專利名稱：蜂毒肽的分離提純方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蜂毒肽的分離提取工藝，特別是用粗蜂毒分離提取蜂毒肽的方法。
背景技術(shù)：
在蜂毒的眾多成份中，以蜂毒肽(melittin)的含量最高，生物活性最強(qiáng)，具有最為廣闊的臨床前景。國(guó)內(nèi)外雖有其分離提純方法的報(bào)道，但工藝復(fù)雜，條件苛刻，難以大量生產(chǎn)；且生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，一般至少需3天；產(chǎn)品損失嚴(yán)重，蜂毒肽收率僅30％左右，提取純化成本高。已經(jīng)公開的專利號(hào)92114271.4“從蜂毒中快速分離蜂肽的方法”，是將粗蜂毒溶解在水中后，使用超濾膜和透析袋使蜂肽分離出來，超濾膜的截流分子量為5000以上，透析袋截流分子量為1000，該方法目的是分離出大分子量可引起過敏反應(yīng)的非蛋白物質(zhì)，如采用該方法，蜂毒肽四聚體(分子量為11360)在分離初期就被截流掉，而蜂毒肽四聚體在蜂毒中約占10～20％，所以使得蜂毒肽的提取率比理論提取率低20～30％；該方法為分離方法，蜂毒肽純度達(dá)不到電泳級(jí)純度，因此應(yīng)用領(lǐng)域大大受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，對(duì)現(xiàn)有層析分離法進(jìn)行改進(jìn)，提供一種工藝步驟相對(duì)少，在提取純化過程中蜂毒肽損失少，即收率高，生產(chǎn)周期短，提純后的蜂毒肽純度達(dá)電泳級(jí)的蜂毒肽分離提純方法。
本發(fā)明方法是將粗蜂毒用水浸洗，溶媒萃取、凝膠過濾柱層析的方法，從蜂毒中提取蜂毒肽，其特征是
1)將粗蜂毒加水浸洗，去除不溶物雜質(zhì)，濾液用乙醇沉淀，去除乙醇水液，沉淀物1加入氫氧化銨與正丁醇溶液萃取，棄除沉淀，蒸餾回收正丁醇，濃縮物加丙酮沉淀得沉淀物2；2)將沉淀物2溶解于脲的醋酸鹽緩沖液A中，在離子交換凝膠CM-Sephrose.FF柱上，用緩沖液A梯度洗脫層析；3)在離子交換凝膠柱下收集溶血活性最強(qiáng)的吸收峰V時(shí)的層析餾份進(jìn)行濃縮，濃縮液通過葡聚糖凝膠G-10柱脫鹽，脫鹽濃縮物用丙酮沉淀得到沉淀物3；4)將沉淀物3溶于鹽酸胍、亞硫酸鈉和對(duì)氯汞苯甲酸混合溶液中，再將溶液濃縮，再通過葡聚糖凝膠柱脫鹽，用丙酮沉淀得沉淀物4；5)將沉淀物4溶解于醋酸鹽緩沖液B中，在葡聚糖凝膠G-25柱上，用緩沖液B梯度洗脫層析，在柱下收集溶血活性最強(qiáng)的吸收峰II時(shí)的層析餾份進(jìn)行濃縮，于葡聚糖凝膠柱G-10上脫鹽、冷凍干燥即得到蜂毒肽。
在離子交換凝膠柱及葡聚糖凝膠柱上進(jìn)行層析時(shí)使用的緩沖液A和緩沖液B的PH為4.2～5.0，使用梯度混合儀進(jìn)行梯度洗脫。鹽酸胍、亞硫酸鈉和對(duì)氯汞苯甲酸混合溶液用0.15M的氫氧化銨調(diào)整PH值達(dá)7.0，鹽酸胍、亞硫酸鈉和對(duì)氯汞苯甲酸的濃度分別為3M、0.055M和0.0023M。在浸洗粗蜂毒時(shí)的濾液用20倍的無水乙醇沉淀；中間過程中的脫鹽、沉淀，采用3倍量的丙酮進(jìn)行沉淀。
采用本方法生產(chǎn)的蜂毒肽純度可達(dá)電泳級(jí)純度，滿足了更多領(lǐng)域特別是臨床應(yīng)用的技術(shù)要求；蜂毒肽的提取率比現(xiàn)有方法均高出7～8％，工藝步驟減化，提純生產(chǎn)周期比原來減少1.5～2天，提純成本比原來降低約30％。
下面根據(jù)工藝圖示結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。
附圖
為本發(fā)明工藝流程示意圖。
