一種利用天然皂苷生物轉(zhuǎn)化合成稀有人參皂苷ck的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用天然皂苷生物轉(zhuǎn)化合成稀有人參皂苷CK的方法，該方法以紫芝為發(fā)酵菌，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵至少3天后，添加天然皂苷至發(fā)酵液中，持續(xù)發(fā)酵，得到稀有人參皂苷CK。本發(fā)明以紫芝作為發(fā)酵菌株、以天然皂苷為底物進(jìn)行發(fā)酵獲得的稀有人參皂苷CK，不僅轉(zhuǎn)化率高、而且安全無(wú)毒，與其他微生物相比，藥食兼用真菌在生物轉(zhuǎn)化合成過(guò)程中的安全性更高、生物活性物質(zhì)產(chǎn)量更大，易于產(chǎn)品的推廣。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種利用天然皂昔生物轉(zhuǎn)化合成稀有人參皂昔CK的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物工程和微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種利用天然皂巧生物轉(zhuǎn) 化合成稀有人參皂巧CK的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 利用藥食兼用真菌生物合成、轉(zhuǎn)化生成的食品功能性分子不僅具有化學(xué)合成或其 他微生物生物合成的功能性分子的各類(lèi)功效，而且還擁有下列優(yōu)點(diǎn)：（1)相較于化學(xué)合成， 使用原料安全無(wú)毒，且反應(yīng)過(guò)程副產(chǎn)物安全無(wú)毒，產(chǎn)品安全性高；（2)能夠較大量的合成化 學(xué)方法難W合成的產(chǎn)物；（3)使用菌種安全、可使用，且菌種本身就擁有一定的保健功效； (4)原料在自然界廣泛存在且價(jià)廉;（5)發(fā)酵生產(chǎn)是典型的"綠色"工藝等。
[0003] 稀有人參皂巧compound K(Ginsenoside compound K)(下稱CK)是哺乳類(lèi)動(dòng)物在 服用人參或者天然人參皂巧后通過(guò)腸道的降解作用之后，在血液中檢測(cè)到的有效物質(zhì)；其 在天然人參屬植物中并不存在，并擁有下列生理活性：（1)對(duì)肺癌白血病、肺腺癌、胃癌、肝 癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌和腦瘤等多種癌癥起到促進(jìn)癌細(xì)胞調(diào)亡、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和 抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用；（2)具有恢復(fù)受損的學(xué)習(xí)和記憶、神經(jīng)保護(hù)作用，并且在神經(jīng)傳遞調(diào) 節(jié)中發(fā)揮重要作用；（3)有抗炎癥作用，能夠抑制炎癥因子的釋放和調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)代謝通 路；（4)有抗過(guò)敏作用；（5)有保肝作用，能夠提高肝細(xì)胞損傷模型中肝細(xì)胞的存活率。（6)具 有抗關(guān)節(jié)炎作用；（7)有抗糖尿病、抗血管形成W及一定的抗衰老作用。
[0004] 目前，報(bào)道過(guò)的，可W轉(zhuǎn)化產(chǎn)生人參皂巧的多種微生物的轉(zhuǎn)化率不盡相同，最高可 達(dá)99 %，其產(chǎn)業(yè)化前景備受關(guān)注。
[0005] 紫芝(Ganoderma sinense)又稱黑芝、玄芝、木芝、中國(guó)靈芝，是中國(guó)特有的珍稀食 藥用真菌品種之一。富含多糖、靈芝酸等=祗類(lèi)物質(zhì)成分，具有抗衰老、提高機(jī)體免疫功能、 保肝護(hù)肝、抑制腫瘤等功效。由于其本身含有多糖W及=祗類(lèi)化合物，其能夠產(chǎn)生較多種類(lèi) 的糖巧酶，故可轉(zhuǎn)化天然皂巧為稀有人參皂巧CK。
[0006] 公開(kāi)號(hào)為CN104140931A的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)文獻(xiàn)公開(kāi)了一種甘人參皂巧CK的轉(zhuǎn)化合 成方法，包括:將固體培養(yǎng)活化的阿達(dá)青霉(PeniciIlium adametzii)3.3203接入液體±豆 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36~7化后加入原人參二醇，于24~32°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)48~12化，得到發(fā) 酵液;從發(fā)酵液中分離純化得到人參皂巧。
