本發(fā)明涉及一種循環(huán)腫瘤細胞分選儀及其試劑盒。

背景技術：

脫離原發(fā)腫瘤部位的癌細胞被稱為“循環(huán)腫瘤細胞(circulatingtumorcell,ctc)”。根據(jù)文獻報道，ctc在惡性腫瘤形成早期即可釋放入血，ctc由原發(fā)灶釋放進入血液循環(huán)，是惡性腫瘤復發(fā)和轉移的關鍵步驟。在過去二十年中，ctc已成為檢測早期癌轉移、預測患者預后以及檢測疾病進展和癌癥治療效果的新興“生物標志物”。然而，由于ctc在含有大量血細胞(10⁹個細胞/ml)的血液中的含量極低(幾個至幾百個每毫升)，因此對ctc的分選在技術上存在一定的難度，從外周血中快速、高效的分離ctc是后續(xù)對ctc細胞計數(shù)，以及研究分析的前提。

ctc富集技術主要分為以形態(tài)學為基礎的富集和以免疫學為基礎的富集。前者，主要依靠細胞密度梯度進行分離，但是密度相近的細胞會產生干擾，因此該方法缺乏特異性。后者，是基于細胞表面抗原分子與免疫磁珠的特異性結合，在外加磁場的作用下，滯留在磁場中，從而與不帶磁性的其它組分分離。較具代表性的方法是磁性活化細胞分選系統(tǒng)(magneticactivatedcellsortingsystem,macs)，采用胞膜或胞內染色，然后通過免疫磁性標記的微球來捕獲ctc。該方法具有特異性強的優(yōu)點，但是其無法識別未表達目標標記的未知細胞，而這些細胞也很可能是ctc，也就是我們研究的重點之一。

目前唯一獲得fda批準的ctc檢測設備是cellsearch系統(tǒng)，該系統(tǒng)是基于免疫磁珠分離技術而開發(fā)出的檢測設備，它利用標記有針對上皮細胞黏著分子(epithelialcelladhesionmolecule,epcam)抗體的磁性顆粒進行ctc的捕獲，但是其捕獲效率還是較低，且白細胞的干擾較大。另外，目前的一些ctc檢測設備和技術尚沒有實現(xiàn)檢測過程的全自動化控制，即沒有實現(xiàn)血液檢測樣品和試劑的自動化進樣，細胞的自動化捕獲及鑒定分析，因此ctc的檢測存在過多的人為干預，使得ctc的檢測準確性低，檢測成本過高。

cellsearch系統(tǒng)的基本流程是：先使用epcam抗體磁珠對上皮細胞進行富集，然后將細胞固定，用dapi熒光核染料、cd45熒光抗體和ck8、ck18以及ck19熒光抗體標記細胞，再用四色熒光顯微鏡cellspotteranalyzer進行分析，檢測ck陽性、cd45陰性的上皮細胞，此即為ctc。該系統(tǒng)包括一個捕獲和染色裝置autoprep、一個帶磁場的樣本盒裝置magnest以及一個進行細胞計數(shù)的裝置analyzer，可見該系統(tǒng)并未實現(xiàn)樣品從前處理至細胞捕獲、染色、分析的全程自動化，其操作依然相對繁瑣。

細胞分選技術可分為陽性分選和陰性分選，陽性分選即是將所需的細胞從未標記或不需要的組分中分離出來，陰性分選即是將不需要的細胞移除出去，通過陽性和陰性分選的結合可保留盡可能多的ctc，從而獲得更全面的分析結果。

因此，本領域的技術人員致力于開發(fā)一種可將陽性分選和陰性分選相結合的ctc分選和檢測系統(tǒng)，以滿足研究中的不同需求。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于現(xiàn)有技術的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種從血液樣品前處理至細胞分選、染色和計數(shù)全程自動化的ctc分選儀，同時該分選儀還結合了陽性和陰性兩種分選技術，可對樣品進行全面的分選以便進一步的分析研究。

