本發(fā)明涉及一種制備蜂毒肽的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蜂毒是工蜂毒腺分泌的一種具有芳香氣味的透明液體，主要由多肽類、活性酶類、非肽類物質(zhì)組成，蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)是蜂毒中的主要成分，約占蜂毒的70%-80%。蜂毒肽是由26個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，分子量為2840da，約占蜂毒干重的50%，其一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸殘基序列為nh2-gly-ile-gly-ala-val-leu-lys-val-leu-thr-thr-glu-leu-pro-ala-leu-ile-ser-trp-ile-lys-arg-lys-arg-glu-gln-cooh。蜂毒肽具有抗炎、抑菌、抗癌、抗輻射、抑制血小板凝集等作用，可有效地治療肩周炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用。

蜂毒肽是從蜂毒中分離純化得來(lái)的，具有生物活性高、不污染環(huán)境等特點(diǎn)，可以研制開(kāi)發(fā)出機(jī)體免疫調(diào)節(jié)劑等產(chǎn)品，具有很大的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景，因而引起了學(xué)術(shù)界廣泛的關(guān)注。

用溶媒萃取、三柱層析、溶媒萃取與三柱層析相結(jié)合等方法制備蜂毒肽，其產(chǎn)品制備過(guò)程繁瑣，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，有機(jī)溶劑使用量大。kreil（kreil,g.structureofmelittinisolatedfromtwospeciesofhoneybees[j].febsletters,1973,33(2):241-244.）報(bào)道了溶媒萃取制備蜂毒肽的方法，蜂毒肽得率約為20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），純度在60.3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），制備方法簡(jiǎn)便，提取1g蜂毒肽需要200ml正丁醇，正丁醇的需求量大，造成環(huán)境的嚴(yán)重污染。劉嶺和楊文超（1.劉嶺,李昌全,黃雪強(qiáng).蜂毒素的純化方法及體外抗腫瘤作用研究[j].中國(guó)生化藥物雜質(zhì).2003,24（4）：16-172.楊文超,蜂毒肽的分離純化及其抗輻射作用機(jī)理研究[d],福建農(nóng)林大學(xué),2007.）報(bào)道了三柱層析法制備蜂毒肽，蜂毒肽得率約為48.67%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），純度為97.32%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），純度較高，解決了有機(jī)溶劑用量大的問(wèn)題，但是提取過(guò)程復(fù)雜，提取時(shí)間較長(zhǎng)。張文禮和徐彭（1.張文禮,孫井元.蜂毒肽的分離提純方法[p],中國(guó),101089017a.2007-12-19.2.徐彭,歐陽(yáng)永偉,黃敬耀,張桂英,肖誠(chéng),劉波.從蜂毒中分離純化蜂毒肽的實(shí)驗(yàn)研究.中草藥[j].2000,31(12):892-894.）報(bào)道了溶媒萃取與層析法相結(jié)合制備蜂毒肽，蜂毒肽得率約為47%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），純度為電泳純，縮短了三柱層析法所需時(shí)間，與kreil（kreil,g.structureofmelittinisolatedfromtwospeciesofhoneybees[j].febsletters,1973,33(2):241-244.）的制備方法相比較，減少了正丁醇的使用量，但在提取過(guò)程中仍需大量的正丁醇，不利于環(huán)境保護(hù)。

上述分離純化方法生產(chǎn)工藝復(fù)雜，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，得率低，純度低，且污染嚴(yán)重。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服蜂毒肽現(xiàn)有分離純化技術(shù)的不足，提供一種快速制備蜂毒肽的方法，該方法所制備的蜂毒肽，得率高，純度高，周期短，能耗低，污染小的制備蜂毒肽的方法。

本發(fā)明獲得蜂毒肽的提取率質(zhì)量分?jǐn)?shù)為49%，純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%。

本發(fā)明的一種制備蜂毒肽的方法，步驟如下：

①蜂毒的除雜

將粗蜂毒加入到ph為4.0-5.5的緩沖溶液中，使其濃度為0.5-1.5mg/ml，以2500-3500r/min離心3-7min去除不溶性的雜質(zhì)，得上清液；

所述粗蜂毒是將蜜蜂蟄刺排出的毒液用蒸餾水溶解，經(jīng)冷凍干燥所得；

所述緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；

所述除雜為除去不溶于緩沖溶液的物質(zhì)。

②蜂毒肽的分離

將①中所得上清液過(guò)葡聚糖凝膠g-25柱，用蒸餾水洗脫，流速控制在25-30ml/h，測(cè)定各分離組分的分子量，在葡聚糖凝膠柱下收集分子量為2840da的層析組分經(jīng)冷凍干燥得固體樣品；

