本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蛋白質(zhì)tatfl1-2d及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)鞘澜缟现饕募Z食作物之一，全世界35-40％的人口以它為主要的食物來(lái)源。目前，在有限耕地面積的情況下，選育單產(chǎn)突出的小麥新品種是穩(wěn)定和提高小麥產(chǎn)量最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。因此，小麥的結(jié)實(shí)性器官“小麥穗”一直是小麥育種學(xué)家研究的重要對(duì)象。

花在花序柄上有規(guī)律的排列方式稱為花序，花序發(fā)育是植物形態(tài)建成的重要組成，花序分生組織由莖尖分生組織分化、發(fā)育而來(lái)，側(cè)部器官由幼葉、側(cè)枝進(jìn)一步發(fā)育成為花及花序(即小穗)。小麥為復(fù)穗狀花序，穗軸上著生若干軸節(jié)，每個(gè)軸節(jié)基部著生一個(gè)小穗。每個(gè)小穗產(chǎn)生3-10朵小花。穗型性狀包括穗粒數(shù)、小穗數(shù)和小花數(shù)。于振文等研究表明，穗粒重與籽粒產(chǎn)量之間有極顯著的正相關(guān)。因此，高產(chǎn)田可以側(cè)重于改善單株的生長(zhǎng)發(fā)育條件，提高單穗生產(chǎn)力。每穗粒數(shù)與每穗粒重之間存在極顯著的正相關(guān)，千粒重與每穗粒重間僅表現(xiàn)一定的正向關(guān)系，說(shuō)明在一定的栽培條件下，通過(guò)增加每穗粒數(shù)的途徑提高穗粒重是一種可行的途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何調(diào)控小麥穗型性狀和/或幼穗發(fā)育時(shí)間。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了蛋白質(zhì)tatfl1-2d。

本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)tatfl1-2d，來(lái)源于小麥(triticumaestivuml.)，可為a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

a3)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與植物穗型性狀和/或生殖器官發(fā)育時(shí)間相關(guān)的蛋白質(zhì)；所述穗型性狀為d1)和/或d2)和/或d3)：d1)穗粒數(shù)；d2)小穗數(shù)；d3)小花數(shù)。

其中，序列表中序列2可由173個(gè)氨基酸殘基組成。

為了使a1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。

表1標(biāo)簽的序列

上述a3)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。

上述a3)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1所示的dna序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上標(biāo)簽的編碼序列得到。

編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核酸分子可為如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：

b1)編碼區(qū)如序列表中序列1所示的dna分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；

b3)與b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的dna分子；

b4)在嚴(yán)格條件下與(b1)或(b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的dna分子。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

其中，序列表中序列1由522個(gè)核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列表的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。

含有編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組載體可為向表達(dá)載體插入編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核酸分子得到的重組質(zhì)粒。

所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pubi::tatfl1-2d-pahc25。所述重組質(zhì)粒pubi::tatfl1-2d-pahc25具體可為將載體pubi-pahc25的限制性內(nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ識(shí)別序列間的小片段替換為序列表中序列1自5’末端起第1至519位所示的dna分子。

所述重組微生物可通過(guò)將所述重組載體導(dǎo)入出發(fā)微生物得到。所述出發(fā)微生物可為酵母、細(xì)菌、藻類或真菌。

所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系均不包括繁殖材料。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述tatfl1-2d基因(即蛋白質(zhì)tatfl1-2d的編碼基因)轉(zhuǎn)化受體植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。

下述g1)或g2)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

g1)所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d，或，編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核酸分子，或，含有編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在調(diào)控植物穗型性狀和/或生殖器官發(fā)育時(shí)間中的應(yīng)用；

g2)所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d，或，編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核酸分子，或，含有編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在培育穗型性狀改變和/或生殖器官發(fā)育時(shí)間改變的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；

所述穗型性狀可為d1)和/或d2)和/或d3)：d1)穗粒數(shù)；d2)小穗數(shù)；d3)小花數(shù)。

上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物穗型性狀可為植物穗型性狀優(yōu)。所述穗型性狀優(yōu)可體現(xiàn)為e1)和/或e2)和/或e3)：e1)穗粒數(shù)增加；e2)小穗數(shù)增加；e3)小花數(shù)增加。所述調(diào)控植物生殖器官發(fā)育時(shí)間具體可為延長(zhǎng)植物生殖器官發(fā)育時(shí)間。所述延長(zhǎng)植物生殖器官發(fā)育時(shí)間具體可為延長(zhǎng)植物幼穗發(fā)育時(shí)間。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，可包括將編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核酸分子導(dǎo)入受體植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；與所述受體植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物的穗型性狀改變和/或生殖器官發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)。