取粗蜂毒20g加入100ml蒸餾水分三次浸洗，用中性濾紙過濾，蜜蜂蟄針等不溶物雜質(zhì)棄除。濾液用20倍無水乙醇沉淀，去除乙醇水液，沉淀物1溶于1200ml 0.15M的氫氧化銨中，再加入800ml正丁醇振搖2hr。用分液漏斗分離，沉淀物棄除，蒸餾回收萃取液中正丁醇，濃縮物用三倍的丙酮沉淀；沉淀物2溶解于1000mL含有4mol/L脲的醋酸鹽緩沖液中，PH為4.75，此為緩沖液A，上離子交換凝膠CM-Sephrose.FF柱，用緩沖液A+0.5mol/L氯化鈉進(jìn)行梯度洗脫。洗脫液以溶血試驗(yàn)進(jìn)行蜂毒肽的生物活性跟蹤，在離子凝膠柱下收集溶血活性作用最強(qiáng)的吸收峰V時(shí)的層析餾份共1000ml，蒸發(fā)濃縮至100ml。濃縮液通過葡聚糖凝膠G-10柱脫鹽，脫鹽濃縮物用三倍的丙酮沉淀。沉淀物3溶解于2000mL的含有3mol/L鹽酸胍、55mmol/L亞硫酸鈉和2.3mmol/L對(duì)氯汞苯甲酸的溶液中，整個(gè)溶液用NH4OH調(diào)到pH7.0，在37±2℃下保溫2hr，蒸發(fā)濃縮溶液至200ml，再通過葡聚糖凝膠柱G-10脫鹽，用3倍的丙酮沉淀。沉淀物4溶解于500mL醋酸銨緩沖液(0.05mol/L，pH4.75，此為緩沖液B)中，上葡聚糖凝膠G-25柱，用緩沖液B進(jìn)行梯度洗脫(用梯度混合器)，洗脫液以溶血試驗(yàn)進(jìn)行蜂毒肽的活性跟蹤，柱下收集溶血活性作用最強(qiáng)的吸收峰II時(shí)的層析餾份共800ml，濃縮至100ml，用葡聚糖凝膠G-10柱脫鹽，冷凍干燥，最后得到凍干物蜂毒肽9.4g。產(chǎn)物蜂毒肽的收率為4 7％。
權(quán)利要求
1.一種蜂毒肽的分離提純方法，是將粗蜂毒用水浸洗，溶媒萃取、凝膠過濾柱層析的方法，從蜂毒中提取蜂毒肽，其特征是1)將粗蜂毒加水浸洗，去除不溶物雜質(zhì)，濾液用乙醇沉淀，去除乙醇水液，沉淀物1加入氫氧化銨與正丁醇溶液萃取，棄除沉淀，蒸餾回收正丁醇，濃縮物加丙酮沉淀得沉淀物2；2)將沉淀物2溶解于脲的醋酸鹽緩沖液A中，在離子交換凝膠CM-Sephrose.FF柱上，用緩沖液A梯度洗脫層析；3)在離子交換凝膠柱下收集溶血活性最強(qiáng)的吸收峰V時(shí)的層析餾份進(jìn)行濃縮，濃縮液通過葡聚糖凝膠G-10柱脫鹽，脫鹽濃縮物用丙酮沉淀得到沉淀物3；4)將沉淀物3溶于鹽酸胍、亞硫酸鈉和對(duì)氯汞苯甲酸混合溶液中，再將溶液濃縮，通過葡聚糖凝膠柱脫鹽，用丙酮沉淀得沉淀物4；5)將沉淀物4溶解于醋酸鹽緩沖液B中，在葡聚糖凝膠G-25柱上，用緩沖液B梯度洗脫層析，在柱下收集溶血活性最強(qiáng)的吸收峰II時(shí)的層析餾份進(jìn)行濃縮，于葡聚糖凝膠柱G-10上脫鹽、冷凍干燥即得到蜂毒肽。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是緩沖液A和緩沖液B的PH＝4.2～5.0，鹽酸胍、亞硫酸鈉和對(duì)氯汞苯甲酸混合溶液用0.15M氫氧化銨調(diào)整PH達(dá)7.0。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是浸洗粗蜂毒濾液用20倍無水乙醇沉淀，中間過程中脫鹽、沉淀采用3倍量的丙酮進(jìn)行沉淀。
全文摘要
一種蜂毒肽的分離提純方法，是將粗蜂毒用水浸洗，濾液用乙醇沉淀，沉淀物用氫氧化銨及正丁醇萃取，萃取液濃縮后以丙酮沉淀，沉淀物溶于脲的醋酸鹽緩沖液A中，在離子交換凝膠柱上作梯度洗脫層析，柱下收集溶血活性最強(qiáng)吸收蜂V的層析餾份濃縮，濃縮液經(jīng)葡聚糖凝膠G－10柱脫鹽，丙酮沉淀，再溶解、脫鹽沉淀處理，沉淀物溶于醋酸鹽緩沖液B中，在葡聚糖凝膠G－25柱上以緩沖B液作梯度洗脫，柱下收集吸收蜂II時(shí)層析餾份濃縮、脫鹽冷凍干燥即得到電泳級(jí)蜂毒肽。本發(fā)明工藝減化后生產(chǎn)周期縮短1.5～2天，蜂毒肽收率比現(xiàn)有方法提高7～8％，提純成本降低約30％，實(shí)現(xiàn)了蜂毒肽的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101089017SQ20061004695
公開日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2006年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月16日
發(fā)明者張文禮, 孫井元 申請(qǐng)人:張文禮