本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種先天性axenfeld-rieger綜合征致病基因快速檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

axenfeld-rieger綜合征（axenfeld-riegersyndrome,ars）是一種有特定臨床表型的常染色體顯性遺傳病，該病具有完全外顯率和遺傳異質(zhì)性，該病發(fā)病率為1:200000，大部分為遺傳因素所致，發(fā)病的男女比例相等，一般均為雙眼發(fā)病，對(duì)患者本人及整個(gè)家庭帶來(lái)嚴(yán)重的影響。

ars一般特征主要表現(xiàn)為角膜后胚胎環(huán)、虹膜異常、青光眼及視力減退和全身異常。特征性的臨床表現(xiàn)為眼前段異常，包括角膜后胚胎環(huán)、虹膜發(fā)育不良和瞳孔異位，合并有面部畸形、牙齒發(fā)育不良和肚臍發(fā)育畸形。部分患者還伴有如下全身癥狀：中耳耳聾、心血管缺陷、尿道下裂、垂體腺異常、智力低下以及生長(zhǎng)遲緩等癥狀。

近幾年，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對(duì)遺傳性疾病的認(rèn)識(shí)不斷加深。通過(guò)早期篩查axenfeld-rieger綜合征的致病基因，對(duì)患病胎兒選擇性終止妊娠是幫助ars家系成員生育健康后代的可行辦法。

由于axenfeld-rieger綜合征臨床表型多樣，涉及多個(gè)器官，對(duì)該疾病的診斷較為困難，臨床上經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)誤診，目前國(guó)際上對(duì)于先天性axenfeld-rieger綜合征的檢測(cè)尚無(wú)一種快速精準(zhǔn)的檢測(cè)方法。

有鑒于此，本案發(fā)明人曾于專利號(hào)為zl201410057930.0的發(fā)明專利中提出了一種先天性axenfeld-rieger綜合征常見基因突變位點(diǎn)的一次性檢測(cè)試劑盒，其以pitx2基因c.77dela位點(diǎn)為檢測(cè)對(duì)象，應(yīng)用pcr擴(kuò)增的方法，獲得檢測(cè)結(jié)果。但是經(jīng)過(guò)大樣本臨床驗(yàn)證，上述試劑盒的檢測(cè)結(jié)果，出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而且未涵蓋另一個(gè)該遺傳性疾病的高致病基因foxc1的突變位點(diǎn)。

因此，如何開發(fā)出具有更高檢測(cè)效率，更高準(zhǔn)確性，更大檢測(cè)通量的先天遺傳性axenfeld-rieger綜合征基因篩選技術(shù)，實(shí)現(xiàn)臨床快速檢測(cè)或規(guī)?；巳汉Y查，仍是業(yè)界需要解決的重要技術(shù)問(wèn)題之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種先天性axenfeld–rieger綜合征致病基因快速檢測(cè)試劑盒，該試劑盒直接對(duì)患者血液中提取的dna中pitx2基因及foxc1基因，進(jìn)行突變檢測(cè)，克服了現(xiàn)有基因檢測(cè)技術(shù)中的缺點(diǎn)，能夠快速精確地診斷先天性axenfeld-rieger綜合征，為先天性axenfeld–rieger綜合征的基因診斷工作帶來(lái)了顯著的便利。

此外，本發(fā)明涵蓋了最新研究的一個(gè)先天性axenfeld-rieger綜合征致病基因foxc1的c.1121dupcgggcggcggcggcggcgg插入突變，結(jié)合該國(guó)際首次報(bào)道突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)一種全面快速精準(zhǔn)檢測(cè)試劑盒，能夠更精確地診斷先天性axenfeld-rieger綜合征，從而極大地降低漏檢率，并能與其他遺傳性疾病進(jìn)行鑒別。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種先天性axenfeld–rieger綜合征致病基因快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括以下組分：以pitx2基因及foxc1基因突變位點(diǎn)為檢測(cè)對(duì)象而設(shè)計(jì)的五對(duì)特異性引物，（1）tcatcttcctgtcaccatcc（seqidno.1），cgctccctctttctccattt（seqidno.2）；（2）agtaggcgcctaacagctag（seqidno.3）tctgatttccttcctgccca（seqidno.4）；（3）agttcctgcaaggcggtct（seqidno.5），accttgacgaagcactcgtt（seqidno.6）；（4）agttcatcatggaccgcttc（seqidno.7）,agctgtagagggagctctgg（seqidno.8）；（5）ctcagctccggccttctg（seqidno.9）,caagtggcccaggtctcc（seqidno.10）。

該試劑盒檢測(cè)針對(duì)的pitx2基因突變位點(diǎn)為：e55x突變、f58l突變、p64r突變、p64l突變、u83l突變、w86c突變、r90p突變、l105u突變、n108t突變、y121x突變、g137u突變、77dela突變；針對(duì)foxc1基因突變位點(diǎn)為：q2x突變、q23x突變、s48x突變、p79t突變、p79r突變、s82t突變、a85p突變、l86f突變、i87m突變、i91t突變、i91s突變、y115s突變、i126m突變、r127h突變、l130f突變、g149d突變、w152x突變、m161k突變、m161u突變、g165r突變、r169p突變、p297s突變、c.1121dupcgggcggcggcggcggcgg突變。

