一套鑒定甘蔗上三種短體線蟲的實時熒光定量pcr引物和探針及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一套鑒定甘蔗上三種短體線蟲的實時熒光定量PCR引物和探針及其試劑盒。包括三組引物和探針，分別為引物組qYF2/qYR2和探針qYP，引物組qNF/qNR和探針qNP，引物組qBF2/qBR1和探針qBP；其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1～9所示；所述三種短體線蟲為玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲。利用上述引物組和探針及其試劑盒不僅能夠非常特異性地鑒定區(qū)分出玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲，還能夠進行定量檢測，有效克服了這三種短體線蟲在形態(tài)學(xué)上難以區(qū)分、檢測工作量大、成本高的缺點，檢測靈敏度可達到0.01條線蟲，對實際檢測工作有重要的推進意義。
【專利說明】
-套鑒定甘薦上H種短體線蟲的實時黃光定量PCR引物和探 針及其試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物病原檢測技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，設(shè)及一套鑒定甘薦上=種短體線 蟲的實時巧光定量PCR引物和探針及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 短體線蟲，也稱為根腐線蟲，是一種重要的遷移性內(nèi)寄生線蟲，該類線蟲由70多個 有效種組成。短體線蟲在植物根內(nèi)移動、穿刺和取食引起根組織形成壞死斑、空腔進而使根 組織壞死。由于植株根部壞死，被短體線蟲危害的植物會表現(xiàn)出缺水和營養(yǎng)不足的癥狀，短 體線蟲是造成經(jīng)濟損失最大的=種植物線蟲之一。
[0003] 玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲是=種較常見的短體線蟲，運 =種短體線蟲均可危害甘薦，而且會復(fù)合侵染。另外運=種短體線蟲不單分布廣泛，而且寄 主也較廣，除侵染甘薦外，還可W侵染其它重要的農(nóng)作物，如玉米。只有正確鑒定和預(yù)測運 =種線蟲在田間的蟲口數(shù)量，才能在實際工作中制定合理的防治措施W此避免更大的經(jīng)濟 損失，因此，正確、精確地鑒定、統(tǒng)計出=種短體線蟲的侵染情況和侵染量，對于實際工作具 有重要的意義。
[0004] 然而，目前對短體線蟲的鑒定主要是依據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的方法，而根據(jù)形態(tài)將短體 線蟲鑒定到種是一個復(fù)雜而費時的工作。特別是對于玉米短體線蟲和擬玉米短體線蟲，它 們形態(tài)上極為相似，可用于區(qū)分的特征很少，而且在甘薦地里會混合出現(xiàn)，運就需要鑒定人 員有非常豐富的形態(tài)鑒定經(jīng)驗。此外，形態(tài)學(xué)的鑒定方法只能準確地鑒定短體線蟲的成熟 雌蟲，但是在田間調(diào)查的時候，常常是大量的線蟲處于幼蟲階段，要通過形態(tài)學(xué)方法準確地 鑒定運些短體線蟲幼蟲，幾乎是不可能的，因此，在實際的工作中，精確準確地區(qū)分玉米短 體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲運=種線蟲，W評價=種線蟲的侵染情況，是很 困難的。
[0005] 目前，國內(nèi)外還未見有通過實時巧光定量PCR方法定性檢測（鑒定)和定量甘薦上 運=種短體線蟲的報道。由于玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲侵染甘薦 的根部，嚴重的影響甘薦的產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，為避免更大的經(jīng)濟損失，亟需一種能夠高效、 準確鑒定運=種短體線蟲的分子生物學(xué)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短 體線蟲鑒定檢測技術(shù)的不足，尤其是難W區(qū)分=者的缺陷，提供更加精準、高效、特異性好、 靈敏性高的定量檢測玉米短體線蟲zeae)、擬玉米短體線蟲(P. jOarazeae) 和最短尾短體線蟲(的實時巧光定量PCR方法和檢測體系。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一套鑒定甘薦上S種短體線蟲的實時巧光定量PCR引物和探 針。
