專利名稱：Mgb探針多重?zé)晒舛縫cr檢測大腸桿菌o157的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，特別是一種MGB探針多重?zé)晒舛縋CR檢測大腸桿菌O157的方法。
背景技術(shù)：
大腸桿菌O157是一種致病力很強(qiáng)的腸道致病菌，主要引起人和動物的出血性腸炎、溶血性尿毒綜合征而致較強(qiáng)的死亡率。大腸桿菌O157的感染劑量較低，每克感染載體含菌10個以上即可能引起感染，甚至導(dǎo)致人的死亡。因此，急需建立一種快速、敏感的檢測方法。我國現(xiàn)行食品中檢測O157的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)是采用經(jīng)典的選擇分離培養(yǎng)、生化試驗和血清學(xué)的方法，全過程需4--6天，耗時長、操作繁瑣，不能滿足及時、快速、正確評價食品微生物的安全性要求，養(yǎng)殖和進(jìn)出口企業(yè)的生產(chǎn)需要。
大腸桿菌O157特異性基因的檢測是鑒定大腸桿菌O157的必需指標(biāo)。rfbE基因編碼大腸桿菌O157的特異性表面抗原脂多糖，針對rfbE基因設(shè)計引物，可檢測大腸桿菌O157脂多糖，Desmarchelier等人根據(jù)rfbE基因設(shè)計了一對特異性很高的引物，所有大腸桿菌O157:H7，O157:H7-菌株P(guān)CR反應(yīng)都為陽性，其他任何菌株則為陰性。Vero毒素是大腸桿菌O157的主要毒力因子之一，現(xiàn)已證實VT毒素與溶血性尿毒綜合征相關(guān)。VT有VT1和VT2，VT2對人的腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用比VT1強(qiáng)1000倍，因此將VT2基因作為O157的毒力指標(biāo)。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用實時熒光定量PCR方法快速檢測大腸桿菌O157:H7，詳見(Ken J.Yoshitomi，Karen C.Jinneman，StephenD.Weagant，以uid為靶基因3‘小溝結(jié)合-DNA探針熒光定量PCR快速鑒定大腸桿菌O157:H7的優(yōu)化，[分子和細(xì)胞探針])(Ken J.Yoshitomi，KarenC.Jinneman，StepheD.Weagant，optimization of a 3’-minor groovebinder-DNA probe targeting the uid gene for rapididentification of Escherichiacoli O157:H7 using real-time PCR[J].MOLECULARAND CELLULAR PROBES.2003，17275-280)。此文未能運(yùn)用熒光定量PCR方法來對樣品進(jìn)行定量，另外，以上方法只能單一確定細(xì)菌的血清型，不能檢測出是否含有重要的毒力因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種MGB探針多重?zé)晒舛縋CR檢測大腸桿菌O157的方法。使其所使用MGB探針具有很高的敏感性和特異性，同時，檢測AT含量高的序列更為方便，可同時檢測大腸桿菌O157的兩個特異性基因。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明設(shè)計合成rfbE、vt2引物和Taqman-MGB探針，分別用rfbE、vt2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得兩個目的片斷，將目的片斷分別與PMD 18-T Vector連接，得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取高濃度的重組質(zhì)粒，將此高濃度質(zhì)粒作10倍比稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品共同作二重?zé)晒舛縋CR，標(biāo)準(zhǔn)樣品形成標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待檢樣品中大腸桿菌O157的含量。
此二重?zé)晒舛縋CR方法檢測拷貝數(shù)在100-1010范圍內(nèi)的樣本都具有較好的動力學(xué)范圍，擬合度在0.99以上；在100-1010內(nèi)重復(fù)性好，intra-assayCT值標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)0.07-2.07，變異系數(shù)(CV)0.005-0.06之間，inter-assay CT值標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)0.76-1.21，變異系數(shù)(CV)0.005-0.09；每個反應(yīng)體系能檢測到100個細(xì)菌；具有很強(qiáng)的特異性(十株陽性菌，檢測結(jié)果均為陽性；50株陰性菌，檢測結(jié)果均為陰性)；熒光定量PCR結(jié)果和細(xì)菌計數(shù)結(jié)果能較好的吻合。
MGB探針多重?zé)晒舛縋CR檢測大腸桿菌O157的方法，具體步驟如下①設(shè)計、合成引物和Taqman-MGB探針通過比對幾株大腸桿菌O157rfbE基因和vt2基因的保守區(qū)，找出保守序列，設(shè)計引物和Taqman-MGB探針，rfbE探針用FAM熒光報告基團(tuán)標(biāo)記，vt2探針用ViC熒光報告基團(tuán)標(biāo)記，探針的淬滅基團(tuán)為IFQ(非熒光淬滅基團(tuán))，3‘端連接有MGB分子。
