鑒定散葉葉用萵苣品種的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定散葉葉用萵苣品種的方法，采用SSR分子標(biāo)記法對(duì)散葉葉用萵苣進(jìn)行品種鑒定，SSR分子標(biāo)記法在散葉葉用萵苣多態(tài)性研究中，其專用引物如下：SML026；SML022；SML021；SML013；SML007；SML002；SML001；SH86；SH66；SH49；SH43；SH42；KSL271；KSL173；KSL123；KSL115；KSL97；KSL92；KSL87；KSL51；KSL32；KSL26。用上述專用引物獲取散葉葉用萵苣SSR指紋圖譜和待鑒定品種的指紋，將待測(cè)品種的指紋與所述的SSR指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，獲得鑒定結(jié)果。能方便、準(zhǔn)確的鑒定散葉葉用萵苣品種。
【專利說明】
鑒定散葉葉用萬宦品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種鑒定散葉葉用窩宦品種技術(shù)，尤其設(shè)及一種鑒定散葉葉用窩宦品 種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，我國(guó)國(guó)家蔬菜種質(zhì)資源庫收集和保存散葉葉用窩宦種質(zhì)資源200余份，但目 前生產(chǎn)上使用的栽培品種多數(shù)引自國(guó)外。散葉葉用窩宦是一種低投入、高收益、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐 富的速生蔬菜，近年來栽培面積迅速擴(kuò)大，逐漸成為人們食用的首選綠葉蔬菜之一。但是， 我國(guó)散葉葉用窩宦的栽培品種主要靠引進(jìn)國(guó)外已有品種，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的品種和類型 很有限，并且在品種資源捜集、鑒定上幾乎是空白。因此，需要多角度、多方法開展種質(zhì)資源 的創(chuàng)新工作，開發(fā)出品質(zhì)優(yōu)良的散葉葉用窩宦新品種，來滿足當(dāng)前生產(chǎn)的需要。種質(zhì)資源是 蔬菜遺傳育種和品種改良的基本材料，種質(zhì)資源的鑒定和篩選是培育和改良優(yōu)異品種的一 項(xiàng)基礎(chǔ)工作。由于不同地區(qū)之間頻繁引種，使得品種名稱十分混亂，同物異名和同名異物的 現(xiàn)象非常普遍。所W，利用SSR指紋圖譜技術(shù)鑒定散葉葉用窩宦品種很有必要。
[0003] 現(xiàn)階段，對(duì)于蔬菜的種質(zhì)資源鑒定，大多用的基于PCR技術(shù)的DNA標(biāo)記技術(shù)，可綜合 為S大類：一是W分子雜交為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，主要是RFLP( Restrict ion Fragment Length Polymor曲ism)及VNTR(化riable number tandem repeat);二是WPCR為基礎(chǔ)的標(biāo) 記技術(shù)，如RAPD(Random Amplified 化lymo;rphic DNA)、SCAR(Sequence Qiaracterized Amplified Regions)、STS(Sequence Tagged Site)、SSR(Simple Sequence Repeat)、ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)、DAF(DNA Amplified Fingerprinting)及邸^1?化又- tended Random Primer Amplified Regions)等；S是酶切和PCR相結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，主要 有AFLP(Amplified ragment Length Polymorphism)和CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)。此外，還有一類新近發(fā)展起來的基于單個(gè)核巧酸多態(tài)性的DNA標(biāo) 記，即SNP(Simple Nucleotide化lymo;rphism)。隨著逆轉(zhuǎn)座子研究，一項(xiàng)基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座 子的植物分子標(biāo)記技術(shù)一RTN技術(shù)得到了很大的發(fā)展，主要有SSAP( Sequence-1化riation Polymorphism)、RIAP(Inverse Retrotransposon Amplified Polymorphism)、RBIP (Retrotransposon based Insertion Polymorphism)等5種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種使用方便、結(jié)果準(zhǔn)確的鑒定散葉葉用窩宦品種的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明的鑒定散葉葉用窩宦品種的方法，采用SSR分子標(biāo)記法對(duì)散葉葉用窩宦進(jìn) 行品種鑒定，所述的SSR分子標(biāo)記法在散葉葉用窩宦多態(tài)性研究中，其專用引物如下：（1) SML026