[0008] 本發(fā)明另一目的是提供一種鑒定甘薦上S種短體線蟲的實時巧光定量PCR檢測試 劑盒。
[0009] 本發(fā)明上述目的通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)： 一套鑒定甘薦上S種短體線蟲的實時巧光定量PCR引物和探針，包括S組引物和探針， 分別為引物組qYF2/qYR2和探針qYP，引物組qNF/qNR和探針qNP，引物組qBF2/qBRl和探針 姐P;其核巧酸序列分別如SEQ ID NO. 1~9所示。
[0010] 優(yōu)選地，所述探針qYP、探針qNP和探針姐P的5'端均標記有FAM巧光基團，3'端均 標記有E化巧光基團。
[0011] 所述=種短體線蟲為玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲。
[0012] 上述鑒定甘薦上S種短體線蟲的實時巧光定量PCR引物和探針在鑒定、檢測和/或 定量檢測玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲方面的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保 護范圍之內(nèi)。
[0013] 在應(yīng)用時，當需要檢測、鑒定某一樣品中含有玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最 短尾短體線蟲中的哪一種及其含量時，同時使用所述的=套引物和探針分別W待測樣品 DNA為模板進行PCR鑒定，當引物組qYF2/qYR2和探針qYP的檢測結(jié)果為特異性陽性時，則表 明該樣品含有玉米短體線蟲；當引物組qNF/qNR和探針qNP的檢測結(jié)果為特異性陽性時，貝U 表明該樣品含有擬玉米短體線蟲；當引物組qBF2/姐R1和探針姐P的檢測結(jié)果為特異性陽性 時，則表明該樣品含有最短尾短體線蟲。
[0014] 所述引物組qYF2/qYR2和引物組qNF/qNR的退火溫度為60°C，所述引物組qBF2/ 姐R1的退火溫度為55°C。
[0015] 本發(fā)明還W上述引物組和探針建立了鑒定、定量檢測玉米短體線蟲、擬玉米短體 線蟲和最短尾短體線蟲的實時巧光定量PCR方法：W待測樣品DNA為模板，分別利用引物組 qYF2/qYR2和探針qYP、引物組qNF/qNR和探針qNP、引物組qBF2/qBRl和探針姐P進行實時巧 光定量PCR，根據(jù)PCR結(jié)果判斷樣品中含有短體線蟲的種類并統(tǒng)計含量。
[0016] 所述實時巧光定量PCR的反應(yīng)體系為:2化DNA，上、下游引物各0.4化（10 yM)， 探針0.4 yL (10 yM)，10 yL實時巧光定量PCR預(yù)混試劑和余量dd出0,共20化。
[0017] 其中，所述實時巧光定量PCR預(yù)混試劑包括實時巧光定量PCR反應(yīng)所需要的DNA聚 合酶，緩沖液和dNTP。
[001引利用引物組qYF2/qYR2和引物組qNF/qNR進行PCR時的反應(yīng)程序為:預(yù)變性95°C 30 s;95°C 5 S，退火溫度60°C 35 S，共40循環(huán)； 利用所述引物組姐F2/qBRl進行PCR時的反應(yīng)程序為:預(yù)變性95°C 30 s;95°C 5 S，退 火溫度55 °C 35 S和72 °C 30 S，共40循環(huán)。
[0019] 另外，上述鑒定甘薦上S種短體線蟲的實時巧光定量PCR引物和探針在制備鑒定、 檢測和/或定量檢測玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲的試劑盒方面的應(yīng) 用，也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0020] -種鑒定甘薦上S種短體線蟲的實時巧光定量PCR檢測試劑盒，包含上述的引物 組qYF2/qYR2和探針qYP，引物組qNF/qNR和探針qNP，W及引物組姐F2/姐R1和探針姐P;所述 =種短體線蟲為玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲。
[0021 ]優(yōu)選地，所述試劑盒還包括實時巧光定量PCR反應(yīng)所需要的DNA聚合酶、緩沖液和 dNTPo
[0022] 優(yōu)選地，使用該試劑盒時，PCR反應(yīng)體系按照如下比例進行:每20化體系中，分別 加入2化DNA，上下游引物各0.4化（10礎(chǔ)）、探針0.4化（10礎(chǔ)）、10化實時巧光定量 PCR預(yù)混試劑和余量dd此0;其中，所述實時巧光定量PCR預(yù)混試劑包括實時巧光定量PCR反 應(yīng)所需要的DNA聚合酶，緩沖液和dNTP。