上述方法中，編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核酸分子可為如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：

b1)編碼區(qū)如序列表中序列1所示的dna分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；

b3)與b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的dna分子；

b4)在嚴(yán)格條件下與(b1)或(b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的dna分子。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

其中，序列表中序列1由522個(gè)核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。

上述方法中，所述“將編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核酸分子導(dǎo)入受體植物中”可通過(guò)向受體植物中導(dǎo)入重組載體實(shí)現(xiàn)；所述重組載體可為向表達(dá)載體插入編碼所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的核酸分子得到的重組質(zhì)粒。

所述重組載體具體可為所述重組質(zhì)粒pubi::tatfl1-2d-pahc25。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種植物育種方法。

本發(fā)明所提供的植物育種方法，可包括如下步驟：增加植物中所述蛋白質(zhì)tatfl1-2d的含量和/或活性，從而穗型性狀改變和/或生殖器官發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)。

上述任一所述方法中，所述穗型性狀改變?yōu)樗肓?shù)增加和/或小穗數(shù)增加和/或小花數(shù)增加。所述生殖器官發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)為幼穗發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)。所述幼穗發(fā)育時(shí)間具體可為幼穗在二棱期的發(fā)育時(shí)間和/或幼穗在小花分化期的發(fā)育時(shí)間。

上述任一所述植物可為如下c1)至c5)中的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)禾本科植物；c4)小麥；c5)小麥品種科農(nóng)199。

實(shí)驗(yàn)證明，在科農(nóng)199中過(guò)表達(dá)蛋白質(zhì)tatfl1-2d，可顯著延長(zhǎng)幼穗的發(fā)育時(shí)間(如在二棱期的發(fā)育時(shí)間、在小花分化期的發(fā)育時(shí)間)，進(jìn)而導(dǎo)致小穗數(shù)增加、小花數(shù)增加和穗粒數(shù)增加。因此，蛋白質(zhì)tatfl1-2d在調(diào)控小麥穗型性狀和幼穗發(fā)育時(shí)間中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，在培育小麥品種中具有廣闊前景。

附圖說(shuō)明

圖1為tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量與每穗小穗數(shù)的相關(guān)性分析。

圖2為tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量與每穗小花數(shù)的相關(guān)性分析。

圖3為tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量與每穗穗粒數(shù)的相關(guān)性分析。

圖4為電鏡掃描的部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖5為各個(gè)發(fā)育時(shí)期發(fā)育天數(shù)的部分統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

rnaminiprepkit為axygen公司的產(chǎn)品。transscriptfirst-strandcdnasynthesissupermixkit為transgen的產(chǎn)品。premixextaq^tm為takara公司的產(chǎn)品。逆轉(zhuǎn)錄酶為transgen的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為at301-02。kod-plus-dna聚合酶和10×pcrbufferforkod-plus均為toyobo公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為kod-201。載體pgem-teasy為promega公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為a3600。掃描電子顯微鏡臨界點(diǎn)干燥儀為hitachi公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品型號(hào)為hcp-2。冷凍掃描電子顯微鏡為hitachi公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品型號(hào)為s-3000n。

載體pubi-pahc25記載于如下文獻(xiàn)中：jingwang，jinghansun，etal.aphosphatestarvationresponseregulatorta-phr1isinvolvedinphosphatesignallingandincreasesgrainyieldinwheat.annbot.2013jun；111(6)：1139-53.

實(shí)施例1、tatfl1-2d基因的克隆

1、提取小麥品種科農(nóng)199(以下簡(jiǎn)稱科農(nóng)199)處于二棱期的幼穗組織的總rna，然后將該總rna用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cdna，即得到科農(nóng)199幼穗組織的cdna?？妻r(nóng)199幼穗組織的cdna中dna含量均為50ng/μl。

2、以步驟1得到的科農(nóng)199幼穗組織的cdna為模板，采用引物f：5’-ggtagctagccatggctagggtgc-3’和引物r：5’-gcaagagaagaaggggtgggctg-3’進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到約643bp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

反應(yīng)體系為50μl，由1μlkod-plus-dna聚合酶、1μl模板、5μl10×pcrbufferforkod-plus、5μl濃度為2mm的dntps水溶液(即datp、dttp、dctp和dgtp的濃度均為2mm)、2μl濃度為25mm的mgso4水溶液、1.5μl濃度為10μm的引物f水溶液、1.5μl濃度為10μm的引物r水溶液和33μl水組成。

反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性2min；98℃變性30s，55℃退火30s，68℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)。

