專利名稱：一種bodipy類熒光試劑在生物大分子標(biāo)記中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物大分子的標(biāo)記，具體地說是一種BODIPY類熒光試劑在生物大分子標(biāo)記中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的標(biāo)記蛋白的熒光染料如熒光素異硫氰酯(FITC)、4-氟-7-硝基苯并噁二唑(NBD-F)、3-呋喃甲酰喹啉-2-羰醛(FQ)、丹磺酰氯、熒光胺、和鄰苯二甲醛(OPA)。這些試劑雖然也可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記，但是標(biāo)記反應(yīng)大都缺少選擇性，過多的標(biāo)記位點(diǎn)造成對(duì)蛋白質(zhì)分子量有較大的變化，給蛋白的分離、定性帶來困難。另外有些熒光試劑對(duì)溶液的pH值十分敏感如熒光素異硫氰酯(FITC)，而有些熒光試劑標(biāo)記反應(yīng)需要避光進(jìn)行如丹磺酰氯。
BODIPY類染料由于開發(fā)較晚，現(xiàn)在應(yīng)用不是很廣泛，但是由于其熒光量子產(chǎn)率高，其熒光范圍隨取代基的不同變化很大，并且其熒光不受環(huán)境pH的影響，它的性能受到普遍公認(rèn)。環(huán)氧基官能團(tuán)能與親核試劑發(fā)生開環(huán)反應(yīng)生成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，可用于標(biāo)記反應(yīng)的活性反應(yīng)基團(tuán)。目前，尚未有以環(huán)氧環(huán)為活性反應(yīng)基團(tuán)的BODIPY類熒光標(biāo)記試劑出現(xiàn)，來應(yīng)用于蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的熒光標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種BODIPY類熒光試劑在生物大分子標(biāo)記中的應(yīng)用，其為以環(huán)氧環(huán)為活性反應(yīng)基團(tuán)的新型BODIPY類熒光標(biāo)記試劑，利用BODIPY母體分子中的活性環(huán)氧基團(tuán)，在緩沖溶液中實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)的熒光標(biāo)記。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種BODIPY類熒光試劑在生物大分子標(biāo)記中的應(yīng)用，所述試劑化合物由1，3，5，7-四甲基-二氟化硼-二吡咯甲烷骨架，及帶有可與被標(biāo)識(shí)物質(zhì)結(jié)合的活性環(huán)氧基團(tuán)的取代基形成，其結(jié)構(gòu)如通式[1]所示， [1]式中R表示帶有環(huán)氧基的芳基、雜環(huán)基或烴基等取代基。
如所述熒光試劑為1，3，5，7-四甲基-8-苯基-(4-氧基-(3-環(huán)氧丙基))-二氟化硼-二吡咯甲烷(TMEPBODIPY)，其結(jié)構(gòu)式為 或熒光試劑化合物中的R基為3-環(huán)氧丙基苯醚基的化合物。
所述熒光試劑可以作為柱前或泳前熒光標(biāo)記試劑應(yīng)用于高效液相色譜、平板電泳(SDS-PAGE)、毛細(xì)管電泳、電色譜、微流控芯片或熒光免疫分析實(shí)驗(yàn)等領(lǐng)域中，對(duì)生物大分子進(jìn)行分離檢測(cè)。本發(fā)明的熒光試劑可作為一般的熒光試劑使用，也可作為柱前或泳前熒光衍生化試劑，通過熒光標(biāo)記可以大大提高被分析物的檢測(cè)靈敏度。
本發(fā)明新型BODIPY類熒光試劑利用環(huán)氧基活性基團(tuán)與不同環(huán)境下氨基等官能團(tuán)的反應(yīng)活性不同，可通過改變標(biāo)記反應(yīng)各種緩沖體系中的各種條件(如時(shí)間、溫度、pH等條件)來實(shí)現(xiàn)選擇性的對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、DNA或細(xì)胞等生物大分子物質(zhì)的熒光標(biāo)記。
