‘蘇植3號(hào)’雜交結(jié)縷草品種鑒定的分子標(biāo)記方法
【專利說(shuō)明】'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草品種鑒定的分子標(biāo)記方法
[0001] -、技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種植物遺傳標(biāo)記和品種分子鑒定的方法，具體地說(shuō)是一種基于基因組 SRAP分析的'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草品種分子鑒定方法。
[0002] 二、【背景技術(shù)】 結(jié)縷草屬(Zoysia Willd.)是一類多年生暖季型草坪草，廣泛分布于太平洋西岸和北 岸沿海地區(qū)，在非洲和澳洲等溫暖地區(qū)亦有分布。我國(guó)是全球結(jié)縷草分布最廣泛、儲(chǔ)蓄量最 大的國(guó)家。然而，從新品種的培育情況來(lái)看，我國(guó)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于美國(guó)、日本和韓國(guó)。美國(guó)本土不 產(chǎn)結(jié)縷草，但當(dāng)美國(guó)人發(fā)現(xiàn)結(jié)縷草為一種優(yōu)良的草坪草以后，就大量地從國(guó)外引進(jìn)結(jié)縷草， 美國(guó)的德克薩斯農(nóng)業(yè)與機(jī)械大學(xué)(Texas A & M University)就收集了來(lái)自太平洋北部沿 岸國(guó)家的1000多份結(jié)縷草屬種質(zhì)資源，并在此基礎(chǔ)上培育了 一系列結(jié)縷草新品種，如 Meyer、Belair、EI Toro、JaMur等等； 隨著我國(guó)草坪業(yè)的迅速發(fā)展以及國(guó)內(nèi)外對(duì)結(jié)縷草的大量需求，近些年來(lái)我國(guó)的一些研 究部門與育種專家們也越來(lái)越對(duì)充分利用我國(guó)的結(jié)縷草資源，推出國(guó)產(chǎn)草種加以重視，先 后有'青島'結(jié)縷草、'蘭引3號(hào)'結(jié)縷草、'上海'結(jié)縷草等育成。江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究 所從1993年起從國(guó)內(nèi)外廣泛收集結(jié)縷草種質(zhì)資源，到目前為止已經(jīng)收集了結(jié)縷草屬資源6 種1變種共178份種源，并對(duì)這些資源從外部性狀，坪用價(jià)值，形態(tài)類型，結(jié)實(shí)性，抗逆性等方 面進(jìn)行了一系列系統(tǒng)評(píng)價(jià)，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)優(yōu)良性狀互補(bǔ)配對(duì)的原則進(jìn)行結(jié)縷草屬種間 及種內(nèi)雜交育種工作，'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草即為中華結(jié)縷草與溝葉結(jié)縷草雜交所獲得的 一個(gè)優(yōu)良后代。與已有品種相比，該品種具有密度高、草層低矮、質(zhì)地柔軟細(xì)致，匍匐莖和地 下莖發(fā)達(dá)，抗寒性和耐鹽性強(qiáng)等諸多優(yōu)良特征，可廣泛用于北京及以南地區(qū)等地觀賞草坪、 公共綠地、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪以及保土草坪建植。該品種于2015年已通過(guò)國(guó)家草品種審定委員會(huì) 審定，為我國(guó)自主育成的第2個(gè)雜交結(jié)縷草新品種； '蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草為一典型的營(yíng)養(yǎng)繁殖型結(jié)縷草新品種，其外部形態(tài)易受生長(zhǎng)的 自然生態(tài)條件和草坪管理水平的影響，導(dǎo)致開發(fā)商及其使用者難以辨別品種的真實(shí)性，給 新品種的進(jìn)一步開發(fā)利用帶來(lái)影響。因此，尋找一種快速有效，不受環(huán)境影響，能夠準(zhǔn)確區(qū) 分不同基因型的簡(jiǎn)單、有效的的鑒別技術(shù)顯得十分重要； SRAP(Sequence-related Amplified Polymorphism)標(biāo)記是2001年由Li和Quiros開發(fā) 的一種基于PCR的新型分子標(biāo)記技術(shù)（Li G, Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theoretical and Applied Genetics, 2001，103:455-461.), SRAP標(biāo)記自開發(fā)以來(lái)，已在多種植物的遺傳多樣性、指 紋圖譜、純度鑒定、資源親緣關(guān)系分析、連鎖圖譜構(gòu)建、基因定位、比較基因組學(xué)研究等領(lǐng)域 得到廣泛應(yīng)用，2007年本單位首次將SRAP分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到結(jié)縷草屬植物的雜種真實(shí)性 鑒定和遺傳多樣性研究中（薛丹丹，郭海林，鄭軼琦，陳宣，劉建秀.結(jié)縷草屬植物雜交 后代雜種真實(shí)性鑒定--SRAP分子標(biāo)記.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009,18(1): 72-79.郭海林，鄭 軼琦，陳宣，薛丹丹，劉建秀.結(jié)縷草屬植物種間關(guān)系和遺傳多樣性的SRAP標(biāo)記分析. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18(5): 201-210.)，研究表明該標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)便、快速，多態(tài)性豐富， 重復(fù)性好，不受環(huán)境影響，能夠準(zhǔn)確區(qū)分不同基因型等特點(diǎn)，可有效地應(yīng)用于結(jié)縷草屬植物 的品種鑒定中。
[0003] 三、
【發(fā)明內(nèi)容】
