一種測定1,5?脫水葡糖醇的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定1,5?脫水葡糖醇的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分：試劑R1：Tris緩沖液、葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、抗壞血酸氧化酶、三磷酸腺苷、磷酸丙酮酸烯醇式鹽、4?氨基安替吡啉、MgCl2、KCl，其溶劑為純化水，試劑R2：Tris緩沖液、吡喃糖氧化酶、辣根過氧化物酶、3?羥基?2、4、6?三碘苯甲酸，其溶劑為純化水，制備方法為：配制好試劑；將待測血清樣本與試劑R1和試劑R2混合；測定反應(yīng)后的吸光度差值；計(jì)算出樣本中的1,5?脫水葡糖醇的濃度。本發(fā)明具有準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
-種測定1，5-脫水葡糖醇的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定1,5-脫水葡糖醇的試 劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1,5-脫水葡糖醇（1，5-AG)又稱1,5-脫水山梨醇或1-脫氧葡萄糖，是一種具有化喃 環(huán)結(jié)構(gòu)的六碳單糖，廣泛分布于人體各組織中，其它組織中1，5-AG含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過血液中的 含量，因代謝緩慢，故血液中濃度變化很小，1，5-脫水葡糖醇（1，5-AG)在血漿中W非結(jié)合形 式存在，分子量小，親水性強(qiáng)，可自由通過腎小球基底膜，幾乎在腎小管全部被重吸收，運(yùn)種 重吸收明顯受到尿葡萄糖排泄的抑制。
[0003] 血漿中1,5-脫水葡糖醇（1，5-AG)水平與葡萄糖、糖化血紅蛋白和果糖胺呈顯著負(fù) 相關(guān)，有資料表明，血漿葡萄糖〉8.3mmol/L者，無一例外有高水平的血漿1,5-脫水葡糖醇 (1，5-AG)，糖尿病人的血漿1，5-脫水葡糖醇（1，5-AG)顯著低于健康人，糖尿病患者由于反 復(fù)、持久的增加尿中葡萄糖的排泄，因此抑制了腎小管對1，5-AG的重吸收，導(dǎo)致血漿中濃度 明顯降低。
[0004] 目前測定1,5-脫水葡糖醇主要采用全酶法測定，主要有氧化酶法和脫氨酶法兩種 方法，但是運(yùn)兩種方法不僅操作復(fù)雜，而且由于會有葡萄糖干擾，因此檢測準(zhǔn)確性比較差。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有檢測方法操作復(fù)雜、檢測準(zhǔn)確性差的 缺陷，而提供一種測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是:本發(fā)明公開了一種測定1,5-脫水葡 糖醇的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為：
[00
[000引作為優(yōu)選，本發(fā)明公開了一種測定1，5-脫水葡糖醇的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試 劑R1和試劑R2雙液體組分組成，包括的成分及相應(yīng)含量為：
[00
[0010] 作為優(yōu)選，所述的試劑R1中，所述的化is緩沖液的pH值為6~9。
[0011] 作為優(yōu)選，所述的試劑R2中，所述的化is緩沖液的pH值為6~9。
[0012] 作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開了上述測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒的制備方法和使用 方法，包括W下步驟：
[0013] 試劑R2:
(b)將待測血清樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (C)用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (d)根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的1,5-脫水葡糖醇的濃度。
[0014] 本發(fā)明的檢測原理是:首先用試劑R1處理血清樣本，經(jīng)葡萄糖激酶和丙酬酸激酶 偶聯(lián)系統(tǒng)使血清中葡萄糖徹底轉(zhuǎn)化為不與化喃糖氧化酶反應(yīng)的6-憐酸葡萄糖，W除去葡萄 糖的干擾作用，然后加入試劑R2,其中被測的1，5-AG氧化成1,5-脫水果糖和出化，后者經(jīng)辣 根過氧化物酶、4-氨基安替化嘟和3-徑基-2、4、6-S艦苯甲酸反應(yīng)系統(tǒng)作用，產(chǎn)生化inder 反應(yīng)，發(fā)生顯色反應(yīng)進(jìn)行比色測定，從而計(jì)算出樣本中1，5-AG的含量。
[0015]
式中：A At W空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 AAs W空白管吸光度作對照的校準(zhǔn)管吸光度值 Cs校準(zhǔn)液中1，5-AG的濃度 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益優(yōu)點(diǎn)： 血清1，5-AG檢測作為篩選糖尿病的隨機(jī)實(shí)驗(yàn)較其它評價實(shí)驗(yàn)而言更為靈敏，且操作簡 便，適合臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展大規(guī)模的檢測，血清1，5-AG檢測無需像0GTT-樣，需要反復(fù)采 血進(jìn)行檢測，且無需采血限制，且該方法應(yīng)用了葡萄糖激酶和丙酬酸激酶系統(tǒng)反應(yīng)，將葡萄 糖轉(zhuǎn)化為不參與反應(yīng)的6-憐酸葡萄糖，消除了內(nèi)源性葡萄糖的干擾，因此使得檢測結(jié)果更 加準(zhǔn)確。