[0023] 優(yōu)選地，使用該試劑盒時，利用引物組qYF2/qYR2和引物組qNF/qNR進行PCR時的反 應(yīng)程序為:預(yù)變性95°C 30 s;95°C 5 S，退火溫度60°C 35 S，共40循環(huán);利用所述引物組 qBF2/姐R1進行PCR時的反應(yīng)程序為:預(yù)變性95°C 30 s;95°C 5 S，退火溫度55°C 35 S和72 °C 30 S，共40循環(huán)。
[0024] 另外，作為一種優(yōu)選的可實施方式，該試劑盒的使用方法為：W待測樣品DNA為模 板，分別利用引物組qYF2/qYR2和探針qYP、引物組qNF/qNR和探針qNP、引物組qBF2/qBRl和 探針姐P進行實時巧光定量PCR，根據(jù)PCR結(jié)果判斷樣品中含有短體線蟲的種類并統(tǒng)計含量。
[0025] 其中，對于待測樣品DNA沒有特殊的要求，按照本領(lǐng)域常規(guī)方法提取得到的樣品 DNA均可用于檢測。
[0026] 所述根據(jù)PCR結(jié)果判斷樣品中含有短體線蟲的種類的標準是： 當引物組qYF2/qYR2和探針qYP的檢測結(jié)果為特異性陽性時，則表明該樣品含有玉米短 體線蟲； 當引物組qNF/qNR和探針qNP的檢測結(jié)果為特異性陽性時，則表明該樣品含有擬玉米短 體線蟲； 當引物組姐F2/姐R1和探針姐P的檢測結(jié)果為特異性陽性時，則表明該樣品含有最短尾 短體線蟲。
[0027] 上述試劑盒在鑒定、檢測和/或定量檢測玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾 短體線蟲方面的應(yīng)用，也應(yīng)在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0028] 本發(fā)明具有W下有益效果： 本發(fā)明公開了一套鑒定甘薦上玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲的實 時巧光定量PCR體系的引物和探針，并構(gòu)建了試劑盒，分別對玉米短體線蟲、擬玉米短體線 蟲和最短尾短體線蟲有非常好的特異性，可準確、高效、精準地鑒定出運=種短體線蟲。本 發(fā)明的運套引物和探針，不僅能夠鑒定W及定性檢測玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最 短尾短體線蟲，克服了現(xiàn)有技術(shù)中=種線蟲難W區(qū)分的難題，而且，同時還能夠進行=種短 體線蟲含量的定量分析。
[0029] 此外，本發(fā)明的=組特異性引物和探針對玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短 尾短體線蟲的檢測靈敏性可達到0.01條線蟲的DNA(指分別用1條玉米短體線蟲、1條擬玉米 短體線蟲和1條最短尾短體線蟲提取的DNA稀釋100倍后的DNA模板），靈敏性非常高，有著非 常好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0030] 圖1為電泳檢測不同退火溫度分別對=種短體線蟲特異引物擴增效率的影響。A圖 為玉米短體線蟲;B圖為擬玉米短體線蟲;C圖為最短尾短體線蟲;A圖和B圖中M代表Marker II，1-2為56°C，3-4為58°C，5-6為60°C，7-8為62°C，9-10為清水對照；C圖中M代表Marker II，1-2為51°C，3-4為53°C，5-6為55°C，為7-8為57°C ,9-10為清水對照。
[0031] 圖2為實時巧光定量PCR體系分別檢測S種短體線蟲的引物組和探針的特異性;A 圖為玉米短體線蟲;B圖為擬玉米短體線蟲;C圖為最短尾短體線蟲;Y軸表示的是巧光值，X 軸表示的是循環(huán)數(shù)。
[0032] 圖3為實時巧光定量PCR體系分別檢測S種短體線蟲的引物組和探針的靈敏性;A 圖為玉米短體線蟲;B圖為擬玉米短體線蟲;C圖為最短尾短體線蟲;Y軸表示的是巧光值，X 軸表示的是循環(huán)數(shù)。
[0033] 圖4為實時巧光定量PCR體系分別檢測S種短體線蟲數(shù)量的標準曲線;A圖為玉米 短體線蟲;B圖為擬玉米短體線蟲;C圖為最短尾短體線蟲;R2表示相關(guān)系數(shù);E表示引物的擴 增效率。Y軸表示的是Ct值，X軸表示的是線蟲的數(shù)量。
【具體實施方式】