本發(fā)明中所述陽性分選的一般步驟包括：

a)離心，去除樣品中的血漿，收集沉淀的細胞；

b)加入ctc捕獲試劑捕獲目標ctc，該捕獲試劑包含帶抗體的納米磁顆粒；

c)用磁收集部件吸附結合了目標ctc的納米磁顆粒；

d)清洗吸附的結合了目標ctc的納米磁顆粒；

e)熒光染色目標ctc并清洗多余染色劑；

f)將目標ctc固定，以便計數(shù)和下一步的分析。

陽性分選可采用特異性捕獲試劑，從而獲得特定的靶細胞，一種優(yōu)選的捕獲試劑為包含有抗epcam納米磁顆粒。

本發(fā)明中所述陰性分選的一般步驟包括：

a)加入陰性富集多聯(lián)抗體，該多聯(lián)抗體用于結合干擾細胞，優(yōu)選為可結合血液中的白細胞和紅細胞；

b)加入密度梯度離心液離心，使干擾細胞沉淀；

c)通過光感識別部件來判斷目標ctc所在密度層，并收集該層；

d)離心，收集沉淀的目標細胞；

e)熒光染色并清洗多余染色劑；

f)將目標細胞固定，以便計數(shù)和下一步的分析。

陰性分選中最大的干擾是白細胞和紅細胞，上述分選方法中采用多聯(lián)抗體將白細胞與紅細胞結合起來；在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述結合體的密度較大，經密度梯度離心而沉淀，而作為目標的ctc位于中間層，該層中除了目標ctc以外，還可能有與其密度相類似的其它細胞，這些其它細胞可能也是ctc，或是值得進一步分析研究的非ctc細胞。

因此，為了兼容陽性分選與陰性分選的目的，本發(fā)明提供了一種循環(huán)腫瘤細胞分選儀，所述分選儀包括：

離心平臺，用于陽性和/或陰性分選中的離心步驟；

試劑儲存平臺，用于存放陽性和/或陰性分選中所用到的各種試劑；

廢料收集平臺，用于收集陽性和/或陰性分選過程中的廢棄物；

轉運部件，用于轉運樣品、廢棄液及各種試劑；

轉運頭儲存平臺，用于存放轉運中所用到的轉運頭耗材；

磁收集部件，用于在陽性分選中吸附納米磁顆粒；

光感識別部件，用于在陰性分選中光感識別ctc細胞所在層；

該分選儀具有合理的布局和緊湊的結構。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述磁收集部件為磁棒，在此種情況下所述轉運部件還可用于磁棒的轉運，且所述循環(huán)腫瘤細胞分選儀還包括磁棒儲存平臺，用于存放磁棒以供使用。如本領域技術人員所知，所述磁棒通過插入樣品中孵育來吸附結合有目標ctc的納米磁顆粒，通常對吸附后的磁棒有兩種處理方式：一是先收集被吸附的目標ctc，然后對ctc染色；二是先對磁棒上的目標ctc染色，然后收集細胞；在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中采用后者，進而，該循環(huán)腫瘤細胞分選儀還包括磁棒染色平臺，該磁棒染色平臺包括：

磁棒支撐架，用于保持所述磁棒豎直擺放；

染色架，用于擺放染色試劑；以及

清洗架，用于擺放清洗試劑；

三者被設置在同一條直線軌道上，其中所述染色架和所述清洗架可沿所述直線軌道移動，所述磁棒支撐架離所述直線軌道的高度可調；或所述磁棒支撐架可沿所述直線軌道移動且離所述直線軌道的高度可調；又或三者均可沿所述直線軌道移動且離所述直線軌道的高度可調。

進一步，所述磁棒支撐架上設置有多個插孔，用于磁棒的插放；且所述磁棒的上部設置有卡位部件，用于將所述磁棒在豎直方向上固定在所述磁棒支撐架上。

進一步，所述染色試劑的試劑瓶/管在工作時為敞口設置；所述清洗試劑的試劑瓶/管在工作時也為敞口設置。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述磁棒的染色步驟為：

1)將吸附有結合了目標ctc的納米磁顆粒的磁棒插入磁棒支撐架；此時該支撐架遠離所述直線軌道；

2)移動所述清洗架至磁棒支撐架下方；

3)下調磁棒支撐架的高度，使磁棒的吸附部位浸沒入清洗試劑中；

4)上下移動并不斷旋轉磁棒以清洗雜質；

5)清洗完成，上調磁棒支撐架的高度；

6)移開所述清洗架，同時移動所述染色架至磁棒支撐架下方；

7)下調磁棒支撐架的高度，使磁棒的吸附部位浸沒入染色試劑中孵育一段時間；

8)孵育過程中不斷旋轉磁棒以充分染色；

9)孵育完成，上調磁棒支撐架的高度；

10)移開所述染色架，染色完成。

染色前，上述2)-5)的清洗步驟可根據(jù)情況有所取舍，染色完成后，也可采用上述2)-5)的清洗步驟進行清洗，且根據(jù)需要可重復多次，以徹底清洗雜質或清除多余的染色劑；此外步驟6)-10)的染色步驟也可重復進行多次。

