基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒及其檢測方法，涉及microRNA。試劑盒設(shè)有盒體、隔板、miRNA提取試劑瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶。提取樣本中miRNA，若為血清/血漿或其他體液樣本，在200μL樣本裂解后加入試劑盒提供的濃度為5n?mol的外源性參照cel-miR-39?5μL，漩渦震蕩15s；若為細胞或組織樣本，則無需加入外源性參照cel-miR-39；應(yīng)用試劑盒提供的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；應(yīng)用試劑盒提供的實時熒光定量PCR試劑將cDNA進行實時熒光定量PCR擴增；綜合各項數(shù)據(jù)，設(shè)定合理閾值和基線，進行分析。
【專利說明】基于Al IG1探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及microRNA，尤其是涉及一種基于AllGl0探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]MicroRNA (miRNA)是一類廣泛存在于真核細胞中的長約22個核苷酸的非編碼RNA分子，參與了在生物體中許多生理病理過程，通過調(diào)芐基因表達，在細胞增殖、凋亡、生長發(fā)育、細胞分化、代謝等過程中發(fā)揮重要作用。具體表現(xiàn)為miRNA在細胞核內(nèi)經(jīng)過形成最初的初級轉(zhuǎn)錄本pr1-miRNA到pre_miRNA,后轉(zhuǎn)運出細胞核,通過剪切形成成熟miRNA,通過與Ago蛋白等形成RISC (RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)，部分抑制或降解靶mRNA序列，參與基因表達調(diào)控(Bartel DP.MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function [J].Cell, 2004，116(2):281-297)。
[0003]由于miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后判斷以及許多其他疾病狀態(tài)下扮演著重要角色，精確檢測其表達情況對于研究miRNA的作用具有重大意義，目前檢測miRNA的方法主要有northern blot技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)、原位雜交技術(shù)、微陣列芯片技術(shù)等。其中northern blot技術(shù)是RNA檢測的早期手段之一，但其特異性和敏感性低，如果樣本RNA含量低或存在降解，可能檢 測不到；原位雜交技術(shù)用于檢測組織和細胞水平miRNA的分布情況，同時對miRNA進行半定量檢測，其不足之處在于不能準(zhǔn)確檢測到低表達的miRNA ;微陣列芯片技術(shù)是一種高通量的檢測技術(shù)，能同時檢測一種或多種樣本的大量的miRNA，但存在芯片制作費時、費力、標(biāo)記成本高、檢測靈敏度與特異性低等問題。
[0004]實時熒光定量技術(shù)(RT-qPCR)是目前最普遍用于基因表達檢測的技術(shù)之一，具有簡便快速、敏感性高和特異性好等特點。目前用于檢測miRNA的實時熒光定量PCR方法包括RNA逆轉(zhuǎn)錄和下游的熒光定量PCR兩部分，其中逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)反轉(zhuǎn)錄引物的不同分為兩種:同聚物加尾法和莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法；熒光定量PCR的檢測分為染料法和探針法，其中目前檢測miRNA的探針多為Taqman-MGB探針(一種適合于擴增短片段的熒光探針)。由于成熟的miRNA具有片段短小的特點，要特異的檢測，探針法更有優(yōu)勢，在敏感性和特異性上優(yōu)于染料法?；谇o環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物能特異識別，擴增成熟的miRNA序列，而miRNA的前體并未被擴增，Taqman-MGB探針檢測miRNA的缺點在于合成價格貴,不利于推廣。
[0005]目前AllGl0探針已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測皰疹病毒、乙型肝炎病毒基因突變(Feng, Z.L.Yuj X.Y.Lu，Z.M.Gengj D.Y.Zhang, L.Chen, S.J.Rapid detection of thehepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo? probes [J].Clin Chim Acta, 2011,412 (11-12): 1018-1021)、侵襲性曲霉菌病(Wuj D.S.Shenj J.Z.Zhou, X.Q.Shenj S.F.Wuj X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AlIGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke ZaZhij 2010，49 (2): 142-145)、K-ras基因突變、強直性脊柱炎等檢測。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有檢測miRNA方法中使用的試劑盒和檢測方法存在的上述缺陷，本發(fā)明的第一個目的在于提供檢測miRNA的特異引物。