下面以TMEPBODIPY(1，3，5，7-四甲基-8-苯基-(4-氧基-(3-環(huán)氧丙基))-二氟化硼-二吡咯甲烷)為例說明本發(fā)明新型熒光試劑的制備，其可按下述步驟進(jìn)行a)以路易斯酸為催化劑，采用對(duì)羥基苯甲醛與2，4-二甲基吡咯在二氯甲烷溶劑中，常壓下于氮?dú)獗Ｗo(hù)及水浴30-40℃條件下，攪拌反應(yīng)10-12h，待反應(yīng)完全后蒸干溶劑，將剩余物溶解在甲苯中，加入四氯苯醌，室溫下攪拌反應(yīng)2-3h，加入三乙胺攪拌5-10min，終止反應(yīng)，并加入三氟化硼的乙醚溶液，攪拌反應(yīng)10-30min。柱分離(洗脫液為10∶1～1∶10(v/v)的乙酸乙酯-石油醚溶液)得到化合物羥基BODIPY(1，3，5，7-四甲基-8-苯基-(4-羥基)-二氟化硼-二吡咯甲烷)；其中對(duì)羥基苯甲醛、2，4-二甲基吡咯之間的質(zhì)量比范圍可為1∶1～10∶1。
b)以路易斯堿為催化劑，將步驟1產(chǎn)物羥基BODIPY與環(huán)氧氯丙烷，在乙醇溶液中，于氮?dú)獗Ｗo(hù)常壓下，水浴40-60℃攪拌反應(yīng)8-10h，蒸去溶劑，用硅膠柱色譜分離純化(二氯甲烷和甲醇配比范圍為從100％的二氯甲烷至二氯甲烷∶甲醇＝1∶100(v/v))，得產(chǎn)物TMEPBODIPY，即可用于衍生化或標(biāo)記反應(yīng)實(shí)驗(yàn)；其中羥基BODIPY、環(huán)氧氯丙烷之間的質(zhì)量比范圍為1∶1～1∶100。
c)標(biāo)記反應(yīng)可在磷酸鹽、碳酸氫鹽和硼酸鹽等緩沖體系下進(jìn)行(pH為7～12)避光反應(yīng)1～12h。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明利用了BODIPY染料良好的熒光性能及環(huán)氧基官能團(tuán)與氨基等官能團(tuán)在溫和條件下即能發(fā)生親核加成反應(yīng)的性質(zhì)，合成了以環(huán)氧環(huán)為活性反應(yīng)基團(tuán)的新型BODIPY類熒光標(biāo)記試劑，熒光標(biāo)記反應(yīng)簡(jiǎn)單，標(biāo)記產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定?？蓱?yīng)用于高效液相色譜、平板電泳(SDS-PAGE)、毛細(xì)管電泳、電色譜、微流控芯片、熒光免疫分析實(shí)驗(yàn)中對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)的熒光標(biāo)記。
2、本發(fā)明由于利用環(huán)氧基活性基團(tuán)與不同緩沖環(huán)境下氨基等官能團(tuán)的反應(yīng)活性不同，實(shí)現(xiàn)了選擇性標(biāo)記，反應(yīng)選擇性的深入研究將在蛋白質(zhì)組的研究工作中具有重要的意義。
TMEPBODIPY的優(yōu)點(diǎn)1.標(biāo)記反應(yīng)位點(diǎn)可根據(jù)緩沖pH不同進(jìn)行調(diào)節(jié)，標(biāo)記產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定、在酶解條件下不會(huì)破壞環(huán)氧基團(tuán)與標(biāo)記位點(diǎn)的氨基酸殘基間形成的共價(jià)鍵。
2.檢測(cè)波長(zhǎng)與常用的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器的匹配。
3.標(biāo)記反應(yīng)條件溫和，熒光檢測(cè)下對(duì)蛋白和多肽檢測(cè)靈敏度均遠(yuǎn)高于紫外和質(zhì)譜。
4.選擇性熒光標(biāo)記和檢測(cè)可以大大簡(jiǎn)化分離的難度，可以對(duì)特定的肽段進(jìn)行有目的的檢測(cè)、富集，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)一些特殊的、低豐度蛋白的鑒定。