染色后按常規(guī)的方法，可以將被吸附的目標ctc洗脫下來，再進行固定和計數(shù)等后續(xù)操作。

優(yōu)選地，所述磁套具有捕獲窗，該捕獲窗由透磁材料制成，磁芯產生的磁場可透過該窗口吸附磁性顆粒，除捕獲窗以外的部分由拒磁材料制成，該材料可屏蔽磁芯產生的磁場，從而使磁性顆粒聚集在捕獲窗的位置便于后續(xù)操作。

本發(fā)明提供了一種更佳的方案，即在本發(fā)明的磁棒結構中增加磁套的設置，所述磁套套在所述磁棒的外部，類似于筆套，其本身不具有磁性，該磁套可在細胞染色后取下，并直接用于細胞的固定和計數(shù)等操作。

優(yōu)選地，所述磁套由透明或半透明材料制成，便于后續(xù)的觀察。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述轉運部件包括：第一轉運部件，用于轉運樣品管中的廢棄液，該轉運部件也可被稱為樣品轉運部件；第二轉運部件，用于轉運包含帶抗體的納米磁顆粒的ctc捕獲試劑及與ctc捕獲步驟相關的其它試劑，該轉運部件也可被稱為捕獲轉運部件；第三轉運部件，用于轉運和移動磁棒，該轉運部件也可被稱為磁棒轉運部件；第四轉運部件，用于轉運染色試劑及與染色步驟相關的其它試劑，該轉運部件也可被稱為染色轉運部件。

進一步，所述轉運部件可以是旋轉式或滑動式的；優(yōu)選地，各個所述轉運部件具有不同的移動平面，這樣可錯開各轉運部件，使該分選儀的平面面積盡可能地減小。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，第一轉運部件和第二轉運部件為旋轉式，第三轉運部件和第四轉運部件為滑動式，其中所述第三轉運部件和第四轉運部件的移動平面高于所述第一轉運部件和所述第二轉運部件的移動平面。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，所述第一、第二、第三、第四轉運部件均為滑動式；在更進一步的優(yōu)選實施方式中所述第一、第二、第四轉運部件合而為一，成為試劑轉運部件，它和磁棒轉運部件一起設置在一個滑動軌道上，該軌道使試劑轉運部件和磁棒轉運部件可在x-y-z空間內運動。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述磁棒儲存平臺的位置被設置在所述磁棒染色平臺與所述離心平臺之間，所述磁棒轉運部件可方便地帶動磁棒在所述磁棒儲存平臺、所述離心平臺和所述磁棒染色平臺之間移動，并帶動磁棒進行旋轉；這種設計可兼顧磁棒在離心平臺中的捕獲過程和在磁棒染色平臺中的染色過程，且該設計占據(jù)較小的面積；該分選儀在進行樣品的陽性分選過程中，樣品離心步驟和染色平臺的試劑準備工作可同時進行，節(jié)省了空間和時間。

在上述優(yōu)選實施方式中，所述試劑儲存平臺、廢料收集平臺、轉運頭儲存平臺的一種設置方式為共用一套，與磁棒儲存平臺的位置一樣設置在所述磁棒染色平臺與所述離心平臺之間，此種設置可使分選儀的結構更緊湊；另一種設置方式為兩套，分別供應于所述離心平臺和所述磁棒染色平臺，此種設置的優(yōu)點是同時進行離心平臺操作和染色平臺操作時，各轉運部件不會相互干擾。

進一步，本發(fā)明所述循環(huán)腫瘤細胞分選儀還包括細胞計數(shù)部件、樣品條碼掃描部件。

本發(fā)明還提供了用于上述循環(huán)腫瘤細胞分選儀的試劑盒，所述試劑盒包括：循環(huán)腫瘤細胞捕獲試劑、陰性富集多聯(lián)抗體試劑、密度梯度離心液、免疫熒光染色劑、細胞固定劑和緩沖液。

進一步，上述試劑盒中的所述循環(huán)腫瘤細胞捕獲試劑為至少能夠與循環(huán)腫瘤細胞的一種生物標志物特異性結合的免疫磁珠，一個優(yōu)選的實例為抗epcam納米磁顆粒，除epcam外，所述循環(huán)腫瘤細胞的生物標志物還包括但不限于cd133、cd90、cd24、cd13、icam-1、sall4、cd44、aldh。