[0007]本發(fā)明的第二個目在于提供基于AllGl0探針熒光定量PCR的miRNA檢測試劑盒。
[0008]本發(fā)明的第三個目的在于提供一種基于AllGl0探針熒光定量PCR的miRNA檢測方法。
[0009]所述檢測miRNA的特異引物包括特異的逆轉(zhuǎn)錄引物和特異的正向引物；
[0010]所述特異的逆轉(zhuǎn)錄引物是指在核苷酸序列為SEQ ID N0.1 5; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC5 ;-末端加上與 miRNA 序列 3 '端 8 個反向互補的
喊基;
[0011 ] 所述特異的正向引物是指在miRNA的堿基序列去掉3 ^端8個堿基，同時在5 ’端加上6個堿基序列，其核苷酸序列為SEQ ID N0.2 5 ^ -TCCCTC-3 ’。
[0012]所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒設(shè)有盒體、隔板、miRNA提取試劑瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶；隔板設(shè)在盒體內(nèi)，miRNA提取試劑瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上，miRNA提取試劑瓶內(nèi)裝有miRNA提取試劑，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶內(nèi)裝有莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑，實時熒光定量PCR試劑瓶內(nèi)裝有實時熒光定量PCR試 劑。
[0013]所述miRNA提取試劑包括外源性參照celniR-39 (外源性參照celniR-39是一種線蟲類microRNA,作為一種外源性miRNA,作用在于能夠從提取microRNA開始監(jiān)測整個實時熒光定量PCR的全過程)，其工作濃度為5n mol ;所述cel-miR-39的核苷酸序列為SEQID N0.3 5 ; -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3 ;。
[0014]所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑包括以下組份:200單位/ μ L的MMLV酶、IOm mo I dNTP混合液、5XRT 緩沖液(5XRT 緩沖液由 250m mol Tris-HCl, 375m mol KCl, 15m mol MgCl2, 50mmol DTT組成)、40單位/ μ L的RNA酶抑制劑、10m mol的MgCl2U μ mol的特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物、miRNA標(biāo)準(zhǔn)品(這里的miRNA標(biāo)準(zhǔn)品是指人工合成的miRNA，濃度為IOOn mol)。所述特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物是指在核苷酸序列為SEQ ID N0.1 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC-5 ;末端加上與 miRNA 序列 3 '端 8 個反向互補的喊基。
[0015]所述實時熒光定量PCR試劑包括以下組份:10XTaq緩沖液(IOXTaq緩沖液包括 100m mol Tris-HCl, 500m mol KCl)> 10m mol 的 MgCl2、5 單位 / μ L 的 Taq 聚合酶、IOmMdNTP混合液、100ml無核酶水、10 μ mol特異正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探針。所述特異正向引物為在miRNA的堿基序列去掉端8個堿基，同時在5 ^端加上6個堿基序列，其核苷酸序列為SEQ ID N0.2 5 ; -TCCCTC-3 ;;所述通用反向引物為SEQ IDN0.4 5 ; -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;;所述 AllGlo 探針，其核苷酸序列為 SEQ ID N0.5MAR-CACTGGATACGACGCTGCCG-MAR(MAR 為 AllGlo 探針的一種熒光素)。
[0016]所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測方法，包括以下步驟:
[0017]I)采用常規(guī)方法提取樣本中miRNA，如果為血清/血漿或其他體液樣本，在200 μ L樣本充分裂解后加入基于AllGl0探針熒光定量PCR的miRNA檢測試劑盒提供的濃度為5nmol的外源性參照cel-miR-39 5 μ L，立即漩渦震蕩15s ;若為細胞或組織樣本，則無需加入外源性參照cel-miR-39 ；