【具體實(shí)施方式】
[0016] W下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于運(yùn)些實(shí)施例。
[0017] 實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中
KCl 80 mmol/L 其溶劑為純化水。
[001引試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 化喃糖氧化酶 100 KU/L 辣根過氧化物酶 8 KU/L 3- 徑基-2、4、6-S艦苯甲酸 4.5 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0019] 實(shí)施例2 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 110 mmol/L 葡萄糖激酶 65 g/L 丙酬酸激酶 7.0 KU/L 抗壞血酸氧化酶 2.0KU/L S憐酸腺巧 0.2 mmol/L 憐酸丙酬酸締醇式鹽 6.5 mmol/L 4- 氨基安替化嘟 0.2 mmol/L MgC12 5 mmol/L KCl 10 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0020] 試劑 R2: Tris 緩沖液 20mmol/L 化喃糖氧化酶 150 KU/L 辣根過氧化物酶 16 KU/L 3- 徑基-2、4、6-S 艦苯甲酸 0.5mmol/L 其溶劑為純化水。
[0021] 實(shí)施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 葡萄糖激酶 35 g/L 丙酬酸激酶 3.5 KU/L 抗壞血酸氧化酶 6.0 KU/L S憐酸腺巧 1.0 mmol/L 憐酸丙酬酸締醇式鹽 4.0 mmol/L 4- 氨基安替化嘟 1.0 mmol/L MgC12 15 mmol/L KCl 80 mmol/L 其溶劑為純化水。
[00剖試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 化喃糖氧化酶 100 KU/L 辣根過氧化物酶 8 KU/L 3- 徑基-2、4、6-S艦苯甲酸 4.5 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0023] 2、全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長570皿、副波長700皿； (C)反應(yīng)時間：10min，其中，解育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d)反應(yīng)方向：正反應(yīng)。
[0024] 3、檢測步驟 (a) 取22扣1試劑R1與化1待測血清樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下解育5min; (C)加入75iil試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 AA = A2-A1 ； (d)十算出樣本中的1，5-脫水葡糖醇的濃 度。
[00巧]實(shí)施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 110 mmol/L 葡萄糖激酶 65 g/L 丙酬酸激酶 7.0 KU/L 抗壞血酸氧化酶 2.0KU/L S憐酸腺巧 0.2 mmol/L 憐酸丙酬酸締醇式鹽 6.5 mmol/L 4- 氨基安替化嘟 0.2 mmol/L MgC12 5 mmol/L KCl 10 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0026]試劑 R2: Tris 緩沖液 20mmol/L 化喃糖氧化酶 150 KU/L 辣根過氧化物酶 16 KU/L 3-徑基-2、4、6-S艦苯甲酸 0.5mmol/L 其溶劑為純化水。
[0027] 2、全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長570皿、副波長700皿； (C)反應(yīng)時間：10min，其中，解育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d)反應(yīng)方向：正反應(yīng)。
[002引 3、檢測步驟 (a) 取22扣1試劑R1與化1待測血清樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下解育5min; (C)加入75iil試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 AA = A2-A1 ； (d):
十算出樣本中的1,5-脫水葡糖醇的濃度。
[0029] 表1為實(shí)施例1所制得的測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒W及實(shí)施例2所制得的測定 1,5-脫水葡糖醇的試劑盒分別對質(zhì)控品1進(jìn)行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品1中的1,5-脫水葡糖 醇的濃度為120umol/L，測定結(jié)果見表1: 表1
