一組用于豬源性實時熒光pcr檢測的特異性引物和探針的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測技術領域，具體設及一組用于豬源性實時巧光PCR檢測的特 異性引物和探針。
【背景技術】
[0002] 隨著人們生活水平的提高及健康意識的增強，人們越來越關屯、食品的真?zhèn)涡?，?品中動物及植物源性成分鑒別成為社會關注的焦點之一，消費者對肉制品和油類質量與安 全性的要求越來越高。目前個別食品行業(yè)充斥著滲假行為，特備是在利益驅動下，將低成本 的豬肉滲入到高成本的牛羊肉中更是一些不法商販慣用的手段，也有不少不法商家將地溝 油按一定比例添加到新鮮使用的植物油中，謀取暴利，危害消費者健康。因此，建立一種可 靠的方法鑒別植物油和牛羊肉中豬源性滲假成分具有重要的實際意義和社會意義。
[0003] 過去用于肉食和油類中物種的鑒別主要依賴于電泳法，免疫法，ELISA等蛋白質分 析法。運些技術對于加工混合肉制品中的豬源性成分卻無法分析出，而PCR技術基于其反應 時間短，具有較高靈敏性、特異性成為鑒別加工食品中物種的優(yōu)先選擇。但傳統(tǒng)的PCR技術 在定量和大批量檢測中局限性較大。因此，急于發(fā)現(xiàn)一種新的技術可W精確地辨別物種并 實現(xiàn)快速、大容量的實時定量檢測，而新興的實時巧光定量PCR技術可W很好的滿足要求， 正廣泛的應用于食品和油脂類豬源性成分的檢測。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明目的在于設計一組豬源性特異性引物和探針序列，建立一種能廣泛應用于 植物油和肉食中豬源性成分檢測的快速、靈敏、特異性好的巧光定量PCR檢測的方法。本發(fā) 明采用基因克隆技術，將豬源性DNA的cytb基因種內保守片段插入到載體PMD18-T中，獲得 含有cytb基因片段的重組質粒，W此作為標準品。根據(jù)豬源性cytb的基因片段編碼基因序 列設計并合成一組特異性引物和探針，優(yōu)化PCR反應條件，建立W實時巧光定量聚合酶鏈反 應為平臺的檢測方法，并對所建立的方法進行評估。
[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供一組用于豬源性實時巧光PCR檢測的特異性引物和探 針，所述特異性引物和探針的核巧酸序列為(1)或(2)中的一種： (1) 、上游引物：5 ' -ACGATTCTTCGCCTTTCACT-3 ' 下游引物：5 ' -GGGGTGTAGTTGTCTGGGTC-3 ' 探針：5 ' -ATTACCGCCCTCGCAGCCGTACA-3 ' 所述引物和探針擴增的目標核巧酸序列為序列表中SEQ ID No.3; (2) 、與（1)所述序列互補的序列。
[0006] 作為優(yōu)選，所述探針的5'端巧光報告基團是FAM，3'端標記的是巧光澤滅基團 TAMRAo
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供豬源性的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒為豬源性的定 性或定量檢測試劑盒;所述試劑盒包括權利要求1所述的引物和探針； 作為優(yōu)選，所述定量檢測試劑盒還包括標準品，所述標準品的制備方法為:將豬源性保 守基因片段插入到載體PMD18-T中，轉化至大腸桿菌中進行誘導表達，獲得含有豬源性保守 基因片段的重組質粒，W此作為標準品；所述豬源性保守基因片段為序列表中SEQ ID No. 2； 作為進一步優(yōu)選，所述豬源性保守基因片段是W序列表中SEQ ID No. 1的核巧酸序列 為模板，使用下述引物進行PCR擴增獲得的： 上游引物:5'- TACGGTCATCACAAATCTACTATC -3' 下游引物：5'- ATATTATGCTTCGTTGTTTGG -3'； 作為優(yōu)選，所述PCR擴增的條件為:94°C預變性5min;94°C 30s、55°C 30s、72°C30s，35 個循環(huán)；72°C lOmin。
[0008] 本發(fā)明的第Ξ個目的是提供特異性引物和探針在制備定性或定量檢測豬源性的 試劑盒中的應用。
[0009] 作為優(yōu)選，所述應用是分別W標準品和待測樣品DNA為模板，利用特異性引物和探 針進行實時巧光定量PCR，通過標準曲線和待測樣品的Ct值判定結果。
[0010] 作為優(yōu)選，所述實時巧光定量PCR的反應條件為:94°C預變性2分鐘，94°C 15秒、 60°C 40s并收集巧光信號，40個循環(huán)。
[0011] 本發(fā)明的第四個目的是提供豬源性的實時巧光定量PCR檢測方法，所述檢測方法 不W有生命的人體或動物體為直接實施對象，步驟如下： (1) 制備標準品：將豬源性保守基因片段插入到載體PMD18-T中，轉化至大腸桿菌中進 行誘導表達，獲得含有豬源性保守基因片段的重組質粒，W此作為標準品;所述豬源性保守 基因片段為序列表中SEQ ID No.2; (2) 使用權利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品和標準品采用相同的反應體 系進行實時巧光PCR擴增； (3) 標準曲線繪制； (4) 通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行豬源性的快速定量檢測。