該試劑盒還包括以下組分：三磷酸脫氧核苷dntp，taqdna聚合酶，dna模板，10×buffer。

該試劑盒需進(jìn)行pcr反應(yīng)，pcr條件為94℃預(yù)變性4min；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃預(yù)變性35s，55~65℃退火30s；72℃延伸46s；最后72℃延伸10min。

在本發(fā)明中，本案發(fā)明人經(jīng)大量研究和實(shí)踐，對(duì)中國(guó)先天性axenfeld-rieger綜合征基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行了篩選和組合，并優(yōu)化了部分pcr引物，構(gòu)建了本發(fā)明的試劑盒。利用該試劑盒，可針對(duì)多達(dá)35個(gè)特異性axenfeld-rieger綜合征基因突變位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，尤其是新增了1個(gè)國(guó)際首次報(bào)道位點(diǎn)，詳見表一。該試劑盒成本低，檢測(cè)通量和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性等較之zl201410057930.0所提供的試劑盒均有大幅提升，檢測(cè)通量從1個(gè)位點(diǎn)提高到35個(gè)位點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度可達(dá)到近100%，降低了假陰性率，具有較高的規(guī)模化臨床應(yīng)用價(jià)值。

表一：pitx2/foxc1突變位點(diǎn)及相應(yīng)pcr引物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：可以非常迅速的進(jìn)行先天性axenfeld-rieger綜合征的pitx2基因及foxc1基因檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直接、準(zhǔn)確，成本低，特別適合臨床推廣應(yīng)用，為臨床和科研工作提供了一種非常有價(jià)值的檢測(cè)方法。

附圖說(shuō)明

圖1（a、b、c、d）為先天性axenfeld–rieger綜合征不同的臨床表現(xiàn)。

圖2為pitx2基因各突變位點(diǎn)。

圖3為foxc1基因各突變位點(diǎn)。

圖4為foxc1基因第1121位點(diǎn)突變pcr電泳圖。

圖5為foxc1基因第1121位點(diǎn)突變測(cè)序結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明保護(hù)范圍不僅局限于以下內(nèi)容的表述。

實(shí)施例1。

將提取的基因組dna150ng以及pitx2基因及foxc1基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，pcr結(jié)束后，取5ulpcr產(chǎn)物于1.5％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。具體步驟如下。

1.引物稀釋和保存。

按照如下步驟將合成的引物稀釋為10pmol/l。

（1）按照引物合成產(chǎn)品使用說(shuō)明計(jì)算每條引物分子量、質(zhì)量數(shù)和摩爾數(shù)，從而依據(jù)所需的濃度來(lái)計(jì)算需加滅菌水（ddh2o）的量。

（2）將粉末狀的引物12000rpm/min離心數(shù)秒鐘（以免開啟時(shí)飛揚(yáng)丟失）。

（3）小心輕開裝引物的離心管，加入所要加的ddh2o。

（4）充分的振蕩、混勻。

（5）3000rpm/min離心5分鐘。

（6）放入-20℃長(zhǎng)期保存。

2.pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃預(yù)變性35s，55~65℃（根據(jù)不同的引物選擇合適的退火溫度）退火30s；72℃延伸46s；最后72℃延伸10min。

3.pcr反應(yīng)體系：25μl，如下。

4.1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定pcr產(chǎn)物。

將制作好的瓊脂糖凝膠塊放入水平電泳槽中，加樣孔端向著負(fù)極端，向電泳槽中加入電泳緩沖液(1×tae)至液面蓋過(guò)膠塊。取pcr產(chǎn)物3μl加2μl6×loadingbuffer后混勻，加入上樣孔中，2μldnamaker2000作參照。以100v電壓，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳25min，用凝膠成像系統(tǒng)紫外分析儀觀察dna電泳條帶，鑒定pcr產(chǎn)物是否為擴(kuò)增的目的片段。

5.將所得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。

6.測(cè)序圖譜分析軟件聯(lián)合ucsc基因庫(kù)序列分析確認(rèn)突變位置。

實(shí)施例2。

1.將foxc1基因第1121位點(diǎn)引物f:ctcagctccggccttctg，r:caagtggcccaggtctcc；稀釋成10pmol/l并于-20℃長(zhǎng)期保存。

2.pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃預(yù)變性35s，59℃，退火30s；72℃延伸46s；最后72℃延伸10min。

3.pcr反應(yīng)體系：25μl，如下。

4.1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定pcr產(chǎn)物：取pcr產(chǎn)物3μl加2μl6×loadingbuffer后混勻，加入上樣孔中，2μldnamaker作參照。以100v電壓，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳25min，用凝膠成像系統(tǒng)紫外分析儀觀察dna電泳條帶，鑒定pcr產(chǎn)物是否為擴(kuò)增的目的片段，如圖4所示為foxc1基因第1121位點(diǎn)突變pcr電泳結(jié)果。

5.將所得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，如圖5所示為foxc1基因第1121位點(diǎn)突變pcr測(cè)序結(jié)果。

6.測(cè)序圖譜分析軟件聯(lián)合ucsc基因庫(kù)序列分析確認(rèn)突變位置。

sequencelisting

<110>胡瑩

<120>一種先天性axenfeld-rieger綜合征致病基因快速檢測(cè)試劑盒

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