進一步，上述試劑盒中的所述免疫熒光染色劑可包括熒光(如pe)標記的細胞角蛋白(ck)抗體、熒光(如apc)標記的cd45抗體、dapi中的一種或多種；也可以包括熒光標記的對應于捕獲試劑的抗體，如捕獲試劑為抗epcam納米磁顆粒，則可采用熒光標記的epcam抗體。

進一步，上述試劑盒中的所述陰性富集多聯(lián)抗體為具有含至少兩種抗體的多聯(lián)結構，所述至少兩種抗體的連接方式可以是直接或間接連接，該陰性富集多聯(lián)抗體與其抗原結合后可通過密度梯度離心法或沉淀法去除；在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述多聯(lián)抗體具有可與紅細胞相結合的抗體和可與白細胞相結合的抗體，且該兩種抗體都不可與循環(huán)腫瘤細胞相結合。

進一步，上述試劑盒中的所述密度梯度離心液可根據(jù)需要選用各種現(xiàn)有產品，如ficoll分離液。

進一步，上述試劑盒還包括樣品儲存管、條形碼、捕獲增強試劑、透化試劑中的一種或幾種。

本發(fā)明所述循環(huán)腫瘤細胞分選儀及其試劑盒具有以下有益技術效果：

1、本發(fā)明實現(xiàn)了ctc細胞的陽性分選與陰性分選的結合，使兩種分選的結果可同時應用于同一個樣本，相互驗證，取長補短，從而獲得更精確的檢測結果；

2、陰性分選可獲得不表達標志物的相似密度的ctc，從而擴大了研究的范圍，提供了產生更豐富的研究成果的可能性；

3、本發(fā)明提供的分選儀具有合理的布局和緊湊的結構，并提供了較佳的操作流程，從而使樣品的分選過程盡可能地流暢和高效；

4、本發(fā)明實現(xiàn)了從血液樣品前處理至細胞分選、染色和計數(shù)全程自動化的過程；

5、本發(fā)明的磁棒采用磁套的設計，使洗脫步驟得以省略，減少了細胞的損失，簡化了流程，縮短了時間。

以下將結合附圖對本發(fā)明的構思、具體結構及產生的技術效果作進一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說明

圖1是本發(fā)明分選儀的一個較佳實施例的平面結構示意圖；

圖2是本發(fā)明分選儀的另一較佳實施例的平面結構示意圖；

圖3是本發(fā)明中磁棒的一個較佳實施例的結構示意圖；

圖4是本發(fā)明中磁棒的另一較佳實施例的結構示意圖。

具體實施方式

實施例1

如圖1所示為本發(fā)明的循環(huán)腫瘤細胞分選儀的一種較佳實施例的俯視結構示意圖，該分選儀以中間的滑動軌道為界分為兩個主體結構，其中左邊為離心區(qū)，右邊為染色和讀數(shù)區(qū)，圖中所示分選儀可同時進行12個樣本的分選和檢測。從圖中可知，所述循環(huán)腫瘤細胞分選儀包括離心平臺1、第一試劑儲存平臺2-1、第二試劑儲存平臺2-2、第一廢料收集平臺3-1、第二廢料收集平臺3-2、第一轉運部件4-1、第二轉運部件4-2、第三轉運部件4-3、第四轉運部件4-4、第一轉運頭儲存平臺5-1、第二轉運頭儲存平臺5-2、磁棒儲存平臺6、磁棒7、磁棒支撐架8、染色架9、清洗架10、直線軌道11、計數(shù)平臺12；其中所述離心平臺1內設置有光感識別部件(圖中未示出)；所述第一轉運部件4-1和第二轉運部件4-2為旋轉式，它們對應使用第一廢料收集平臺3-1和第一轉運頭儲存平臺5-1；所述第三轉運部件4-3和第四轉運部件4-4為滑動式，并共用同一套滑動軌道，它們對應使用第二廢料收集平臺3-2和第二轉運頭儲存平臺5-2；且所述第一轉運頭儲存平臺5-1、第二轉運頭儲存平臺5-2、磁棒儲存平臺6、計數(shù)平臺12均設置在滑動軌道上，從而可沿軌道移動；所述第一試劑儲存平臺2-1內存放離心步驟試劑，所述第二試劑儲存平臺2-2內存放染色步驟試劑。本發(fā)明的部件排布方式不唯一，優(yōu)選為將離心區(qū)與染色區(qū)分列在磁棒轉運部件兩側的排布方式，但是其它能夠使其結構緊湊的排布方式也是可行的。