[0012] 作為優(yōu)選，步驟(1)中所述豬源性保守基因片段是通過W下引物擴增得到的： 上游引物為5 ' -TACGGTCATCACAAATCTACTATC -3 ' ； 下游引物為5 '-ATATTATGCTTCGTTGTTTGG -3 ' ； 作為優(yōu)選，PCR擴增所述豬源性保守基因片段的條件為:94°C預變性5min; 94°C 30s、55 1：3〇3、721：3〇3,35個循環(huán)；72°(：1〇111111; 作為優(yōu)選，步驟(2)中所述引物和探針的用量均為1.化1; 作為優(yōu)選，步驟(2)中所述實時巧光PCR擴增的反應條件為:94°C預變性2分鐘，94°C 15秒、60°C 40s并收集巧光信號，40個循環(huán)。
[0013] 本發(fā)明的第五個目的是提供豬源性的定性PCR檢測方法，所述檢測方法不W有生 命的人體或動物體為直接實施對象，步驟如下： (1) 使用權利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品進行實時巧光PCR擴增； (2) 通過待測樣品的Ct值對豬源性進行定性檢測：當Ct值小于3別寸，為陽性;否則，為陰 性； 作為優(yōu)選，步驟(1)中所述引物和探針的用量均為1.化1; 作為優(yōu)選，步驟（1)中所述實時巧光PCR擴增的反應條件為:94°C預變性2分鐘，94°C 15秒、60°C 40s并收集巧光信號，40個循環(huán)。
[0014] 本發(fā)明提供用于對豬源性進行定性、定量檢測的引物和探針，通過提取待檢測樣 品的DNA結合實時巧光定量PCR檢測技術，可達到準確定量待測肉制品和植物油脂中豬源性 含量的目的。本發(fā)明所提供的引物和探針可對待測肉制品和植物油脂中豬源性含量進行定 性、定量分析，對判斷肉制品和植物油脂中豬源性含量具有重要意義，本發(fā)明將在食品檢測 領域發(fā)揮重要作用。
【附圖說明】
[0015] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為引物和探針體系優(yōu)化實驗結果;其中，a代表引物為1.化1，探針為1.化l;b代表引 物為1.化1，探針為1.6μ1; C代表引物為1.化1，探針為0.祉1; d代表引物為2.化1，探針為0.8 l·U;e代表引物為l.化l，探針為0.祉l;f代表引物為2.化l，探針為1.0μl;g代表引物為l.化 1，探針為0.祉1 ;h代表引物為1.化1，探針為1.化1; i代表引物為2.化1，探針為1.化1; 圖2為靈敏度實驗結果;其中，a代表質粒濃度為1.00 X 108copies/ml、b代表質粒濃度 為1.00 X l〇7copies/ml、c代表質粒濃度為1.00 X l〇6copies/ml、d代表質粒濃度為1.00 X l〇5copies/ml、e代表質粒濃度為 1.00 X l〇4copies/ml、f代表質粒濃度為 1.00 X l〇3copies/ ml、g代表質粒濃度為1.00 X 102copies/ml，h代表陰性對照； 圖3為特異性實驗結果;其中出現(xiàn)標準擴增曲線的為豬，未出現(xiàn)標準擴增曲線的為牛、 羊、狗、魚、雞、鴨、碟、兔、驢、蛙、鼠、陰性對照； 圖4為豬源性標準曲線。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合附圖及具體實施方案對本發(fā)明做更詳細闡述。W下的實施例便于更好地 理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 所用引物、探針和所用序列測定工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和完成。 [0017]實施例1 cy憂基因標準品的制備 要建立實時巧光定量PCR方法，首先必須制備方法所需的外部標準品，標準品應包含高 度保守、特異的序列，要保證反應的高特異性。動物線粒體DNA具有分子量小、結構保守、熱 穩(wěn)定性好、不易降解的結構特點和母系遺傳、拷貝數(shù)多、進化速度快、不發(fā)生重組的遺傳特 點，其中線粒體細胞色素 b(cytb)基因序列最為保守型。cytb基因檢測豬源性，有較高的敏 感性和特異性。本申請主要采用PCR技術擴增豬源性cytb基因，利用基因重組技術將其連接 到質粒載體PMD18-T中，構建出重組質粒PMD18-T- pig巧tb，并進行相應的PCR鑒定和測序 鑒定，最后經(jīng)定量作為待建立方法的標準品，為下一步的方法及評估奠定基礎。
[001引一、模板DNA的制備 提取豬肝臟組織基因組DNA，用作cytb基因 PCR擴增的模板，提取基因組DNA的試劑盒為 細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離屯、柱型），采購自百泰克生物技術有限公司； (1)取1.5g新鮮豬肝臟組織用液氮研磨成粉末，加到5ml離屯、管中，加入4ml SE緩沖液， 混勻，4500 r/mim離屯、15min; (2) 吸取上清，4°C 12000 r/min離屯、20min，棄上清，收集沉淀； (3) 加入40化1 Buffer Digestion,震蕩混勻。65°C水浴1-化至細胞完全裂解（注意： 1、水浴過程中，每10分鐘顛倒混勻一次，可促進樣品裂解?；旌弦鹤兂吻逋该鳛榱呀馔耆?。 如溶液未變澄清，說明細胞裂解不徹底，應當延長水浴時間，否則將可能降低DNA的得率或 導致提取的DNA不純。2、如需得到無 RNA的DNA，