[0007] (2)SML022 [000引（3)SML021
[0009] (4)SML013
[0010] (5)SML007
[0011] (6)SML002
[0012] (7)SML001
[0013] (8)S 冊(cè) 6
[0014] (9)S冊(cè) 6
[0015] (10)SH49
[0016] (1DSH43
[0017] (12)SH42 [001 引（13 化化 271
[0019] (14 化化 173
[0020] (15)KSL123
[0021] (16化SL115
[0022] (17 化化 97
[0023] (18 化化 92
[0024] (19 化化 87
[00巧](20化化51 [00%] (21 化化 32
[0027] (22)KSL26
[0028] 用所述專用引物獲取散葉葉用窩宦SSR指紋圖譜，并用所述專用引物獲取待鑒定 品種的指紋，將待測(cè)品種的指紋與所述的SSR指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，獲得鑒定結(jié)果。
[0029] 由上述本發(fā)明提供的技術(shù)方案可W看出，本發(fā)明實(shí)施例提供的鑒定散葉葉用窩宦 品種的方法，能方便、準(zhǔn)確的鑒定散葉葉用窩宦品種。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。
[0031] 本發(fā)明的鑒定散葉葉用窩宦品種的方法，其較佳的【具體實(shí)施方式】是：
[0032] 采用SSR分子標(biāo)記法對(duì)散葉葉用窩宦進(jìn)行品種鑒定，所述的SSR分子標(biāo)記法在散葉 葉用窩宦多態(tài)性研究中，其專用引物如下：（1)SML026
[0033] (2)SML022
[0034] (3)SML021
[0035] (4)SML013
[0036] (5)SML007
[0037] (6)SML002 [003引（7)SML001
[0039] (8)S冊(cè) 6
[0040] (9)S冊(cè) 6
[0041] (l〇)SH49
[0042] (1DSH43
[0043] (12)SH42
[0044] (13化化 271
[0045] (14 化化 173
[0046] (15 化化 123
[0047] (16 化化 115
[004引 （17化化97
[0049] (18 化化 92
[0化0] (19化化87
[0051] (20 化化 51
[0化2] (21化化32
[0053] (22)KSL26
[0054] 用所述專用引物獲取散葉葉用窩宦SSR指紋圖譜，并用所述專用引物獲取待鑒定 品種的指紋，將待測(cè)品種的指紋與所述的SSR指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，獲得鑒定結(jié)果。
[0055] 通過W下方法獲取散葉葉用窩宦SSR指紋圖譜，包括W下步驟：
[0056] A、W葉用窩宦的基因組DNA為模板，用所述專用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0057] B、將步驟A中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，分別記錄品種中SSR片段的長(zhǎng)度； [005引C、按照電泳的峰值圖讀數(shù)，有峰記為1，無峰記為0,根據(jù)(0，1)數(shù)據(jù)矩陣，構(gòu)建SSR 指紋圖譜。
[0059] 應(yīng)用于品種鑒定時(shí)，將待鑒定品種的DNA用所述專用引物經(jīng)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，將產(chǎn)物 對(duì)應(yīng)的條帶填寫入相應(yīng)的（〇，1)標(biāo)記表中得出待測(cè)品種的指紋，而后將待測(cè)品種的指紋與 上述的SSR指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，直接獲得鑒定結(jié)果。
[0060] 具體實(shí)施例：
[0061] 實(shí)例1、用SSR分子標(biāo)記法建立散葉葉用窩宦指紋圖譜。
[0062] 操作流程為：制備模板DNA^DNA擴(kuò)增^毛細(xì)管電泳^統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。具體方法和 過程如下：
[0063] 1、使用改良的CTAB法提取的葉用窩宦基因組DNA:
[0064] 提取的基因組DNA經(jīng)Elppendorf Bio地otometer測(cè)定0〇26日/0〇28日值在1.7-1.9范圍 內(nèi)。將DNA提取液稀釋成10化g/iil，取化1 DNA樣品加入化1 loading buffer稀釋液，在1% 的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)，穩(wěn)壓4V/cm，電泳45min。電泳結(jié)果顯示，DNA主帶清晰，無降解現(xiàn)象， RNA去除干凈，可W作為模板。
[00化]2、SSR引物的設(shè)計(jì)和篩選：
[0066] 在SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，不同引物組合對(duì)某一特定基因組的擴(kuò)增效率是不同的。引 物擴(kuò)增效率的高低由它產(chǎn)生的多態(tài)性條帶數(shù)決定。本實(shí)例對(duì)109對(duì)引物組合進(jìn)行分別進(jìn)行 擴(kuò)增，從中篩選出了22對(duì)譜帶分布均勻，條帶豐富，多態(tài)性較高且譜帶質(zhì)量較好的引物組 合，可用于提供樣品種質(zhì)資源遺傳多樣性研究。運(yùn)十一對(duì)引物如下：
[0067] 引物對(duì) 1: SML026 ;GGGTTCTCATTGGCTGACAT/TGTCTTCCAACCAAAACATACA(GAA)ii
[006引 引物對(duì) 2: SML022 ;GGGCCTCAAATCCTCTCTG/TGTTCTTCCCCTCTTTGGAA(ATC)i3
[0069] 引物對(duì) 3: SML021; TTGGGAGAATTTTCATTTCCA/AGTCATCTTTTTCACCCCACA(TA)8
[0070] 引物對(duì) 4: SML013; TCCCATGATGGAGAGACTCA/CCCAAAAGGGAATAGCAACC (GAA) 14 (CTG)已
[0071 ]引物對(duì) 5: SML007; ACACTTGCCGATTCCTTCAC/ACCCGTGTTGAAAATGGAGA(TCACCA)i9
[0072] 引物對(duì) 6: SML002 ;GTGATTGCATGCCAAATGAA/TTAGTAGCCCGCATGCTTTT(TTC)i7
[0073] 引物對(duì) 7: SML001; CCATGGATCCTGTGTGAAGA/CACCATGTTCCACTTCCACTT(CATGAT)6
[0074] 引物對(duì) 8: S冊(cè) 6 ;GTCTGTGTGGTTTTGGT/TGTGGTGGAGTGTGATTT(CT)20
[0075] 引物對(duì) 9: S冊(cè) 6 ;GGTAGGGCAGTCAAGCAAGA/AATGATGATTTTGCCCTTGG(TC)28
[0076] 引物對(duì)10: SH49 ;GGAGATTGAGAGGAAAA/GAGTGGAAGGGAAATAG(AG)化
[0077] 引物對(duì)11: SH43; CTCTCGTTCCTTTTGTTGGTTT/TGGTAGTGGCTTCCTTGCTATT(AC)i〇
[007引 引物對(duì)12: SH42 ;GCAAGCTAAAGGGCTTTTTGT/CAGCCTGGGAATATTTACTCTGA(ATT)27
[00 巧]引物對(duì)13 :K化271; ACAAAGGCAAGATTGGGTCA/GCGGATATGCAGCCATAACA(ATG)i2 [0080]引物對(duì) 14:K化 173; ATAGTCACGACTCACGCCCA/CCATTTTCCTCTTTCTGCGA (CT) 14 [0081 ]引物對(duì) 15: K化123; ATTGTAACTTCTGCGGGCCT/GCCTCACATGTTCTTCCCCT (ATC) 13
[0082] 引物對(duì) 16: K化 115; CATTGCACTCCGTCATCTCC/GGGTTGATTCCGAAAGTTCC (CT) 11
[0083] 引物對(duì) 17 :K 化 97; CGCAGAAAAGGGATCAGACA/TCAGAGACACTGCAAAAGGGA(CT)ii
[0084] 引物對(duì) 18: K化92; GGTCTCTTTCCTCTGCCCTG/TCGCGTTCTGAAGTAGCCAT (CT) 20 [00 化]引物對(duì) 19: K化87; GCGGGATCGATACTTACCCT/ATCATCGACGGGCTTTTCTT (CT) 17 [00 化]引物對(duì) 20 :K 化51; CCCCTACCACCACCAAAGTC/TACCAAATGACATGCACCCC(ATG)i〇
[0087] 引物對(duì)21 :K化32; CGGGGAGCATTTAGTGTGTG/AATTTGGGGTCCGATTTGAG(CT)i4
[0088] 引物對(duì)22: K化26; GGGCTTTCTCTCCTTTCCTTT/AATTTGGATCCTGTCGAGGG (TC) 16
[0089] 3、DNA的擴(kuò)增，如下表1:
[0090]
[0091] 94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 45sec，循環(huán) 38次；最 后72 °C延伸1 Omin。4 °C保溫待用。
[0092] 表2.SSR擴(kuò)增統(tǒng)計(jì)結(jié)果：
[0093]