[0018]2)應(yīng)用基于AllGlo探針熒光定量PCR的miRNA檢測試劑盒提供的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;
[0019]3)應(yīng)用基于AllGl0探針熒光定量PCR的miRNA檢測試劑盒提供的實時熒光定量PCR試劑將cDNA進行實時熒光定量PCR擴增；
[0020]4)綜合分析儀器給出的各項數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的閾值(Threshold)和基線(Baseline),進行結(jié)果分析。
[0021]所述AllGlo 探針可米用美國 AlleLogic Biosciences Corporation 公司的突光定量探針，它擁有普通Taqman, Taqman-MGB及分子信標(biāo)(molecular beacon)探針?biāo)袃?yōu)點，去掉了目前這幾種探針的最大弊端，它打破了傳統(tǒng)Taqman —端報告基團一端淬滅基團的限制，利用了美國AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的幾種常見波長的特制熒光染料，標(biāo)記在寡核苷酸上面互為報告基團和粹滅基團，而且上面含有特殊的可以提高Tm值(退火溫度)的化學(xué)基團，提高探針特異性，雜交特異性大大提高，在雜交水解之后兩端標(biāo)記的染料又全部變?yōu)閳蟾婊鶊F，提高熒光增量。
[0022]所述AllGl0探針具有以下優(yōu)勢:①提高Tm值(可達10°C以上)，探針更短可以達到15~16個堿基，可以適用A，T含量比較高的序列設(shè)計探針；②加大了多重?zé)晒舛康倪x擇，因為每種染料即是報告基團又是淬滅基團，打破傳統(tǒng)Taqman探針因波長原因標(biāo)記選擇困難，不受淬滅基團波長限制；③大大提高信噪比，無背景信號，空間距離近，更好的淬滅效果；④成本較低，價格僅相當(dāng)于Taqman-MGB探針的一半，具有MGB探針?biāo)袃?yōu)勢。
[0023]本發(fā)明采用了 AllG`l0探針技術(shù)，設(shè)計了特異的正向引物和通用的反向引物及探針，探針兩端只需標(biāo)記一種特殊熒光基團MAR,能夠達到同時檢測多種miRNA的能力，大大節(jié)省成本，并對該技術(shù)反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立了一種基于AllGlo探針技術(shù)聯(lián)合實時熒光定量PCR技術(shù)同時檢測多種miRNA的方法，應(yīng)用前景廣闊。
[0024]本發(fā)明采用了 AllGl0探針技術(shù)，建立了能檢測miRNA的實時熒光定量PCR的方法，與taqman-MGB探針法相比，線性范圍均能達到7個數(shù)量級。本發(fā)明建立的實時熒光定量PCR靈敏度最低可達10拷貝/yL，最高可達IO7拷貝/yL。
[0025]本發(fā)明提供一種基于AllGlo探針檢測microRNA的方法及相關(guān)的試劑盒的組成，通過設(shè)計microRNA的引物和探針，來達到精確定量檢測目的，相較目前的檢測手段，其優(yōu)勢在于:①AllGlo探針合成成本和難度較Taqman-MGB低，利于推廣AllGlo探針本身具有兩個相同的熒光基團，既互為報告基團，又互為淬滅基團，產(chǎn)生的熒光信號比其他探針更強，靈敏更高探針本身設(shè)計的幾種基團之間不存在相互的熒光干擾，適合進行多重PCR反應(yīng)；④探針濃度的增高并不會抑制熒光定量PCR 同時檢測多種microRNA，相較目前普遍的單管單個microRNA的熒光定量PCR檢測更能節(jié)省樣本。
[0026]本發(fā)明的有益效果如下:
[0027]本發(fā)明提供了一種檢測miRNA基于AllGlo探針RT-qPCR的檢測方法和試劑盒，其特異性和敏感性高，可快速準(zhǔn)確檢測樣本中miRNA的含量，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)勢:
[0028]1.與northern blot，miRNA芯片相比，AllGlo探針檢測的特異性和敏感性均要高，價格比microRNA芯片要便宜；[0029]2.與taqman-MGB探針相比，AllGl0探針采用相同的熒光基團，互為報告基團和淬滅基團，一方面釋放的熒光信號更強，另一方面本底信號更低；而且合成程序簡單，價格僅相當(dāng)于taqman-MGB的一半。
[0030]3.本發(fā)明建立了基于AllGlo探針的RT-qPCR檢測miRNA方法，適合于做為芯片篩選miRNA的的后期臨床樣本驗證，以及研究miRNA在不同領(lǐng)域的差異性表達等，推動了miRNA在相關(guān)疾病的深入研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為本發(fā)明實施例基于AllGl0探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)組成示意圖。
[0032]圖2為AllGlo探針法檢測hsa-miR_133b (人源性miR_133b)標(biāo)準(zhǔn)品的擴增曲線圖。