總之，本發(fā)明通過化學(xué)修飾反應(yīng)，首次在BODIPY母體分子中引入新型的活性環(huán)氧基團(tuán)，制備得到了以環(huán)氧環(huán)為活性反應(yīng)基團(tuán)的新型BODIPY類熒光標(biāo)記試劑。通過環(huán)氧基官能團(tuán)與氨基的親核加成反應(yīng)，可使試劑與目標(biāo)分子間形成非常穩(wěn)定的共價(jià)鍵，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的熒光標(biāo)記，標(biāo)記完成后可使目標(biāo)分子檢測(cè)靈敏度得以大大提高，通過對(duì)比TMEPBODIPY和熒光素異硫氰酯(FITC)熒光標(biāo)記BSA的酶解產(chǎn)物說明了標(biāo)記反應(yīng)選擇性的差別。對(duì)標(biāo)記反應(yīng)選擇性的深入研究將在選擇性的標(biāo)記檢測(cè)蛋白質(zhì)和多肽的研究工作中具有重要的意義。


圖1(a)為BSA高效液相色譜圖(熒光檢測(cè))；圖1(b)為TMEPBODIPY標(biāo)記牛血清白蛋白BSA高效液相色譜圖(熒光檢測(cè))；圖2為TMEPBODIPY標(biāo)記牛血清白蛋白BSA SDS-PAGE電泳圖；圖3(a)為FITC標(biāo)記牛血清白蛋白BSA酶解產(chǎn)物高效液相色譜圖；圖3(b)為TMEPBODIPY標(biāo)記牛血清白蛋白BSA酶解產(chǎn)物高效液相色譜圖；圖4環(huán)氧基與氨基酸標(biāo)記反應(yīng)示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(一)所述熒光試劑TMEPBODIPY的合成與標(biāo)記方法具體步驟如下(1)首先以2，4-二甲基吡咯、對(duì)羥基苯甲醛為原料，生成羥基BODIPY(1，3，5，7-四甲基-8-苯基-(4-羥基)-二氟化硼-二吡咯甲烷)。在裝有100mL二氯甲烷的500mL的圓底燒瓶中加入對(duì)羥基苯甲醛200mg，2，4-二甲基吡咯115mg和1mg三氟乙酸(路易斯酸)，于氮?dú)獗Ｗo(hù)常壓下，水浴35～40℃電磁攪拌反應(yīng)10-12h。待反應(yīng)完全后蒸干溶劑，將剩余物溶解在甲苯中，加入110mg的四氯苯醌，室溫下攪拌反應(yīng)2h，溶液變成黑褐色，然后加入242mg三乙胺攪拌反應(yīng)5min后，并立即加入0.5mL的三氟化硼(其中三氟化硼263mg)乙醚溶液(47％，w/w)，室溫下攪拌反應(yīng)25～35min后停止反應(yīng)，將溶劑減壓蒸干；(2)剩余物再經(jīng)過用柱色譜(200～300目)硅膠分離純化應(yīng)用下一步合成反應(yīng)，洗脫液為7∶3(v/v)的乙酸乙酯-石油醚溶液；(3)在圓底燒瓶中加入66.4mg的碘化鉀，58mg環(huán)氧氯丙烷和100mL乙醇，于50℃攪拌反應(yīng)20min。然后加入溶有34mg的羥基BODIPY和41.5mg K2CO3的乙醇溶液，在氮?dú)夥諊掠?0℃下攪拌反應(yīng)9h；(4)蒸去溶劑，剩余物以二氯甲烷作淋洗液，用柱色譜(200～300目)硅膠分離純化，得到產(chǎn)物6mg，用1mL二甲亞砜溶解，應(yīng)用于下一步標(biāo)記反應(yīng)；(5)環(huán)氧基官能團(tuán)能與目標(biāo)分子發(fā)生開環(huán)反應(yīng)生成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，從而實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記。
與蛋白的標(biāo)記反應(yīng)可在磷酸鹽、碳酸氫鹽和硼酸鹽等緩沖體系下進(jìn)行(pH為7～12)。稱取10mg的BSA，加入1mL的磷酸氫二鈉的緩沖溶液(100mM，pH為8.0)，取100μL此BSA溶液加入到1mL的離心管中，然后加入50μL TMEPBODIPY二甲亞砜溶液，然后再加入50μL磷酸氫二鈉的緩沖溶液(100mM，pH為8.0)，避光反應(yīng)12h。
(6)TMEPBODIPY標(biāo)記BSA的純化，將上述BSA標(biāo)記反應(yīng)液加入到裝有1×9cm、SephacrylTMS-200的柱子中進(jìn)行純化。洗脫液為磷酸氫二鈉的緩沖溶液(100mM，pH為8.0)。然后將主成分收集，經(jīng)超濾濃縮后即可用于液相和SDS-PAGE電泳分析。
(二)如圖1(a)和(b)所示，通過對(duì)比BSA和TMEPBODIPY標(biāo)記BSA產(chǎn)物色譜圖，可以確認(rèn)TMEPBODIPY標(biāo)記BSA產(chǎn)物的色譜峰。說明TMEPBODIPY可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行柱前熒光標(biāo)記，對(duì)比檢測(cè)響應(yīng)可以看出BSA經(jīng)TMEPBODIPY標(biāo)記后檢測(cè)靈敏度獲得大大提高。