該分選儀由第一轉運部件4-1吸取離心平臺樣品管中的廢棄液，由第二轉運部件4-2吸取第一試劑儲存平臺2-1內的ctc捕獲試劑和緩沖液等，由第三轉運部件4-3負責磁棒7的轉運、旋轉和上下移動，該轉運部件具有沿分選儀臺面長軸的滑動軌道和沿分選儀臺面短軸的滑動軌道，可實現(xiàn)分選儀臺面面積的全覆蓋，由第四轉運部件4-4吸取第二試劑儲存平臺2-2內的染色試劑和緩沖液等，該轉運部件與第三轉運部件4-3共用滑動軌道。

實施例2

圖2為本發(fā)明另一較佳實施例的俯視結構示意圖，圖中1為離心平臺，2為試劑儲存平臺，3為廢料收集平臺，4-1為磁棒轉運部件，4-2為試劑轉運部件，5為轉運頭儲存平臺，6為磁棒儲存平臺，7為磁棒，8為磁棒支撐架，9為洗染架，11為直線軌道，12為計數(shù)平臺，本實施例還包括攪拌棒儲存平臺13，所述攪拌棒可用于溶液的攪拌混勻。

本實施例中將旋轉轉運部件的功能合并至滑動轉運部件中，磁棒轉運部件4-1和試劑轉運部件4-2具有共同的滑動軌道，該滑動軌道可以在x-y-z的三維立體空間中移動，其移動面覆蓋操作平面，本實施例中所有的儲存平臺均排列在儀器的中間部位，清洗架和染色架被設置在一起，離心平臺和磁棒洗染平臺被分別設置在儲存平臺的兩邊，使離心步驟和洗染步驟可同步進行，轉運部件也減少為2個，其中試劑轉運部件4-2承擔了所有試劑的轉運工作。本實施例中的分選儀結構更緊湊，可進一步節(jié)省空間。

實施例3

本實施例提供了一種磁棒，該磁棒7的結構如圖3所示，其包括插桿71、磁芯72和磁套73，所述磁套73像筆套一樣套在所述插桿71的外部，并將磁芯72包裹在其內，在磁套73上設置有捕獲窗74，磁芯72對應捕獲窗74的面為磁場發(fā)射面，磁場可透過該窗口向外發(fā)散，磁芯72的其它面均不向外發(fā)射磁場，即其它面均被軟磁材料包裹，從而使捕獲試劑中的納米磁性顆粒聚集在捕獲窗74內，當帶有目標ctc的納米磁性顆粒被捕獲收集后，只需將插桿71從磁套73內抽出，即可直接對捕獲窗74上的細胞進行下一步的研究，該捕獲窗被設計為透明的，可便于進一步地固定和觀察收集細胞。此外，插桿71的上端還設置有凸起75，作為卡位部件，用于將該磁棒固定懸掛于磁棒支撐架上。

實施例4

本實施例提供了另一種磁棒的設計，如圖4所示，本實施例中的磁棒7也具有插桿71、磁芯72和磁套73，在磁套73上設置有捕獲窗74，結構與實施例3中類似，所不同的是其捕獲窗74是設置于磁棒的底端，該其磁芯釋放磁場的面也為底面。

實施例5

由上述實施例1和3組成的ctc分選儀用于樣品陽性分選的一種方法，包括步驟：

(1)樣品經條形碼掃描后被置入離心平臺內，用第二轉運部件4-2從第一轉運頭儲存平臺5-1內取得轉運頭，并從第一試劑儲存平臺2-1內的緩沖液瓶中吸取稀釋用緩沖液加入樣品管中，離心，由第一轉運部件4-1從第一轉運頭儲存平臺5-1內取得轉運頭吸除樣品中的上層血漿，廢棄的血漿和轉運頭丟棄于第一廢料收集平臺3-1內；

(2)由第二轉運部件4-2從第一試劑儲存平臺2-1內依次吸取緩沖液和ctc捕獲試劑(如抗epcam納米磁顆粒)，加入樣品中，必要時還可加入捕獲增強試劑，然后用第二轉運部件4-2輕輕吹打樣品，以重懸細胞；