技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明提供一種基于結(jié)縷草新品種'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草基因組的SRAP分 子標(biāo)記鑒定方法，它克服了根據(jù)形態(tài)鑒定的模糊性，該方法對(duì)'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草的鑒別 更可靠、準(zhǔn)確、重復(fù)性高； 技術(shù)方案： 上述'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草品種鑒定的分子標(biāo)記方法，其特征在于： 1、 用新型廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒（型號(hào):HF213)提取'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷 草葉片DNA; 2、 用標(biāo)記引物Me lEml的左端引物序列5 ' -TGAGTCCAAACCGGATA-3 '和右端引物序列5 ' -GACTGCGTACGAATTCAA-3 '對(duì)'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草葉片分離的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，在100~700bp范 圍內(nèi)，能擴(kuò)增出且只能擴(kuò)增出130bp、180bp、210bp、220bp、280bp、350bp、360bp、460bp、 490bp 和 550bp 共 10 個(gè) DNA 片段； 用標(biāo)記引物Me6Em2的左端引物序列5 ' -TGAGTCCAAACCGGAGA-3 '和右端引物序列5 ' -GACTGCGTACGAATTCTG-3 '對(duì)'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草葉片分離的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，在100~500bp范 圍內(nèi)，能擴(kuò)增出且只能擴(kuò)增出 140bp、150bp、170bp、220bp、310bp、320bp、420bp、440bp和 480bp共9個(gè)DNA片段； 用標(biāo)記引物Me6Em7的左端引物序列5 ' -TGAGTCCAAACCGGAGA-3 '和右端引物序列5 ' -GACTGCGTACGAATTGAG-3'對(duì)'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草葉片分離的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，在100~lOOObp 范圍內(nèi)，能擴(kuò)增出且只能擴(kuò)增出 180bp、200bp、280bp、305bp、320bp、330bp、350bp、410bp、 490bp、500bp、600bp共 11 個(gè)DNA片段； 同時(shí)用以上3對(duì)引物對(duì)某一結(jié)縷草的葉片DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并且每對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果與權(quán) 利要求1所述的擴(kuò)增片段及其大小完全一致，則表明該結(jié)縷草品種為'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷 草，否則為其它品種； 3、 上述的對(duì)'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草葉片分離的DNA進(jìn)行擴(kuò)增及其產(chǎn)物的檢測(cè)方法如下： SRAP-PCR采用lOyL的反應(yīng)體系，其中包括：50ng模板DNA，10XPCR緩沖液，Mg2+ 1.5mmol · L-IdNTPs 200μπιο1 · L-S 弓丨物0.2 μπιο? · L-、Taq DNA聚合酶 0.5 U; SRAP-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性4min;94°C變性lmin，37°C退火lmin，72°C延伸 1〇86〇,5個(gè)循環(huán);94°(^變性1111；[11，50°(^退火1111；[11，72°(^延伸10860，35個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束后72°0 延伸7min，4°C保存； 擴(kuò)增反應(yīng)在英國(guó)TECHNE公司的TC-412型PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)10%的聚丙烯酰胺 凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)銀染技術(shù)進(jìn)行染色； 有益效果： 1、 本發(fā)明通過(guò)直接檢測(cè)'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草的DNA序列對(duì)其進(jìn)行鑒定，它克服了根據(jù) 外部形態(tài)鑒定的不確定性，該方法對(duì)'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草的鑒別更可靠、準(zhǔn)確、重復(fù)性高； 2、 本發(fā)明為'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草新品種的專利保護(hù)提供了客觀科學(xué)的技術(shù)保障； 3、 本發(fā)明為'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草推廣應(yīng)用中的品種鑒定提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
[0004] 四、【附圖說(shuō)明】： 圖1: SRAP標(biāo)記引物MelEml對(duì)'蘇植3號(hào)'雜交結(jié)縷草的擴(kuò)增圖譜 圖2:SRAP標(biāo)記引物MelEm