3、將步驟2得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pgem-teasy連接，得到重組質(zhì)粒pgem-teasy-tatfl1-2d。

對(duì)重組質(zhì)粒pgem-teasy-tatfl1-2d進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pgem-teasy-tatfl1-2d中含有序列表中序列1所示的dna分子(以下命名為tatfl1-2d基因)。

實(shí)施例2、轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥的獲得及其鑒定

一、構(gòu)建重組質(zhì)粒pubi::tatfl1-2d-pahc25

1、以實(shí)施例1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pgem-teasy-tatfl1-2d為模板，以5’-ggatccatggctagggtgctggagcc-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶bamhⅰ的酶切識(shí)別序列)和5’-ggtaccgcggcggcgtgccgctgtctccc-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶kpnⅰ的酶切識(shí)別序列)為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到約530bp的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

2、用限制性內(nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ雙酶切步驟1獲得的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

3、用限制性內(nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ雙酶切載體pubi-pahc25，回收約6.9kb的載體骨架。

4、將酶切產(chǎn)物和載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pubi::tatfl1-2d-pahc25。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pubi::tatfl1-2d-pahc25進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體pubi-pahc25的限制性內(nèi)切酶bamhⅰ和kpnⅰ識(shí)別序列間的小片段替換為序列表中序列1自5’末端起第1至519位所示的dna分子。重組質(zhì)粒pubi::tatfl1-2d-pahc25表達(dá)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)(以下命名為tatfl1-2d蛋白或蛋白質(zhì)tatfl1-2d)。

二、t0代擬轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥的獲得

采用基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒pubi::tatfl1-2d-pahc25轉(zhuǎn)化科農(nóng)199，獲得t0代擬轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥。

采用基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將載體pubi-pahc25轉(zhuǎn)化科農(nóng)199，獲得t0代轉(zhuǎn)空載體小麥。

三、t0代擬轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥的實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)

隨機(jī)選取96株t0代擬轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)，具體步驟如下：

1、采用rnaminiprepkit分別提取96株t0代擬轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥處于二棱期的幼穗組織的總rna，然后采用transscriptfirst-strandcdnasynthesissupermixkit將該總rna反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cdna，得到各個(gè)t0代擬轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥的cdna。各個(gè)t0代擬轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥的cdna中dna含量約為55ng/μl。

2、使用rt-qpcr技術(shù)檢測(cè)各個(gè)t0代擬轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥中tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量(以β-tatubulin基因作為內(nèi)參基因)。

檢測(cè)tatfl1-2d基因的引物為正向引物1：5’-tttggaagggaggtggtgag-3’和反向引物1：5’-cggcgtgtgttgaagtagtc-3’。檢測(cè)β-tatubulin基因的引物為正向引物2：5’-accgccagctcttccaccct-3’和反向引物2：5’-tcactggggcataggaggaa-3’。

反應(yīng)體系為20μl，由10μlpremixextaq^tm、0.5μl濃度為10μm的正向引物、0.5μl濃度為10μm的反向引物、1μlt0代擬轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥的cdna和8.0μl無(wú)核酸酶水組成。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min；95℃變性3sec，60℃退火30sec，40個(gè)循環(huán)。

按照上述方法，將t0代擬轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥替換為科農(nóng)199，其它步驟均不變，得到科農(nóng)199中tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量。

按照上述方法，將t0代擬轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥替換為t0代轉(zhuǎn)空載體小麥，其它步驟均不變，得到t0代轉(zhuǎn)空載體小麥中tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量。

以科農(nóng)199中的tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量作為1，統(tǒng)計(jì)其它各個(gè)小麥中tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，與科農(nóng)199相比，35株t0代擬轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥(分別命名為oe-1-t0至oe-35-t0)中tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著增加，而t0代轉(zhuǎn)空載體小麥中tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量則無(wú)顯著差異。

四、t2代轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥和t4代轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥的獲得及實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)

將oe-1-t0至oe-35-t0經(jīng)連續(xù)兩代自交，獲得t2代轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥，分別命名為oe-1-t2至oe-35-t2。

將oe-1-t0至oe-35-t0經(jīng)連續(xù)四代自交，獲得t4代轉(zhuǎn)tatfl1-2d基因小麥，分別命名為oe-1-t4至oe-35-t4。