圖1(a)和(b)的色譜分離條件Column 250×4.6mm Vydac C18(5μm)；flow rate＝1.0mL min-1；流動(dòng)相A水含0.1％TFA，流動(dòng)相B乙腈含0.1％TFA；梯度條件0min＝80％A，40min＝0％A；流速1mL/min；柱溫室溫；熒光激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為λex/λem＝500/510nm；(三)采用SDS-不連續(xù)凝膠電泳，按下述電泳條件，對(duì)TMEPBODIPY標(biāo)記純化后的BSA進(jìn)行分離，分離結(jié)果見圖2；在樣品孔I中加入了TMEPBODIPY標(biāo)記純化后的BSA，在樣品孔II中分別加入了TMEPBODIPY試劑的空白對(duì)照，在樣品孔III中加入了蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。電泳結(jié)束后，在紫外燈(300nm)下對(duì)分離膠照相，然后用考馬斯亮藍(lán)染色4-5小時(shí)，再用脫色液進(jìn)行脫色。如圖2所示，經(jīng)與相應(yīng)試劑空白對(duì)照，在1分離通道中出現(xiàn)被熒光標(biāo)記的產(chǎn)物的條帶，再與考馬斯亮藍(lán)染色后的右3號(hào)分離通道中蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)照，與牛血清白蛋白(66，200)的帶位置相一致，說明應(yīng)為熒光標(biāo)記的BSA的帶。
因此，TMEPBODIPY可以作為泳前熒光標(biāo)記試劑對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后采用平板電泳進(jìn)行分離檢測(cè)。
SDS-PAGE電泳條件2倍上樣緩沖液0.5M Tris-HCl，pH 6.8(2.0mL)，甘油(2.0mL)，20％(w/v)SDS(2.0mL)，0.1(w/v)溴酚藍(lán)(0.5mL)，2-巰基乙醇(1.0mL)，重蒸餾水(2.0mL)；SDS-PAGE條件分離膠濃度12％；濃縮膠濃度5％；圖2中I為TMEPBODIPY標(biāo)記牛血清白BSA的SDS-PAGE電泳圖；II為TMEPBODIPY的試劑空白SDS-PAGE電泳圖；III為六種標(biāo)準(zhǔn)蛋白SDS-PAGE電泳圖經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色；其中1為兔磷酸化酶B(97400)，2為牛血清白蛋白(66200)，3為兔肌動(dòng)蛋白(43000)，4為牛碳酸酐酶(31000)，5為胰蛋白酶擬制劑(20100)，6為雞蛋清溶菌酶(14400)。
(四)活性環(huán)氧基官能團(tuán)可以在不同的pH條件下分別與-SH、-NH2、-OH進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)示意圖見圖4。在相同酶解條件，分別對(duì)FITC、和TMEPBODIPY標(biāo)記純化后的BSA進(jìn)行了酶解，并對(duì)各自酶解產(chǎn)物進(jìn)行了HPLC分析。
酶解條件取100μL TMEPBODIPY或FITC標(biāo)記的BSA溶液，加入50μL Tris-HCl緩沖液中(100mM，pH為8.0)，50μL CaCl2(20mM)，100μL尿素(8M)，然后加入50μL二硫蘇糖醇(11.8g/L)，氮?dú)獯?0min，然后加入50μL碘乙酸(22g/L)，室溫反應(yīng)15min，稀釋樣品使尿素濃度達(dá)到2M。然后加入20μL胰蛋白酶溶液(6g/L)，在37℃水浴下反應(yīng)12h。
如圖3(a)和(b)所示，F(xiàn)ITC標(biāo)記純化后BSA的酶解產(chǎn)物在出峰數(shù)上明顯多于TMEPBODIPY所標(biāo)記純化后BSA的酶解產(chǎn)物。將峰數(shù)大致標(biāo)出后比較，F(xiàn)ITC標(biāo)記純化后BSA的酶解產(chǎn)物在出峰數(shù)大約分別是TMEPBODIPY所標(biāo)記純化后BSA的酶解產(chǎn)物出峰數(shù)的三倍，這說明了TMEPBODIPY與FITC在蛋白質(zhì)上標(biāo)記位點(diǎn)選擇性上的不同。因?yàn)槲覀冞x擇的緩沖pH為8.0，理論上只有蛋白質(zhì)的組氨酸咪唑環(huán)氨基和半胱氨酸的巰基可與標(biāo)記試劑的活性環(huán)氧基進(jìn)行反應(yīng)。