[0034] W下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試 劑、方法和設(shè)備。
[0035] 除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
[0036] 實施例1引物探針設(shè)計和反應(yīng)條件優(yōu)化 1、 引物設(shè)計 (1)根據(jù)NCBI中玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和其他植物寄生線蟲的DNA ITS序列設(shè) 計了玉米短體線蟲引物組qYF2/qYR2，特異探針qYP和擬玉米短體線蟲引物組qNF/qNP，特異 探針qNP。如表1所示。
[0037] (2)根據(jù)NCBI中最短尾短體線蟲和其他植物寄生線蟲的線粒體DNA CO/序列設(shè)計 了引物組姐F2和姐R1，W及特異探針姐P。如表1所示。
[003引表1引物和探針
2、 引物反應(yīng)條件優(yōu)化 (1)分別使用玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲的單條線蟲DNA作為模 板，分別W不同的退火溫度進行PCR擴增，優(yōu)化上述引物組的退火溫度。
[0039]所述單條線蟲DM的提取可W按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進行。本實施例是采用 S址)botin et al. (2008)所述方法進行，具體如下： 所述DNA的提取按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進行。本實施例是采用SiAbotin et al. (2008) 所述方法進行，具體如下:通過離屯、法收集線蟲或在體視鏡下挑取1條線蟲，然后加入16 iiL 滅菌雙蒸水，2化10XPCR buffer (無 Mg2+)(購于Takara)和2化蛋白酶K (600 mAnson U/mL)(購于化kara)，接著用針頭切割線蟲，隨后把該混合物置于65°C中1 h和95 °。中15 min。
[0040] PCR反應(yīng)體系為：2化DNA，上、下游引物各0.5化（10山0，12.5化hq Mix和余 量dd出0,共化化。
[0041 ] PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95°C 3 min;95°C 30 S，不同退火溫度梯度30 s(玉米短 體線蟲和擬玉米短體線蟲的退火溫度56°C~62°C，最短尾退火溫度為51~57°C)，72°C 1 min,共35循環(huán)； (2)將10 iiL PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖電泳分離，結(jié)果如附圖1所示，表明S組特異引物都 能分別擴增出玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲口S DNA和C0/ DNA，條帶 大小與預(yù)測相符合(玉米短體線蟲擴增條帶長104 bp、擬玉米短體線蟲擴增條帶長129 bp、 最短尾短體線蟲擴增條帶長160 bp)。
[0042] (3)選擇條帶較亮對應(yīng)的退火溫度，進一步做實時巧光PCR(SYBR法)實驗，確定最 佳的退火溫度。玉米短體線蟲和擬玉米短體線蟲選擇58°C和60°C，最短尾短體線蟲選擇53 。(:和 55°C。
[0043] 由于SYBR法實時巧光定量PCR實驗中，60 °C時擴增效率較高，因此選擇60°C作為 玉米短體線蟲和擬玉米短體線蟲特異引物組的退火溫度。同理，選擇55°C作為最短尾短體 線蟲特異引物組的退火溫度。
[0044] 實施例2特異性檢測 1、根據(jù)實施例1所設(shè)計的引物和探針，建立了分別檢測玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲 和最短尾短體線蟲的實時巧光定量PCR方法： 實時巧光定量PCR反應(yīng)體系為:2化DNA，上、下游引物各0.4化（10山0,探針0.4化 (10 yM)，10 yL實時巧光定量PCR預(yù)混試劑和余量dd出0,共20化。
[0045] 玉米短體線蟲和擬玉米短體線蟲的實時巧光定量PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95°C 30 s;95°C 5 S，退火溫度60°C 35 S，共40循環(huán)； 最短尾短體線蟲的的實時巧光定量PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95°C 30 s;95°C 5 S，退火 溫度55°C 35 S和72°C 30 S，共40循環(huán)； 其中，所述實時巧光定量PCR預(yù)混試劑包括實時巧光定量PCR反應(yīng)所需要的DNA聚合酶， 緩沖液和dNTP。