[0033]圖3為AllGlo探針法檢測hsa-miR_133b (人源性miR_133b)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0034]圖4為AllGlo探針法檢測hsa-miR-504 (人源性miR-504)標(biāo)準(zhǔn)品的擴增曲線圖。
[0035]圖5 為AllGlo探針法檢測hsa-miR-504 (人源性miR-504)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實施方式】
[0036]實施例1
[0037]參見圖1，本發(fā)明所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒實施例設(shè)有盒體1、隔板2、miRNA提取試劑瓶3、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶4、實時熒光定量PCR試劑瓶5 ;隔板2設(shè)在盒體I內(nèi)，miRNA提取試劑瓶3、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶4、實時熒光定量PCR試劑瓶5插在隔板2上，miRNA提取試劑瓶3內(nèi)裝有miRNA提取試劑，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶4內(nèi)裝有莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑，實時熒光定量PCR試劑瓶5內(nèi)裝有實時熒光定量PCR試劑。
[0038]①miRNA提取試劑包括外源性參照celniR-39 (外源性參照celniR-39是一種線蟲類microRNA,作為一種外源性miRNA,作用在于能夠從提取microRNA開始監(jiān)測整個實時熒光定量PCR的全過程)，其工作濃度為5n mo I;
[0039]②莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑包括以下組份:200單位/ μ L的MMLV酶、IOm moIdNTP混合液、5XRT 緩沖液(5XRT 緩沖液由 250m mo I Tris-HCl，375m mo I KCl, 15m mo I MgCl2, 50m mo IDTT組成)、40單位/ μ L的RNA酶抑制劑、IOm mo I的MgCl2U μ mo I的特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物、miRNA標(biāo)準(zhǔn)品(這里的miRNA標(biāo)準(zhǔn)品是指人工合成的miRNA，濃度為IOOn mol);
[0040]③實時熒光定量PCR試劑包括以下組份:10XTaq緩沖液(IOXTaq緩沖液包括IOOm molTris-HCl,500m mol KCDUOm mol 的MgCl2、5 單位/ μ L 的Taq聚合酶、IOmM dNTP混合液、100ml無核酶水、10 μ mol特異正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探針。
[0041]實施例2
[0042]本發(fā)明的具體操作步驟及反應(yīng)體系如下:
[0043]1.提取 miRNA
[0044]采用天根生物科技有限公司的生產(chǎn)的miRNA提取試劑盒，按照操作說明書進行樣本(組織，血漿，細胞)miRNA提取，其中200 μ L血清/血漿在加入等體積裂解液劇烈震蕩靜置5min后加入外源參照celniR-39 5 μ L(工作濃度為5n mol),后按照說明書操作進行，最后用30 μ L的去核酶水溶解RNA，于核酸分光光度儀器Nano Drop2000上分別測定濃度和純度，取2~20ng的已提取的miRNA用于下游的逆轉(zhuǎn)錄,其余的miRNA均于_80°C凍存。
[0045]2.miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄:
[0046]2.1將逆轉(zhuǎn)錄所需成分于室溫下溶解，震蕩混勻后置于冰上。
[0047]2.2配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液，按表1進行配制。
[0048]表1
[0049]
【權(quán)利要求】
1.檢測miRNA的特異引物，其特征在于包括特異的逆轉(zhuǎn)錄引物和特異的正向引物； 所述特異的逆轉(zhuǎn)錄引物是指在核苷酸序列為SEQ ID N0.1 5 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC5 ;-末端加上與miRNA序列3 '端8個反向互補的堿基； 所述特異的正向引物是指在miRNA的堿基序列去掉3 ,端8個堿基，同時在5丨端加上6個堿基序列，其核苷酸序列為SEQ ID N0.2 5 ^ -TCCCTC-3 '。