所述葡聚糖凝膠g-25為葡聚糖用英文字母g表示，g反映凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分布范圍，25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克；

所述洗脫為以蒸餾水作為流動(dòng)相連續(xù)通過(guò)色譜柱固定相，流動(dòng)相與固定相作用力比樣品弱，樣品各組分按先后順序從固定相洗出；

所述分子量的測(cè)定為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品洗脫保留時(shí)間t(min)與其相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值(lgmr)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)品為抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品（mr=1422da）、氧化性谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品(mr=612da)、還原性谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品(mr=307.32da)。

所述da為蜂毒肽分子量的單位；

所述冷凍干燥為將所得組分冷凍至水的冰點(diǎn)以下，并置于高真空(10-40pa)的容器中，通過(guò)供熱使物料中的水分直接從固態(tài)冰升華為水汽的一種干燥方法。

③蜂毒肽的純化

將②中冷凍干燥所得的固體用2-4倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行溶解，經(jīng)2500-3500r/min離心4-6min，沉淀物質(zhì)即為蜂毒肽。

所述沉淀為不溶于無(wú)水乙醇的固體物質(zhì)。

采用本方法生產(chǎn)蜂毒肽，簡(jiǎn)化了蜂毒肽的提取工藝，與現(xiàn)有方法相比生產(chǎn)周期減少1-2天，得率提高1-2%，降低了制備成本，蜂毒肽純度可達(dá)到電泳純。

與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明制備蜂毒肽的方法，具有以下顯著特點(diǎn)：

（1）采用葡聚糖凝膠g-25柱，進(jìn)行分離處理；

（2）本發(fā)明獲得蜂毒肽相對(duì)于劉嶺、楊文超、張文禮、徐彭（1.劉嶺,李昌全,黃雪強(qiáng).蜂毒素的純化方法及體外抗腫瘤作用研究.中國(guó)生化藥物雜質(zhì)[j].2003,24（4）：16-172.楊文超,蜂毒肽的分離純化及其抗輻射作用機(jī)理研究[d],福建農(nóng)林大學(xué),2007.3.張文禮,孫井元.蜂毒肽的分離提純方法:中國(guó),101089017a[p].2007-12-19.4.徐彭,歐陽(yáng)永偉,黃敬耀,張桂英,肖誠(chéng),劉波.從蜂毒中分離純化蜂毒肽的實(shí)驗(yàn)研究.中草藥[j].2000,31(12):892-894.），得率提高到1-2%，制備時(shí)間縮短2-3天。

（3）本發(fā)明獲得蜂毒肽的純度達(dá)到了電泳純。

實(shí)施例1：

①蜂毒的除雜

將粗蜂毒加入到ph為4.75的緩沖溶液中，使其濃度為1.0mg/ml，以3000r/min離心5min去除不溶性的雜質(zhì)，得上清液；

所述粗蜂毒是將蜜蜂蟄刺排出的毒液用蒸餾水溶解，經(jīng)冷凍干燥所得；

所述緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；

所述除雜為除去不溶于緩沖溶液的物質(zhì)。

②蜂毒肽的分離

將①中所得上清液過(guò)葡聚糖凝膠g-25柱，用蒸餾水洗脫，流速控制在28ml/h，測(cè)定各分離組分的分子量，在葡聚糖凝膠柱下收集分子量為2840da的層析組分經(jīng)冷凍干燥得固體樣品；

所述葡聚糖凝膠g-25為葡聚糖用英文字母g表示，g反映凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分布范圍，25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克；

所述洗脫為以蒸餾水作為流動(dòng)相連續(xù)通過(guò)色譜柱固定相，流動(dòng)相與固定相作用力比樣品弱，樣品各組分按先后順序從固定相洗出；

所述分子量的測(cè)定為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品洗脫保留時(shí)間t(min)與其相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值(lgmr)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)品為抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品（mr=1422da）、氧化性谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品(mr=612da)、還原性谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品(mr=307.32da)。

所述da為蜂毒肽分子量的單位；

所述冷凍干燥為將所得組分冷凍至水的冰點(diǎn)以下，并置于高真空(10-40pa)的容器中，通過(guò)供熱使物料中的水分直接從固態(tài)冰升華為水汽的一種干燥方法。