[0094] 4.獲取散葉葉用窩宦的指紋圖譜：
[0095] 根據(jù)擴(kuò)增帶的強(qiáng)弱，W及清晰度確定遺傳變異的帶，淘汰假象帶。在電泳圖譜中進(jìn) 行比較，確定單態(tài)帶和多態(tài)帶。選取電泳平板上清晰可辨的電泳條帶，w"r和"0"分別記錄 條帶的有無，在同一遷移距離上有帶賦值"r，無帶賦值"0"。
[0096] 實(shí)例2、散葉葉用窩宦的SSR指紋圖譜分析與應(yīng)用：
[0097] 根據(jù)22對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果，用(0，1)法繪制得出散葉葉用窩宦的指紋圖譜，如表3:
[0098] 表3:散葉葉用窩宦的指紋圖譜(部分）
[0099]
[0100] 應(yīng)用于品種鑒定時(shí)，將待鑒定品種的DNA，用22對(duì)引物經(jīng)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，將產(chǎn)物對(duì)應(yīng) 的條帶填寫入相應(yīng)的（〇，1)標(biāo)記表中得出待測(cè)品種的指紋，而后將待測(cè)品種的指紋與上述 的指紋圖譜(表3)進(jìn)行對(duì)比，可直接獲得鑒定結(jié)果。
[0101] 如某一品種經(jīng)上述流程得出指紋為：
[0102] 000101000100010000100000010010010000000000001000000010000000001001100 1000000100000100010001000000000100001000010000000000101000001000000000
[0103] 將此指紋與表3提供的指紋對(duì)比，則可知此品種為GS-61。
[0104] W上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換， 都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該W權(quán)利要求書的保護(hù)范 圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鑒定散葉葉用萵苣品種的方法，其特征在于，采用SSR分子標(biāo)記法對(duì)散葉葉用萵 苣進(jìn)行品種鑒定，所述的SSR分子標(biāo)記法在散葉葉用萵苣多態(tài)性研究中，其專用引物如下： (DSML026 (2) SML022 (3) SML021 ⑷SML013 (5) SML007 (6) SML002 ⑴SML001 (8) SH86 (9) SH66 (10) SH49 (11) SH43 (12) SH42 (13) KSL271 (14) KSL173 (15) KSL123 (16) KSL115 (17) KSL97 (18) KSL92 (19) KSL87 (20) KSL51 (21) KSL32 (22) KSL26 用所述專用引物獲取散葉葉用萵苣SSR指紋圖譜，并用所述專用引物獲取待鑒定品種 的指紋，將待測(cè)品種的指紋與所述的SSR指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，獲得鑒定結(jié)果。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定散葉葉用萵苣品種的方法，其特征在于，通過以下方法獲 取散葉葉用萵苣SSR指紋圖譜，包括以下步驟： A、 以葉用萵苣的基因組DNA為模板，用所述專用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； B、 將步驟A中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，分別記錄品種中SSR片段的長(zhǎng)度； C、 按照電泳的峰值圖讀數(shù)，有峰記為1，無峰記為0,根據(jù)(0，1)數(shù)據(jù)矩陣，構(gòu)建SSR指紋 圖譜。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定散葉葉用萵苣品種的方法，其特征在于，應(yīng)用于品種鑒定 時(shí)，將待鑒定品種的DNA用所述專用引物經(jīng)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，將產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的條帶填寫入相應(yīng)的 (〇，1)標(biāo)記表中得出待測(cè)品種的指紋，而后將待測(cè)品種的指紋與上述的SSR指紋圖譜進(jìn)行對(duì) 比，直接獲得鑒定結(jié)果。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK106047996SQ201610350280
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月24日
【發(fā)明人】范雙喜, 羅江, 韓瑩琰, 張鵬航, 高琦, 谷建田, 劉超杰
【申請(qǐng)人】北京農(nóng)學(xué)院