(3)用第三轉運部件4-3從磁棒儲存平臺6內取得磁棒7并插入離心平臺內的細胞懸液中，并用第三轉運部件4-3實現(xiàn)磁棒周期性的緩慢旋轉、上下移動、退磁和進磁，以實現(xiàn)ctc的捕獲和磁珠的收集，每個周期約1-2分鐘，總的時長不少于15分鐘；

(4)將磁棒7抽離，并用第一轉運部件4-1吸除樣品管中剩余的液體，然后用第二轉運部件4-2加入緩沖液，將磁棒7再次插入樣品管中，通過緩慢旋轉和上下移動來清洗磁棒7；

(5)用第三轉運部件4-3將磁棒7轉運至磁棒支撐架8上，將裝有染色試劑的染色架9移至磁棒支撐架8的下方，將磁棒支撐架8向下移動使磁棒7的捕獲窗浸入染色試劑中，并緩慢旋轉和上下移動以充分均勻染色；

(6)上移磁棒支撐架8，然后移開染色架9，并將清洗架10移動至磁棒支撐架8下，下移磁棒支撐架8使磁棒7的捕獲窗浸入清洗緩沖液中，緩慢旋轉和上下移動磁棒7以清洗多余的染色液；

(7)用第三轉運部件4-3將磁棒7移至事先加有固定試劑的計數(shù)平臺12內，將磁棒7的磁芯抽出，留下磁套進行ctc計數(shù)。

上述(5)和(6)的染色和清洗步驟可分別根據(jù)需要進行多次。

在步驟(1)-(4)進行的同時，由第四轉運部件4-4進行染色平臺和計數(shù)平臺試劑的準備工作，包括步驟：

(a)由第四轉運部件4-4從第二轉運頭儲存平臺5-2中取得轉運頭，從第二試劑儲存平臺2-2中吸取染色試劑，向染色架9的試管中加入染色試劑，所述染色試劑是多種免疫熒光染色劑的混合物，如ck-pe、cd45-apc、dapi、透化試劑的混合，每一種試劑的添加需替換轉運頭，廢棄的轉運頭丟棄至第二廢料收集平臺3-2；

(b)由第四轉運部件4-4從第二轉運頭儲存平臺5-2中取得轉運頭，從第二試劑儲存平臺2-2中吸取緩沖液，向清洗架10的試管中加入緩沖液；

(c)由第四轉運部件4-4從第二轉運頭儲存平臺5-2中取得轉運頭，從第二試劑儲存平臺2-2中吸取固定試劑，向計數(shù)平臺的計數(shù)盒中加入固定試劑。

以上方法不唯一，可根據(jù)實驗需要設計相應的步驟。

實施例4

上述實施例1的ctc分選儀用于樣品陰性分選的一種方法，包括步驟：

(1)樣品經條形碼掃描后被置入離心平臺內，用第二轉運部件4-2吸取陰性富集多聯(lián)抗體試劑加入樣品管中，震蕩混勻或吹打混勻；

(2)用第二轉運部件4-2加入緩沖液，輕柔混勻；

(3)用第二轉運部件4-2在離心平臺的離心管內加入密度梯度離心液，用第四轉運部件4-4將樣品管中的樣品輕柔地加入離心管中后離心，離心后的液體分為四層，從管底向上一次為血細胞層(紅細胞和白細胞)、ficoll分離液層、ctc層和血漿層；

(4)用第一轉運部件4-1吸除大部分的血漿層后，還是用第一轉運部件4-1吸取血細胞層以上的液體，轉移至新的離心管中；

(5)用第二轉運部件4-2加入緩沖液后離心，用第一轉運部件4-1吸除上清，用第四轉運部件4-4從第二轉運頭儲存平臺5-2中取得轉運頭，從第二試劑儲存平臺2-2中吸取染色試劑，向離心管中加入染色試劑，所述染色試劑是多種免疫熒光染色劑的混合物，如ck-pe、cd45-apc、dapi、透化試劑的混合；

(6)用第二轉運部件4-2重懸細胞并加入緩沖液，靜置后離心，用第一轉運部件4-1吸除上清；

(7)由第四轉運部件4-4從第二轉運頭儲存平臺5-2中取得轉運頭，從第二試劑儲存平臺2-2中吸取固定試劑，向離心管中加入固定試劑，用第二轉運部件4-2重懸細胞后，用第四轉運部件4-4將重懸細胞轉移至計數(shù)平臺12內。

以上方法不唯一，可根據(jù)實驗需要設計相應的步驟。

以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術人員無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員依本發(fā)明的構思在現(xiàn)有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。