②PCR擴(kuò)增rfbE、vt2基因，獲得目的片斷，PCR產(chǎn)物切膠回收；③構(gòu)建重組質(zhì)粒，將目的片斷和PMD 18-T Vector連接，連接后轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，PCR和EcoRI、PstI酶切鑒定目的片斷是否已插入PMD 18-Tvector。
④二重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的確立通過反復(fù)實驗，確定最優(yōu)化的反應(yīng)體系和循環(huán)條件⑤建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以5個稀釋度的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時，對樣品進(jìn)行處理，處理后提取基因組DNA作二重?zé)晒舛縋CR，根據(jù)熒光定量PCR的結(jié)果，計算原始樣本中大腸桿菌O157的含量。
所述的引物，是指其序列為rfbE-F cta gga ccg cag agg aaa gag arfbE-R ttc cga gta cat tgg cat cgtvt2-F acc aca tcg gtg tct gtt att aac cvt2-R aac gaa ccc ggc cac ata ta所述的Taqman-MGB探針，是指其序列為rfbE-probe att aag gaa tca cct tgc aga tvt2-probe ttt gct caa taa tca gac gaarfbE探針的5′端標(biāo)記FAM熒光報告基團(tuán)，3′端標(biāo)記Taqman-MGB基團(tuán)vt2探針的5′端標(biāo)記ViC熒光報告基團(tuán)，3′端標(biāo)記Taqman-MGB基團(tuán)。
所述的二重?zé)晒舛縋CR，其反應(yīng)體系如下Mastermix 10ul(2*)rfbE-F 1ul(終濃度為0.5uM)rfbE-R 1ul(終濃度為0.5uM)vt2-F 0.8ul(終濃度為0.4uM)vt2-R 0.8ul(終濃度為0.4uM)Probe-rfbE 0.6ul(終濃度為0.3uM)Probe-vt2 0.6ul(終濃度為0.3uM)水 3.2ul模板 2ul。
所述的二重?zé)晒舛縋CR，其反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min94℃變性30s56℃退火30s60℃伸30sPlate readGoto line 2 for 50 cycles。
所述的樣品，待檢時，用堿裂解法提取基因組DNA具體步驟如下取過夜培養(yǎng)的細(xì)菌液3ml，12000rpm，5min；沉淀用567ul的TE(PH 8.0)重懸，加入30ul 10％SDS 和3ul 20mg/ml蛋白酶K，混勻，60℃水浴20min；加入l00ul 5mol/LNacl溶液，充分混勻，再加入80ul CTAB/Nacl溶液，混勻，60℃ 水浴20min；加入780ul酚氯仿，混勻，12000rpm，10min；將上清液移入一個新管中。重復(fù)上一步；取400ul上清至一個新管中；加入400ul氯仿，混勻，12000rpm，10min，吸取上清300ul；加入兩倍體積冰冷的乙醇，混勻，-20℃ 放置30 min，12000rpm，20min，沉淀用70％乙醇洗三次，37℃溫箱干燥，沉淀用100ul水溶解。
在本發(fā)明中，術(shù)語“探針”，是指一種寡核苷酸探針，它設(shè)計為與目的序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光報告基團(tuán)連接在探針的5′端，而淬滅劑則在3′端，當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3′端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5′外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號，所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片斷一樣，有一個同步指數(shù)擴(kuò)增的過程，信號的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。
探針與目標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交保證了擴(kuò)增過程中熒光的特異性，“淬滅”，當(dāng)探針未結(jié)合時，其結(jié)構(gòu)完整，報告基團(tuán)被激發(fā)時產(chǎn)生的熒光能量通過熒光共振能量傳遞，被鄰近的淬滅基團(tuán)所吸收。
Taqman-MGB探針，在探針3′端連接有MGB(Minor Groove Binder)修飾基團(tuán)-二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽(DPI3)，DPI3可折疊進(jìn)入探針末端5-6bp核苷酸形成的小溝內(nèi)，形成極為穩(wěn)定的異源雙鏈。
在本發(fā)明中，“FAM熒光報告基團(tuán)”是指六-羧基熒光素，標(biāo)記在探針5′端，ViC熒光報告基團(tuán)是PE Applied Biosystems專有的熒光染料，標(biāo)記在探針5′端.