[0007] 然而，使用青霉等不可食用或?qū)θ梭w有一定危害的微生物來(lái)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生人參皂巧 CK，造成產(chǎn)品安全性不能得到完全保障，且分離純化成本較高，影響產(chǎn)品作為保健功能性成 分在市場(chǎng)中的競(jìng)爭(zhēng)力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明提供了一種利用天然皂巧進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化合成稀有人參皂巧CK的方法，該方 法不僅能夠轉(zhuǎn)化得到生物活性較高的人參皂巧，而且利用食藥同源真菌紫芝進(jìn)行轉(zhuǎn)化，保 證了產(chǎn)物的安全性，發(fā)酵產(chǎn)物中的多種生物活性物質(zhì)增強(qiáng)發(fā)酵產(chǎn)物的保健功能、提高了人 參皂巧的市場(chǎng)價(jià)值。
[0009] -種利用天然皂巧生物轉(zhuǎn)化合成稀有人參皂巧CK的方法，W紫芝為發(fā)酵菌，進(jìn)行 發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵至少3天后，添加天然皂巧至發(fā)酵液中，持續(xù)發(fā)酵，得到稀有人參皂巧CK。
[0010] 具體地，所述紫芝為紫芝(Ganoderma sinensis)CGMCC 5.69。
[0011] 具體地，所述天然皂巧為絞股藍(lán)總皂巧、=屯總皂巧、人參總皂巧中的至少一種； =者都含有多種相同皂巧單體，其主要成分較為相似。更優(yōu)選，所述天然皂巧為絞股藍(lán)總皂 巧。
[0012] 作為優(yōu)選，W質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括W下組分:葡萄糖1.5~ 2.5%，蛋白腺1.5~2%，憐酸二氨鐘0.03~0.3%，硫酸儀0.1~0.2%，維生素 B1 0~ 0.005%袖3.0~5.5。
[0013] 作為優(yōu)選，W每升發(fā)酵培養(yǎng)基計(jì)，所述天然皂巧的添加量為0.3~5. Og;更優(yōu)選，所 述天然皂巧的添加量為0.5~2. Og。
[0014] 經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，天然皂巧在發(fā)酵過(guò)程中的添加時(shí)間會(huì)對(duì)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率有很大影響。 作為優(yōu)選，發(fā)酵培養(yǎng)4~7天后，添加天然皂巧至發(fā)酵液中。更優(yōu)選，發(fā)酵培養(yǎng)6天后。
[0015] 作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為10°C~28°C，總發(fā)酵天數(shù)為8~14天;更優(yōu)選，溫 度為25°C，總發(fā)酵天數(shù)為12天。
[0016] 所述紫芝依次經(jīng)活化、種子培養(yǎng)后，獲得種子液，再將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基 中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);其中，種子培養(yǎng)基包括W下組分:葡萄糖1.5~2.5%，蛋白腺1.5~2%， 憐酸二氨鐘0.03~0.3%，硫酸儀0.1~0.2%，維生素 B1 0~0.005%。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果：
[0018] 本發(fā)明W紫芝作為發(fā)酵菌株、W天然皂巧為底物進(jìn)行發(fā)酵獲得的稀有人參皂巧 CK，不僅轉(zhuǎn)化率高、而且安全無(wú)毒，與其他微生物相比，藥食兼用真菌在生物轉(zhuǎn)化合成過(guò)程 中的安全性更高、生物活性物質(zhì)產(chǎn)量更大，易于產(chǎn)品的推廣。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明利用天然皂巧生物轉(zhuǎn)化合成稀有人參皂巧CK的方法流程圖。
[0020] 圖2為HPLC檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。