由表1可知，本發(fā)明所制得的測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒對質(zhì)控品1的測定結(jié)果偏差 較小，因此測定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0030] 表2為實(shí)施例1所制得的測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒W及實(shí)施例2所制得的測定1,5- 脫水葡糖醇的試劑盒分別對質(zhì)控品2進(jìn)行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品2中的1,5-脫水葡糖醇的 濃度為28(kimol/L，測定結(jié)果見表2: 表2_
由表2可知，本發(fā)明所制得的測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒對質(zhì)控品2的測定結(jié)果偏差 較小，因此測定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0031] 表3為實(shí)施例3所制得的測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒對同一待測樣本進(jìn)行的多 次反復(fù)測定W及實(shí)施例4所制得的測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒對同一待測樣本進(jìn)行的多 次反復(fù)測定，對所得的結(jié)果進(jìn)行SD和CV的計(jì)算，結(jié)果如下： 表3
由表3可知本發(fā)明所制得的測定1，5-脫水葡糖醇的試劑盒的精密度比較好，而且由表1 可知，實(shí)施例3為最優(yōu)的選擇。
[0032]上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人±皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所掲示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測定1，5-脫水葡糖醇的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2 雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 葡萄糖激酶 5~65 g/L 丙酮酸激酶 0.1~7.0 KU/L 抗壞血酸氧化酶 2.0~10.0 KU/L 三磷酸腺苷 0.2~1.8 mmol/L 磷酸丙酮酸稀醇式鹽1.5~6.5 mmol/L 4-氨基安替P比啉 0.2~1.8 mmol/L MgC12 5~25 mmol/L KC1 10-150 mmol/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 吡喃糖氧化酶 50~150 KU/L 辣根過氧化物酶 0.1~16 KU/L 3- 羥基-2、4、6_三碘苯甲酸0.5~8.5 mmol/L 其溶劑為純化水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定1，5_脫水葡糖醇的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú) 立的試劑R1和試劑R2雙液體組分組成，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 葡萄糖激酶 35 g/L 丙酮酸激酶 3.5 KU/L 抗壞血酸氧化酶 6.0 KU/L 三磷酸腺苷 1.0 mmol/L 磷酸丙酮酸稀醇式鹽 4.0 mmol/L 4- 氨基安替吡啉 1.0 mmol/L MgC12 15 mmol/L KC1 80 mmol/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 吡喃糖氧化酶 100 KU/L 辣根過氧化物酶 8 KU/L 3-羥基-2、4、6_三碘苯甲酸4.5 mmol/L 其溶劑為純化水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定1，5_脫水葡糖醇的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R1中，所述的Tris緩沖液的pH值為6~9。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定1，5_脫水葡糖醇的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R2中，所述的Tris緩沖液的pH值為6~9。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定1，5_脫水葡糖醇的試劑盒的制備方法和使用方 法，其特征在于:包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 葡萄糖激酶 5~65 g/L 丙酮酸激酶 0.1~7.0 KU/L 抗壞血酸氧化酶 2.0~10.0 KU/L 三磷酸腺苷 0.2~1.8 mmol/L 磷酸丙酮酸稀醇式鹽 1.5~6.5 mmol/L 4-氨基安替P比啉 0.2~1.8 mmol/L MgC12 5~25 mmol/L KC1 10-150 mmol/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 吡喃糖氧化酶 50~150 KU/L 辣根過氧化物酶 0.1~16 KU/L 3-羥基_2、4、6_三碘苯甲酸 0.5~8.5 mmol/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測血清樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的1，5-脫水葡糖醇的濃度。
【文檔編號】C12Q1/28GK106047988SQ201610273306
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司