在本發(fā)明中，“標(biāo)準(zhǔn)品”是指已知拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒DNA，用分光光度計測定其OD值，當(dāng)OD值在0.3左右時，此時測得的結(jié)果較可信，每管測三次，取平均值，計算重組質(zhì)?？截悢?shù)。
熒光定量PCR定量的依據(jù)。特定的待擴(kuò)增基因起始含量越大，則指數(shù)擴(kuò)增過程越短，當(dāng)擴(kuò)增速率趨于穩(wěn)定后，則無論原來樣品中起始模板含量多少，最終擴(kuò)增片斷的含量是一樣的。理想的擴(kuò)增結(jié)果是Y＝X*2n.其中Y代表擴(kuò)增產(chǎn)物量，X代表PCR反應(yīng)體系中的原始模板數(shù)，n.為擴(kuò)增次數(shù)，理論上PCR擴(kuò)增效率為100％，但實際上，DNA的每一次復(fù)制都不完全，即每一次擴(kuò)增中模板不是呈2的倍數(shù)增長，實際應(yīng)為Y＝X*(1+E)nE代表擴(kuò)增效率，E＝參與復(fù)制的模板/總模板。通常E≤1，通常X在1-105拷貝，循環(huán)次數(shù)n≤30時，E相對穩(wěn)定，原始模板以相對固定的指數(shù)形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數(shù)期。
PCR擴(kuò)增通式Tn＝T0(1+E)n。設(shè)定PCR到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增期時，產(chǎn)生一定的熒光(熒光依賴某一循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的總量，即特定的拷貝數(shù)K，為常數(shù)，大約在1010左右)高于背景為儀器所識別，此時的循環(huán)數(shù)為cp，也就是k＝T0(1+E)cp。取對數(shù)即1gK＝1gT0+cp*lg(1+E)Cp＝-1*1gT0/lg(1+E)+1gK/lg(1+E)對于某特定的PCR而言，E與k均為常數(shù)，故上式為循環(huán)數(shù)(cp)對原始模板拷貝數(shù)對數(shù)(lgT0)一次方程，其標(biāo)準(zhǔn)形式Y(jié)＝kx+b，也是熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
本發(fā)明使用外參照物作定量PCR，以已知濃度的目的基因為模板，按一定的倍比稀釋，然后作出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，未知的樣本按標(biāo)準(zhǔn)曲線找出對應(yīng)的拷貝數(shù)。
熒光閾值通常以10-15個循環(huán)的熒光值作為閾值。
CT值擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)。
本發(fā)明具有更高的敏感性和特異性，能快速、準(zhǔn)確地檢測樣本中的大腸桿菌O157含量，可同時檢測大腸桿菌O157的兩個特異性毒力基因，是一種快速、準(zhǔn)確的大腸桿菌O157檢測方法。本發(fā)明所使用MGB探針進(jìn)行熒光定量PCR，MGB探針是指帶有一個小溝結(jié)合物基團(tuán)的DNA探針，它可與單鏈的靶DNA形成極為穩(wěn)定的異源雙鏈。其優(yōu)越性表現(xiàn)在1.背景熒光低，由于MGB探針報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的距離較近，具有更好的淬滅效果，另外，MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號的強(qiáng)度。2.提高Tm值，平均15bp可提高18℃，這樣可以使探針的長度更短，尤其對AT含量高的序列，且提高配對與非配對模板間的Tm值差異，即提高了特異性，可進(jìn)行多重PCR。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，下列事實例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook分子克隆，或按照廠商所建議的條件。
實施例一1設(shè)計，合成rfbE、vt2引物和探針引物序列是rfbE-F cta gga ccg cag agg aaa gag arfbE-R ttc cga gta cat tgg cat cgtvt2-F acc aca tcg gtg tct gtt att aac cvt2-R aac gaa ccc ggc cac ata taTaqman-MGB探針序列為rfbE-probe att aag gaa tca cct tgc aga tvt2-probe ttt gct caa taa tca gac gaa2 rfbE、vt2基因的克隆根據(jù)設(shè)計的rfbE、vt2引物，分別擴(kuò)增rfbE、vt2目的基因，PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳，再用瓊脂糖凝膠成像分析系統(tǒng)分析，在大約100bp和150bp處有可見目的條帶。從PCR產(chǎn)物中回收目的基因。
3標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備