將t0代轉(zhuǎn)空載體小麥經(jīng)連續(xù)兩代自交，獲得t2代純合轉(zhuǎn)空載體小麥。

將t0代轉(zhuǎn)空載體小麥經(jīng)連續(xù)四代自交，獲得t4代純合轉(zhuǎn)空載體小麥。

按照步驟三的方法，對(duì)oe-1-t2至oe-35-t2、oe-1-t4至oe-35-t4、t2代純合轉(zhuǎn)空載體小麥、t4代純合轉(zhuǎn)空載體小麥和科農(nóng)199分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)。結(jié)果表明，與科農(nóng)199相比，oe-1-t2至oe-35-t2和oe-1-t4至oe-35-t4中tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著增加，而t2代純合轉(zhuǎn)空載體小麥和t4代純合轉(zhuǎn)空載體小麥中tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量則無(wú)顯著差異。

五、tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量與小麥穗型性狀的相關(guān)性分析

待測(cè)小麥為oe-1-t2、oe-2-t2、oe-3-t2、oe-4-t2、oe-5-t2、oe-6-t2、oe-7-t2、oe-8-t2、oe-9-t2、oe-10-t2、oe-11-t2、oe-12-t2、oe-13-t2、oe-14-t2、oe-15-t2、oe-16-t2、oe-17-t2、oe-18-t2、oe-19-t2、oe-20-t2、oe-21-t2、oe-22-t2、oe-23-t2、oe-24-t2、oe-25-t2、oe-26-t2、oe-27-t2、oe-28-t2、oe-29-t2、oe-30-t2、oe-31-t2、oe-32-t2、oe-33-t2、oe-34-t2或oe-35-t2。

將待測(cè)小麥種植于溫室，待開花后20d，調(diào)查每穗小穗數(shù)、每穗小花數(shù)和每穗穗粒數(shù)，然后與tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。培養(yǎng)條件具體如下：溫度25℃，光照350μmolphotonsm^-2s^-1，濕度60-70％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2和圖3。結(jié)果表明，tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量與每穗小穗數(shù)、每穗小花數(shù)和每穗穗粒數(shù)均正相關(guān)，即tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量越高，則每穗小穗數(shù)、小花數(shù)和穗粒數(shù)的數(shù)量越多。

六、tatfl1-2d基因的相對(duì)表達(dá)量與小麥幼穗發(fā)育時(shí)間的研究

待測(cè)小麥為oe-1-t4、oe-2-t4、t4代純合轉(zhuǎn)空載體小麥或科農(nóng)199。

取30株待測(cè)小麥幼穗進(jìn)入單棱期后的第3d、第10d、第15d或第21d的幼穗，先置于甲醇中浸泡15min，再置于無(wú)水乙醇中浸泡30min，然后采用掃描電子顯微鏡臨界點(diǎn)干燥儀冷凍干燥2h，最后采用冷凍掃描電子顯微鏡進(jìn)行電鏡掃描。根據(jù)電鏡掃描結(jié)果，統(tǒng)計(jì)待測(cè)小麥幼穗在二棱期、小花分化期和雌雄蕊分化期的發(fā)育天數(shù)。

電鏡掃描的部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4(a為科農(nóng)199，b為oe-1-t4；lp為外稃原基，gp為護(hù)穎原基，fm為小花分生組織，數(shù)字13、14、16為小穗數(shù)，白色五角星為小穗)。各個(gè)時(shí)期發(fā)育天數(shù)的部分統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖5(wt為科農(nóng)199)。結(jié)果表明，與科農(nóng)199相比，oe-1-t4和oe-2-t4的幼穗在二棱期和小花分化期的發(fā)育時(shí)間均顯著延長(zhǎng)(在單棱期和雌雄蕊分化期的發(fā)育時(shí)間無(wú)顯著差異)，而t4代純合轉(zhuǎn)空載體小麥的幼穗在單棱期、二棱期、小花分化期和雌雄蕊分化期的發(fā)育時(shí)間無(wú)顯著差異。因此，在科農(nóng)199中過(guò)表達(dá)tatfl1-2d基因，可顯著延長(zhǎng)幼穗的發(fā)育時(shí)間(如在二棱期的發(fā)育時(shí)間和在小花分化期的發(fā)育時(shí)間)，進(jìn)而導(dǎo)致小穗數(shù)增加、小花數(shù)增加和穗粒數(shù)增加。

上述結(jié)果表明，蛋白質(zhì)tatfl1-2d在調(diào)控小麥穗型性狀(如小穗數(shù)、小花數(shù)、穗粒數(shù))和幼穗發(fā)育時(shí)間(如幼穗在二棱期的發(fā)育時(shí)間和/或幼穗在小花分化期的發(fā)育時(shí)間)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

<110>中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所

<120>蛋白質(zhì)tatfl1-2d及其編碼基因與應(yīng)用

<160>2

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<213>小麥（triticumaestivuml.）

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