brafv600e陽性)所提的dna，以及熒光定量試劑盒kapaprobefastqpcrkits(kapabiosystems，#kk4703)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)體系大小根據(jù)試劑盒推薦確定為20μl。

在實(shí)驗(yàn)環(huán)境和其他條件均相同的情況下，對實(shí)驗(yàn)體系中的正向和反向引物濃度進(jìn)行了優(yōu)化測試，最終確定500nm的終濃度能夠達(dá)到最好的檢測效果。

在實(shí)驗(yàn)環(huán)境和其他條件均相同的情況下，對實(shí)驗(yàn)體系中的熒光探針濃度進(jìn)行了優(yōu)化測試，最終確定500nm的終濃度能夠達(dá)到最好的檢測效果。

最終確定的最佳反應(yīng)體系如表1所示。

實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件在經(jīng)過多次優(yōu)化后，最終確定為：95℃3min；95℃15s，60℃50s，45個循環(huán)；40℃30s。

表1最佳反應(yīng)體系

實(shí)施例3、標(biāo)準(zhǔn)品樣本檢測下限的確定

針對不同類型的標(biāo)準(zhǔn)品樣本(horizinbrafv600ecfdnareferencestandardset和horizonbrafv600effpereferencestandard)，利用標(biāo)準(zhǔn)品陽性樣本和陰性樣本配置不同突變頻率的陽性樣本，然后進(jìn)行檢測下限實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)方法步驟與實(shí)施例2相同。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1、圖2和圖3?？梢?，本發(fā)明可以進(jìn)行最低50ngdna、突變率最低0.5％的檢測，并且最終的熒光曲線ct值≤36。表明本發(fā)明所提供的引物和探針具有很好的靈敏度。

<110>邁基諾（重慶）基因科技有限責(zé)任公司

<120>braf基因v600e突變的熒光定量檢測引物和探針

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