DH5α感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備從大腸桿菌DH5α平板上挑取一個單菌落接于2ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜；取2ml菌液轉(zhuǎn)接到一個含有30ml LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中，37℃震蕩培養(yǎng)2-3小時，(此時OD600≤0.4-0.5，細(xì)胞數(shù)＜108/ml)；將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，冰上放置30min，使培養(yǎng)物至0℃；4℃4000rpm，10min；棄上清，倒置1min；加500ul預(yù)冷Cacl2 0.1mol/L重懸細(xì)胞，冰上放置30min；4℃4000 rpm，10min；棄上清，倒置1min；用200ul 0.1mol/L Cacl2重懸細(xì)胞，冰上放置30min。
4重組質(zhì)粒的構(gòu)建將PMD 18-T Vector和目的DNA以1∶3的比例連接，16℃ 11小時，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞。將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素(100ug/ml)的培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12-16小時。挑取陽性菌落，于含有氨芐青霉素(100ug/ml)的LB中震蕩培養(yǎng)37℃ 12-16小時。用培養(yǎng)的菌液提取質(zhì)粒，采用PCR和EcR I、pst I酶切鑒定，PCR鑒定結(jié)果100bp和150bp處有可見的目的條帶。酶切鑒定結(jié)果150bp和200bp處有可見的目的條帶。可以確定目的片斷已插入PMD 18-T Vector，將提取的質(zhì)粒作10倍比稀釋，測OD值，取平均值，計算拷貝數(shù)。
實施例二1臨床樣本的預(yù)增菌將1克肉樣剪碎，將1克肉樣剪碎，放入9毫升含新生霉素(20mg/ml)的改良肉湯中，37℃，200rpm，振蕩8 h。
2基因組DNA的提取取振蕩培養(yǎng)的細(xì)菌液3ml，12000rpm，5min；沉淀用567ul的TE(PH 8.0)重懸，加入30ul 10％SDS 和3ul 20mg/ml蛋白酶K，混勻，60℃ 水浴20 min；加入100ul 5mol/LNacl溶液，充分混勻，再加入80ul CTAB/Nacl溶液，混勻，60℃ 水浴20min；加入780ul酚氯仿，混勻，12000rpm，10min；將600ul上清液移入一個新管中。重復(fù)上一步；取400ul上清至一個新管中；加入400ul氯仿，混勻，12000rpm，10min，吸取上清300ul；加入兩倍體積冰冷的乙醇，混勻，-20℃放置30min，12000rpm，20min，沉淀用70％乙醇洗三次，37℃溫箱干燥，沉淀用100ul水溶解，即可得到細(xì)菌基因組DNA.
3 PCR體系的優(yōu)化Mastermix 10ul(2*)rfbE-F 1ul(終濃度為0.5uM)rfbE-R 1ul(終濃度為0.5uM)vt2-F 0.8ul(終濃度為0.4uM)vt2-R 0.8ul(終濃度為0.4uM)Probe-rfbE 0.6ul(終濃度為0.3uM)Probe-vt2 0.6ul(終濃度為0.3uM)水 3.2ul模板 2ul4最佳的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min94℃變性30s56℃退火30s60℃延伸30sPlate readGoto line 2 for 50 cycles.
5根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果，計算細(xì)菌原液的濃度-X(copies/ul)根據(jù)基因組提取以及熒光定量PCR的過程，可推導(dǎo)出以下公式(X*3000*300/780)/100＝熒光定量PCR結(jié)果(copies/2ul)即X＝(熒光定量PCR結(jié)果)*78/1800注公式的說明3000，是指基因組提取過程中，取振蕩培養(yǎng)的細(xì)菌液3ml，即3000ul。
300，是指基因組提取過程中，吸取上清300ul。
780，是指基因組提取過程中，(567ul的TE，30ul 10％SDS，3ul 20mg/ml蛋白酶K，100ul 5 mol/Lnacl，80 ul CTAB/Nacl，體積一共是780ul)100，是指基因組提取過程中，沉淀用100ul水溶解。熒光定量PCR結(jié)果，熒光定量PCR儀會自動顯示樣品的濃度，單位是copies/2ul。
權(quán)利要求
1.一種MGB探針多重?zé)晒舛縋CR檢測大腸桿菌0157的方法，其特征在于，設(shè)計合成rfbE、vt2引物和Taqman-MGB探針，分別用rfbE、vt2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得兩個目的片斷，將目的片斷分別與PMD 18-T Vector連接，得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取高濃度的重組質(zhì)粒，將此高濃度質(zhì)粒作10倍比稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品共同作二重?zé)晒舛縋CR，標(biāo)準(zhǔn)樣品形成標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待檢樣品中大腸桿菌0157的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MGB探針多重?zé)晒舛縋CR檢測大腸桿菌0157的方法，其特征是，具體步驟如下①設(shè)計、合成引物和Taqman-MGB探針；②PCR擴(kuò)增rfbE、vt2基因，獲得目的片斷，PCR產(chǎn)物切膠回收；③構(gòu)建重組質(zhì)粒，將目的片斷和PMD 