色譜條件Column 250×4.6mm Vydac C18(5μm)；flow rate＝1.0mLmin-1流動(dòng)相A水含0.1％TFA，流動(dòng)相B含0.1％TFA乙腈；梯度條件0～5min＝80％A，5～50min＝80％A～60％A，50～70min＝60％A～0％A；流速1mL/min；柱溫室溫；熒光激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為λex/λem＝492/520nm(a)，λex/λem＝500/510nm(b)實(shí)施例2通式[1]中R表示帶有環(huán)氧基的芳基所示化合物的制備方法，此類化合物的制備可采用芳基甲醛類化合物(如對(duì)羥基苯甲醛)與2，4-二甲基吡咯，于氮?dú)馑〖訜嵯逻M(jìn)行，以四氯苯醌作為脫氫劑，以三乙胺反應(yīng)終止劑，最后加入三氟化硼的乙醚溶液，完成絡(luò)合反應(yīng)。
反應(yīng)式如下 式中R2表示芳基。
權(quán)利要求
1.一種BODIPY類熒光試劑在生物大分子標(biāo)記中的應(yīng)用，其特征在于所述試劑化合物由1，3，5，7-四甲基-二氟化硼-二吡咯甲烷骨架，及帶有可與被標(biāo)識(shí)物質(zhì)結(jié)合的活性環(huán)氧基團(tuán)的取代基形成，其結(jié)構(gòu)如通式[1]所示， [1]式中R表示帶有環(huán)氧基的芳基、雜環(huán)基或烴基。
2.按照權(quán)利要求1所述熒光試劑在生物大分子標(biāo)記中的應(yīng)用，其特征在于所述熒光試劑為1，3，5，7-四甲基-8-苯基-(4-氧基-(3-環(huán)氧丙基))-二氟化硼-二吡咯甲烷，其結(jié)構(gòu)式為
3.按照權(quán)利要求1所述熒光試劑在生物大分子標(biāo)記中的應(yīng)用，其特征在于所述熒光試劑化合物中的R基為3-環(huán)氧丙基苯醚基的化合物。
4.按照權(quán)利要求1所述熒光試劑在生物大分子標(biāo)記中的應(yīng)用，其特征在于所述熒光試劑可以作為柱前或泳前熒光標(biāo)記試劑應(yīng)用于高效液相色譜、平板電泳(SDS-PAGE)、毛細(xì)管電泳、電色譜、微流控芯片或熒光免疫分析實(shí)驗(yàn)中，對(duì)生物大分子進(jìn)行分離檢測(cè)。
5.按照權(quán)利要求1、2、3或4所述熒光試劑在生物大分子標(biāo)記中的應(yīng)用，其特征在于所述生物大分子為蛋白質(zhì)、多肽、DNA或細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物大分子的標(biāo)記，具體地說是一種BODIPY類熒光試劑在生物大分子標(biāo)記中的應(yīng)用，所述試劑化合物由1，3，5，7－四甲基－二氟化硼－二吡咯甲烷骨架，及帶有可與被標(biāo)識(shí)物質(zhì)結(jié)合的活性環(huán)氧基團(tuán)的取代基形成，其結(jié)構(gòu)如通式[1]所示，[1]式中R表示帶有環(huán)氧基的芳基、雜環(huán)基或烴基。本發(fā)明利用BODIPY母體分子中的活性環(huán)氧基團(tuán)，在緩沖溶液中實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記；可以作為柱前或泳前熒光標(biāo)記試劑應(yīng)用于高效液相色譜、平板電泳(SDS－PAGE)、毛細(xì)管電泳、電色譜、微流控芯片或熒光免疫分析實(shí)驗(yàn)中，對(duì)生物大分子進(jìn)行分離檢測(cè)。
文檔編號(hào)C07F5/00GK101059507SQ20061004634
公開日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2006年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月18日
發(fā)明者張玉奎, 張琳, 張維冰, 張麗華, 喬曉強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所