③蜂毒肽的純化

將②中冷凍干燥所得的固體用3倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行溶解，經(jīng)3000r/min離心5min，沉淀物質(zhì)即為蜂毒肽。

所述沉淀為不溶于無(wú)水乙醇的固體物質(zhì)。

當(dāng)前發(fā)明獲得蜂毒肽的提取率質(zhì)量分?jǐn)?shù)為49%，純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%。

實(shí)施例2：

①蜂毒的除雜

將粗蜂毒加入到ph為5.25的緩沖溶液中，1.5mg/ml，以3200r/min離心6min去除不溶性的雜質(zhì)，得上清液；

所述粗蜂毒是將蜜蜂蟄刺排出的毒液用蒸餾水溶解，經(jīng)冷凍干燥所得；

所述緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；

所述除雜為除去不溶于緩沖溶液的物質(zhì)。

②蜂毒肽的分離

將①中所得上清液過(guò)葡聚糖凝膠g-25柱，用蒸餾水洗脫，流速控制在30ml/h，測(cè)定各分離組分的分子量，在葡聚糖凝膠柱下收集分子量為2840da的層析組分經(jīng)冷凍干燥得固體樣品；

所述葡聚糖凝膠g-25為葡聚糖用英文字母g表示，g反映凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分布范圍，25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克；

所述洗脫為以蒸餾水作為流動(dòng)相連續(xù)通過(guò)色譜柱固定相，流動(dòng)相與固定相作用力比樣品弱，樣品各組分按先后順序從固定相洗出；

所述分子量的測(cè)定為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品洗脫保留時(shí)間t(min)與其相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值(lgmr)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)品為抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品（mr=1422da）、氧化性谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品(mr=612da)、還原性谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品(mr=307.32da)。

所述da為蜂毒肽分子量的單位；

所述冷凍干燥為將所得組分冷凍至水的冰點(diǎn)以下，并置于高真空(10-40pa)的容器中，通過(guò)供熱使物料中的水分直接從固態(tài)冰升華為水汽的一種干燥方法。

③蜂毒肽的純化

將②中冷凍干燥所得的固體用4倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行溶解，經(jīng)3200r/min離心6min，沉淀物質(zhì)即為蜂毒肽。

所述沉淀為不溶于無(wú)水乙醇的固體物質(zhì)。

當(dāng)前發(fā)明獲得蜂毒肽的提取率質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.65%，純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.21%。

實(shí)施例3：

①蜂毒的除雜

將粗蜂毒加入到ph為4.5的緩沖溶液中，0.5mg/ml，以2800r/min離心4min去除不溶性的雜質(zhì)，得上清液；

所述粗蜂毒是將蜜蜂蟄刺排出的毒液用蒸餾水溶解，經(jīng)冷凍干燥所得；

所述緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；

所述除雜為除去不溶于緩沖溶液的物質(zhì)。

②蜂毒肽的分離

將①中所得上清液過(guò)葡聚糖凝膠g-25柱，用蒸餾水洗脫，流速控制在26ml/h，測(cè)定各分離組分的分子量，在葡聚糖凝膠柱下收集分子量為2840da的層析組分經(jīng)冷凍干燥得固體樣品；

所述葡聚糖凝膠g-25為葡聚糖用英文字母g表示，g反映凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分布范圍，25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克；

所述洗脫為以蒸餾水作為流動(dòng)相連續(xù)通過(guò)色譜柱固定相，流動(dòng)相與固定相作用力比樣品弱，樣品各組分按先后順序從固定相洗出；

所述分子量的測(cè)定為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品洗脫保留時(shí)間t(min)與其相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值(lgmr)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)品為抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品（mr=1422da）、氧化性谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品(mr=612da)、還原性谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品(mr=307.32da)。

所述da為蜂毒肽分子量的單位；

所述冷凍干燥為將所得組分冷凍至水的冰點(diǎn)以下，并置于高真空(10-40pa)的容器中，通過(guò)供熱使物料中的水分直接從固態(tài)冰升華為水汽的一種干燥方法。

③蜂毒肽的純化

將②中冷凍干燥所得的固體用2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行溶解，經(jīng)2800r/min離心4min，沉淀物質(zhì)即為蜂毒肽。

所述沉淀為不溶于無(wú)水乙醇的固體物質(zhì)。

當(dāng)前發(fā)明獲得蜂毒肽的提取率質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.76%，純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.64%。