18-T Vector連接，連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，PCR和EcoR I、Pst I酶切鑒定目的片斷是否已插入PMD 18-Tvector；④二重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的確立；⑤建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以5個稀釋度的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；同時，對樣品進(jìn)行處理，處理后提取基因組DNA作二重?zé)晒舛縋CR，根據(jù)熒光定量PCR的結(jié)果，計算原始樣本中大腸桿菌0157的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的MGB探針多重?zé)晒舛縋CR檢測大腸桿菌0157的方法，其特征是，所述的引物，是指其序列為rfbE-F cta gga ccg cag agg aaa gag arfbE-R ttc cga gta cat tgg cat cgtvt2-F acc aca tcg gtg tct gtt att aac cvt2-R aac gaa ccc ggc cac ata ta。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的MGB探針多重?zé)晒舛縋CR檢測大腸桿菌0157的方法，其特征是，所述的Taqman-MGB探針，是指其序列為rfbE-probe att aag gaa tca cct tgc aga tvt2-probe ttt gct caa taa tca gac gaarfbE探針的5′端標(biāo)記FAM熒光報告基團(tuán)，3′端標(biāo)記Taqman-MGB基團(tuán)vt2探針的5′端標(biāo)記ViC熒光報告基團(tuán)，3′端標(biāo)記Taqman-MGB基團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的MGB探針多重?zé)晒舛縋CR檢測大腸桿菌0157的方法，其特征是，所述的二重?zé)晒舛縋CR，其反應(yīng)體系如下Mastermix 10ul(2*)rfbE-F 濃度為0.5uMrfbE-R 濃度為0.5uMvt2-F 濃度為0.4uMvt2-R 濃度為0.4uMProbe-rfbE 濃度為0.3uMProbe-vt2 濃度為0.3uM水 3.2 ul模板2ul。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的MGB探針多重?zé)晒舛縋CR檢測大腸桿菌0157的方法，其特征是，所述的二重?zé)晒舛縋CR，其反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min94℃變性30s56℃退火30s60℃延伸30sPlate readGoto line 2 for 50 cycles。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的MGB探針多重?zé)晒舛縋CR檢測大腸桿菌0157的方法，其特征是，所述的樣品，待檢時，用堿裂解法提取基因組DNA具體步驟如下取過夜培養(yǎng)的細(xì)菌液3ml，12000rpm，5min；沉淀用567ul的TE(PH 8.0)重懸，加入30ul 10％SDS和3ul 20mg/ml蛋白酶K，混勻，60℃ 水浴20min；加入100ul 5mol/LNacl溶液，充分混勻，再加入80ul CTAB/Nacl溶液，混勻，60℃ 水浴20min；加入780ul酚∶氯仿，混勻，12000rpm，10min；將上清液移入一個新管中。重復(fù)上一步；取400ul上清至一個新管中；加入400ul氯仿，混勻，12000rpm，10min，吸取上清300ul；加入兩倍體積冰冷的乙醇，混勻，-20℃ 放置30min，12000rpm，20min，沉淀用70％乙醇洗三次，37℃ 溫箱干燥，沉淀用100ul水溶解。
全文摘要
一種MGB探針多重?zé)晒舛縋CR檢測大腸桿菌O157的方法，構(gòu)建重組質(zhì)粒，設(shè)計合成引物和Taqman－MGB探針，進(jìn)行二重?zé)晒舛縋CR，將大腸桿菌O157的rfbE、vt2的一段保守序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的片斷，再將目的片斷與PMD 18－T Vector連接，得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得高濃度的質(zhì)粒，將此高濃度質(zhì)粒作10倍比稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品共同作二重?zé)晒舛縋CR，標(biāo)準(zhǔn)樣品形成標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計算出待檢樣品中大腸桿菌O157的含量。本發(fā)明使用MGB探針，具有更高的敏感性和特異性，能快速、準(zhǔn)確地檢測樣本中的大腸桿菌O157含量，可同時檢測大腸桿菌O157的兩個特異性毒力基因，是一種快速、準(zhǔn)確的大腸桿菌O157檢測方法。
文檔編號C12Q1/10GK1952647SQ20061002832
公開日2007年4月25日 申請日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者嚴(yán)亞賢, 朱向玲, 孫建和, 陸承平 申請人:上海交通大學(xué)