[0021] 圖3為實(shí)施例1中獲得的產(chǎn)物樣品的HPLC圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。W下實(shí)施例中所使用的菌種為紫芝 (6曰110(161'111曰8；[]16]1313)〔61撕5.69，購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)普通微生物保藏管理中屯、，本發(fā)明不設(shè)及 菌種的保藏。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] (1)菌種活化:將配置好的活化培養(yǎng)基進(jìn)行高溫高壓滅菌，冷卻并倒好平板，將冷 凍保存的紫芝(Ganoderma sinensis)CGMCC 5.69菌株接種至滅菌后的活化培養(yǎng)基平板上， 在25 °C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7d，至平板布滿菌絲為止，平板備用。
[0025] 其中，活化培養(yǎng)基的成分為:馬鈴馨浸粉lOg/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，水。
[0026] (2)種子培養(yǎng):取500mL的錐形瓶，每瓶裝入lOOmL的種子培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌冷 卻，挖取1.5cmX 1.5cm的活化后的菌塊，接種到裝有l(wèi)OOmL種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，在25°C、 旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為ISOrmp的條件下，培養(yǎng)5d。
[0027] 其中，種子培養(yǎng)基由W下組分構(gòu)成:葡萄糖20g/L，蛋白腺18g/L，憐酸二氨鐘3g/L， 硫酸儀1.5g/L，維生素 B1 0.05g/L，水。
[0028] (3)發(fā)酵培養(yǎng):在化氣升罐中加入4.5升發(fā)酵培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌，取上述種子 液，按照500mL種子液/4.化發(fā)酵培養(yǎng)基接種到發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在25°C、通氣量為4的條件下 發(fā)酵培養(yǎng)6d，加入天然皂巧后，轉(zhuǎn)化發(fā)酵6d。
[0029] 其中，發(fā)酵培養(yǎng)基由W下組分構(gòu)成:葡萄糖20g/L，蛋白腺18g/L，憐酸二氨鐘3g/L， 硫酸儀1.5g/L，維生素 B1 0.05g/L，水，pH值未做調(diào)節(jié)。
[0030] 其中，天然皂巧采用絞股藍(lán)總皂巧，添加前，先將絞股藍(lán)總皂巧溶解于500ml乙醇， 無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌，W蠕動(dòng)累添加入氣升罐，添加量為Img/ml發(fā)酵培養(yǎng)基，如表1所示。
[0031 ] (4)萃取分離:發(fā)酵培養(yǎng)后，取與發(fā)酵液等體積的水飽和正下醇，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行萃 取2~3次，合并有機(jī)相，減壓旋蒸，得到稀有人參皂巧CK粗產(chǎn)品;再W適量色譜純甲醇溶解， 使用HPLC測(cè)定CK濃度，實(shí)施例1的產(chǎn)量為1.478mg/L，如表1所示。
[0032]表1實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)基中天然皂巧添加情況、CK產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率
[0034] 注:轉(zhuǎn)化率(mg/g)=CK產(chǎn)量(mg)/絞股藍(lán)皂巧添加量(g)
[0035] 實(shí)施例2~8
[0036] (1)菌種活化:將配置好的活化培養(yǎng)基高溫高壓滅菌冷卻，并倒好平板，將冷凍保 存的紫芝(6曰11〇(16^11曰8111611313)〔610：5.69菌株接種至滅菌后的活化培養(yǎng)基平板上，在25 °C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7d，至平板布滿菌絲為止，平板備用。
[0037] 其中，活化培養(yǎng)基的成分為:馬鈴馨浸粉lOg/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L。
[0038] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：取250mL的錐形瓶，每瓶裝入50mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌冷 卻，挖取IcmXlcm的活化后的菌塊接種到裝有50mL種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，在25°C、旋轉(zhuǎn)式 搖床轉(zhuǎn)速為18〇1'1119的條件下，培養(yǎng)4(1、5(1、6(1、7(1，后加入天然皂巧至0.5111旨/1111、1.〇111旨/1111、 1.5mg/ml、2. Omg/ml，再轉(zhuǎn)化發(fā)酵至總時(shí)長(zhǎng)為12d。