[0046] 2、特異性檢測 為驗證本發(fā)明引物組、探針W及實時巧光PCR方法的特異性和有效性，本實施例分別W 多個不同種群的玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲和其他非祀標線蟲的 DNA作為模板，進行檢測，實驗所用線蟲的具體種類如表2所示。
[0047] 表2實驗中使用的線蟲種群及對應(yīng)的Ct值
注:a.實時巧光定量PCR體系中使用玉米短體線蟲特異性引物組(qYF2/qYR2)和探針 (qYP)得到的Ct值。
[0048] b.實時巧光定量PCR體系中使用擬玉米短體線蟲特異性引物組(qNF/qNR)和探針 (qNP)得到的Ct值。
[0049] C.實時巧光定量PCR體系中使用最短尾短體線蟲特異性引物組(qBF2/姐R1)和探 針(qBP)得到的Ct值。
[0050] 化d:沒有信號、未檢測到ct值。
[0051] 3、結(jié)果如表2所示，本發(fā)明所述的實時巧光定量PCR方法能有效地鑒定、檢測不同 種群的祀標線蟲(玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲）。并且對非祀標線蟲 不會有非特異性的擴增，即對非祀標線蟲均呈現(xiàn)陰性。
[0052] 同時，本發(fā)明所述的體系能有效地檢測到單條的祀標線蟲，滿足實際的檢測和定 量需要。
[0053] 實施例3檢測靈敏性及標準曲線 1、在體視鏡下分別挑取1條的玉米短體線蟲、1條的擬玉米短體線蟲和1條的最短尾短 體線蟲，按照上述方法提取DNA，然后對DNA樣品進行梯度稀釋(如表3所示）。
[0054] 表3制作標準曲線使用的DNA樣品濃度和對應(yīng)的Ct值
2、W上述各稀釋濃度的DM樣品為模板，分別進行實時巧光定量PCR擴增，PCR反應(yīng)體系 和條件與實施例2相同。
[0055] 3、結(jié)果如附圖3所示，擴增0.01~1條祀標線蟲時都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，說明該 體系能準確地定量樣品中線蟲的數(shù)量。
[0056] 另外，上述結(jié)果也說明了本發(fā)明所述的實時巧光定量PCR體系分別檢測玉米短體 線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲的靈敏性能夠達到0.01條線蟲的DNA模板。
[0化7] 實施例4試劑盒組裝 1、一種鑒定甘薦上S種短體線蟲的實時巧光定量PCR檢測試劑盒，所述S種短體線蟲 為玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲;該試劑盒包含W下組分： (1)引物組qYF2/qYR2和探針qYP，引物組qNF/qNR和探針qNP，W及引物組姐F2/qBRl和 探針姐P。
[005引（2)實時巧光定量PCR反應(yīng)所需要的DNA聚合酶、緩沖液和dNTP。
[0059] 2、上述試劑盒的使用方法為：W待測樣品DNA為模板，分別利用引物組qYF2/qYR2 和探針qYP、引物組qNF/qNR和探針qNP、引物組qBF2/姐R1和探針姐P進行實時巧光定量PCR， 根據(jù)PCR結(jié)果判斷樣品中含有短體線蟲的種類并統(tǒng)計含量。
[0060] 具體地，所述根據(jù)PCR結(jié)果判斷樣品中含有短體線蟲的種類的標準是： 當引物組qYF2/qYR2和探針qYP的檢測結(jié)果為特異性陽性時，則表明該樣品含有玉米短 體線蟲； 當引物組qNF/qNR和探針qNP的檢測結(jié)果為特異性陽性時，則表明該樣品含有擬玉米短 體線蟲； 當引物組姐F2/姐R1和探針姐P的檢測結(jié)果為特異性陽性時，則表明該樣品含有最短尾 短體線蟲。
[00川其中，所述PCR的反應(yīng)體系按照如下比例進行：每20化體系中，分別加入2化 DNA，上下游引物各0.4化、探針0.4化、10化實時巧光定量PCR預(yù)混試劑和余量dd出0;其 中，所述實時巧光定量PCR預(yù)混試劑包括實時巧光定量PCR反應(yīng)所需要的DNA聚合酶，緩沖液 和dNTP。反應(yīng)程序如下： 利用引物組qYF2/qYR2和引物組qNF/qNR進行PCR時的反應(yīng)程序為:預(yù)變性95°C 30 S; 95°C 5 S，退火溫度60°C 35 S，共40循環(huán)； 利用所述引物組姐F2/qBRl進行PCR時的反應(yīng)程序為:預(yù)變性95°C 30 s;95°C 5 S，退 火溫度55 °C 35 S和72 °C 30 S，共40循環(huán)。