2.基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒，其特征在于設(shè)有盒體、隔板、miRNA提取試劑瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶；隔板設(shè)在盒體內(nèi)，miRNA提取試劑瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實時熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上，miRNA提取試劑瓶內(nèi)裝有miRNA提取試劑，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶內(nèi)裝有莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑，實時熒光定量PCR試劑瓶內(nèi)裝有實時熒光定量PCR試劑。
3.如權(quán)利要求2所述基于AlIGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒，其特征在于所述miRNA提取試劑包括外源性參照cel-miR-39，其工作濃度為5n mol ;所述cel-miR-39 的核苷酸序列為 SEQ ID N0.3 5 ; -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3 ;。
4.如權(quán)利要求2所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒，其特征在于所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑包括以下組份:200單位/ μ L的MMLV酶、IOm mo I dNTP混合液、5 X RT緩沖液、40單位/ μ L的RNA酶抑制劑、IOm mol的MgCl2、I μ mol的特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物、miRNA標(biāo)準(zhǔn)品,濃度為IOOn mol ；
所述特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物是指在核苷酸序列為SEQ ID N0.1 5' -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC-5 ;末端加上與 miRNA 序列 3 ^ 端 8 個反向互補的堿基；所述 5XRT 緩沖液由 250m mol Tris-HCl, 375m mol KCl, 15m mol MgCl2, 50m molDTT組成。
5.如權(quán)利要求2所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的microRNA檢測試劑盒，其特征在于所述實時熒光定量PCR試劑包括以下組份:10XTaq緩沖液、10m mol的MgCl2、5單位/μ L的Taq聚合酶、IOmM dNTP混合液、100ml無核酶水、10 μ mol特異正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探針；所述特異正向引物為在miRNA的堿基序列去掉3 ’端8個堿基，同時在5 ’端加上6個堿基序列，其核苷酸序列為SEQ ID N0.2 5 ; -TCCCTC-3 ’ ;所述通用反向引物為SEQ ID N0.4 5 ; -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;;所述AllGlo探針，其核苷酸序列為 SEQ ID N0.5MAR-CACTGGATACGACGCTGCCG-MAR ;所述 IOXTaq 緩沖液包括 IOOmmol Tris-HCl,500m mol KCl。
6.基于AllGlo探針熒光定量PCR的microRNA檢測方法，其特征在于包括以下步驟: 1)采用常規(guī)方法提取樣本中miRNA，若為血清/血漿或其他體液樣本，則在200μ L樣本充分裂解后加入基于AllGl0探針熒光定量PCR的miRNA檢測試劑盒提供的濃度為5n mol的外源性參照cel-miR-39 5 μ L，立即漩渦震蕩15s ;若為細胞或組織樣本，則無需加入外源性參照cel-miR-39 ； 2)應(yīng)用基于AllGl0探針熒光定量PCR的miRNA檢測試劑盒提供的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA; 3)應(yīng)用基于AllGl0探針熒光定量PCR的miRNA檢測試劑盒提供的實時熒光定量PCR試劑將cDNA進行實時熒光定量PCR擴增； 4)綜合分析儀器給出的各項數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的閾值和基線，進行結(jié)果分析。
7.如權(quán)利要求6所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的miciORNA檢測方法，其特征在于所述AllGlo探針釆用美 國AlleLogic Biosciences Corporation公司的焚光定量探針。
【文檔編號】C12N15/11GK103757126SQ201410041348
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】張忠英, 唐晶 申請人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院