[0039] 其中，發(fā)酵培養(yǎng)基由W下組分構(gòu)成:葡萄糖20g/L，蛋白腺18g/L，憐酸二氨鐘3g/L， 硫酸儀1.5g/L，維生素 B1 0.05g/L，水，pH值未做調(diào)節(jié)。
[0040] 其中，實(shí)施例2~8中的天然皂巧采用絞股藍(lán)總皂巧，添加前，將絞股藍(lán)總皂巧溶解 于5ml50 %乙醇水溶液，無(wú)菌濾膜過(guò)濾后添加入培養(yǎng)基，添加量為0.5mg/ml、Img/ml、1.5mg/ ml、2mg/ml發(fā)酵培養(yǎng)基，如表2所示。
[0041 ] (3)萃取分離測(cè)定:發(fā)酵培養(yǎng)后，取與發(fā)酵液等體積的水飽和正下醇，對(duì)發(fā)酵液進(jìn) 行萃取2~3次，合并有機(jī)相，減壓旋蒸，得到稀有人參皂巧CK粗產(chǎn)品；再W適量色譜純甲醇 溶解，使用HPLC測(cè)定CK濃度，實(shí)施例2~8的產(chǎn)量，如表2所示。
[0042]表2實(shí)施例2~8發(fā)酵培養(yǎng)基中天然皂巧添加情況、CK產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率
[0043]
注:轉(zhuǎn)化率(mg/g)=CK產(chǎn)量(mg)/絞股藍(lán)皂巧添加量(g)
[0044] 由表2的實(shí)施例2~8發(fā)酵結(jié)果可W看出，絞股藍(lán)總皂巧添加量為1.5mg/mL發(fā)酵培 養(yǎng)基、在發(fā)酵溫度為25°C、搖床轉(zhuǎn)速為18化pm的條件下，發(fā)酵6天后加入皂巧的平均轉(zhuǎn)化率 最高，最平均轉(zhuǎn)化率為6.448mg/l;當(dāng)絞股藍(lán)總皂巧添加量為2mg/mL發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵6天后 加入皂巧的稀有人參皂巧CK產(chǎn)量最高，平均產(chǎn)量為11.415mg/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用天然皂苷生物轉(zhuǎn)化合成稀有人參皂苷CK的方法，其特征在于，以紫芝為發(fā) 酵菌，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵至少3天后，添加天然皂苷至發(fā)酵液中，持續(xù)發(fā)酵，得到稀有人參 皂苷CK。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的紫芝為紫芝(Ganoderma sinensis) CGMCC 5.69〇3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述天然皂苷為絞股藍(lán)總皂苷、三七總皂苷、 人參總皂苷中的至少一種。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述天然皂苷為絞股藍(lán)總皂苷。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基，包 括以下組分:葡萄糖1.5~2.5%，蛋白胨1.5~2%，磷酸二氫鉀0.03~0.3%，硫酸鎂0.1~ 0.2%，維生素 Β1 0~0·005%，ρΗ 3.0~5.5。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基計(jì)，所述天然皂苷的添加 量為0.1~5. Og。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)4~7天后，添加天然皂苷至發(fā)酵液 中。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為10°C~28°C，總發(fā)酵 天數(shù)為8~14天。9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述紫芝依次經(jīng)活化、種子培養(yǎng)后，獲得種子 液，再將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);其中，種子培養(yǎng)基包括以下組分:葡萄 糖1.5~2.5%，蛋白胨1.5~2%，磷酸二氫鉀0.03~0.3%，硫酸鎂0.1~0.2%，維生素 B10 ~0.005%〇
【文檔編號(hào)】C12P33/20GK106047978SQ201610394273
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日
【發(fā)明人】陳啟和, 吳嘉南, 牛永武, 胡競(jìng)進(jìn)
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)