【主權(quán)項】
1. 一套鑒定甘蔗上三種短體線蟲的實時熒光定量PCR引物和探針，其特征在于，包括三 組引物和探針，分別為引物組qYF2/qYR2和探針qYP，引物組qNF/qNR和探針qNP，以及引物組 qBF2/qBRl和探針qBP;其核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1~9所示;所述三種短體線蟲為玉 米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定甘蔗上三種短體線蟲的實時熒光定量PCR引物和探針， 其特征在于，所述探針qYP、探針qNP和探針qBP的5'端均標記有FAM熒光基團，3'端均標記 有ECL熒光基團。3. 權(quán)利要求1或2所述鑒定甘蔗上三種短體線蟲的實時熒光定量PCR引物和探針在鑒 定、檢測和/或定量檢測玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲方面的應(yīng)用，或 在制備鑒定、檢測和/或定量檢測玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲的試劑 盒方面的應(yīng)用。4. 一種鑒定甘蔗上三種短體線蟲的實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，包含權(quán) 利要求1所述的引物組qYF2/qYR2和探針qYP，引物組qNF/qNR和探針qNP，以及引物組qBF2/ qBRl和探針qBP;所述三種短體線蟲為玉米短體線蟲、擬玉米短體線蟲和最短尾短體線蟲。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括實時熒光定量PCR反 應(yīng)所需要的DNA聚合酶、緩沖液和dNTP。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，使用該試劑盒時，PCR反應(yīng)體系按照如 下比例進行:每20 yL體系中，分別加入2 yL DNA，上、下游引物各0.4 yL、探針0.4 yL、10 μ L實時熒光定量PCR預(yù)混試劑和余量ddH20;其中，所述實時熒光定量PCR預(yù)混試劑包括實時 熒光定量PCR反應(yīng)所需要的DNA聚合酶，緩沖液和dNTP。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，使用該試劑盒時，利用引物組qYF2/ qYR2和引物組qNF/qNR進行PCR時的反應(yīng)程序為:預(yù)變性95°C 30 s;95°C 5 s，退火溫度60 °C 35 s，共40循環(huán)； 利用所述引物組qBF2/qBRl進行PCR時的反應(yīng)程序為:預(yù)變性95°C 30 s;95°C 5 s，退 火溫度55 °C 35 s和72 °C 30 s，共40循環(huán)。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒的使用方法為：以待測樣品的DNA 為模板，分別利用引物組qYF2/qYR2和探針qYP、引物組qNF/qNR和探針qNP、引物組qBF2/ qBRl和探針qBP進行實時熒光定量PCR，根據(jù)PCR結(jié)果判斷樣品中含有的短體線蟲種類和/或 統(tǒng)計短體線蟲的含量。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述根據(jù)PCR結(jié)果判斷樣品中含有短體 線蟲的種類的標準是： 當引物組qYF2/qYR2和探針qYP的檢測結(jié)果為特異性陽性時，則表明該樣品含有玉米短 體線蟲； 當引物組qNF/qNR和探針qNP的檢測結(jié)果為特異性陽性時，則表明該樣品含有擬玉米短 體線蟲； 當引物組qBF2/qBRl和探針qBP的檢測結(jié)果為特異性陽性時，則表明該樣品含有最短尾 短體線蟲。10. 權(quán)利要求4~9任一所述試劑盒在鑒定、檢測和/或定量檢測玉米短體線蟲、擬玉米短 體線蟲和最短尾短體線蟲方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK106048004SQ201610381616
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】卓侃, 林柏榮, 劉星彤, 廖金鈴
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)