本實(shí)用新型涉及循環(huán)腫瘤細(xì)胞全自動(dòng)檢測(cè)設(shè)備領(lǐng)域，尤其涉及一種全自動(dòng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集裝置。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cell,CTC)是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，其可自發(fā)或通過診療操作從實(shí)體腫瘤病灶(原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶)脫落，進(jìn)入體循環(huán)系統(tǒng)(如外周血)。大部分CTC進(jìn)入外周血后會(huì)發(fā)生凋亡或被吞噬，少數(shù)能夠逃逸并錨著病灶以外的組織或器官上，進(jìn)而發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶，增加惡性腫瘤患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。因此，CTC檢測(cè)可有效地應(yīng)用于體外早期診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)、個(gè)體化治療(包括快速臨床化療藥物篩選和耐藥性的檢測(cè))、腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)及新的腫瘤藥物開發(fā)等。

目前，市場(chǎng)上已出現(xiàn)的CTC富集和檢測(cè)的產(chǎn)品或服務(wù)，唯一獲得FDA批準(zhǔn)的CTC檢測(cè)設(shè)備是CellSearch系統(tǒng)，該系統(tǒng)是基于免疫磁珠分離技術(shù)而開發(fā)出的檢測(cè)設(shè)備，它利用標(biāo)記有針對(duì)上皮細(xì)胞黏著分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule,EpCAM)抗體的磁性顆粒進(jìn)行CTC的捕獲，該方法具有特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但是其無法識(shí)別未表達(dá)目標(biāo)標(biāo)記的未知細(xì)胞，且其捕獲效率還是較低，白細(xì)胞的干擾較大。另外，目前的一些CTC檢測(cè)設(shè)備和技術(shù)尚沒有實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過程的全自動(dòng)化控制，即沒有實(shí)現(xiàn)血液檢測(cè)樣品和試劑的自動(dòng)化進(jìn)樣，細(xì)胞的自動(dòng)化捕獲及鑒定分析，因此CTC的檢測(cè)存在過多的人為干預(yù)，使得CTC的檢測(cè)準(zhǔn)確性低，檢測(cè)成本過高。

鑒于循環(huán)腫瘤細(xì)胞也就是CTC總共有15個(gè)分型，而CellSearch只能檢測(cè)到其中一個(gè)型別，漏檢率很高，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)一種以排除法原理篩選并富集CTC的全自動(dòng)裝置。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本實(shí)用新型旨在基于密度梯度離心法提供一種從全血中陰性富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法及其全自動(dòng)設(shè)備，該方法利用不同種類細(xì)胞的密度差異將其分層，并用沉淀法棄去主要的干擾細(xì)胞，從而獲得符合一定密度標(biāo)準(zhǔn)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型提供了一種全自動(dòng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集裝置，包括離心單元、轉(zhuǎn)移單元、儲(chǔ)料單元和收集分析單元；所述離心單元用于液體的離心以及細(xì)胞的染色、清洗和孵育，所述轉(zhuǎn)移單元用于樣本、試劑和材料的轉(zhuǎn)移，所述儲(chǔ)料單元用于試劑和材料的儲(chǔ)存，所述收集分析單元用于收集富集獲得的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)或分析。

進(jìn)一步，所述離心單元以離心機(jī)為核心，所述儲(chǔ)料單元設(shè)置于所述離心單元的周圍，所述轉(zhuǎn)移單元被設(shè)置于所述裝置操作面的上方，其可在所述離心單元和所述儲(chǔ)料單元之間轉(zhuǎn)運(yùn)樣本、試劑和材料。

優(yōu)選地，本實(shí)用新型處理的樣本為血液樣本。

進(jìn)一步，所述儲(chǔ)料單元包括試劑儲(chǔ)料倉、耗材儲(chǔ)料倉和廢棄物儲(chǔ)料倉；優(yōu)選地，還可包括攪拌棒儲(chǔ)料倉。

進(jìn)一步，所述試劑儲(chǔ)料倉中至少儲(chǔ)存有密度梯度離心液、多聯(lián)抗體試劑、細(xì)胞染色試劑和緩沖液。

優(yōu)選地，所述試劑包括密度梯度離心液、多聯(lián)抗體試劑、免疫熒光染色試劑、細(xì)胞固定試劑、緩沖液；其中，所述多聯(lián)抗體試劑可結(jié)合至少兩種干擾細(xì)胞，優(yōu)選為可結(jié)合血液中的白細(xì)胞和紅細(xì)胞；所述細(xì)胞染色劑優(yōu)選為可特異性識(shí)別和結(jié)合循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面抗原的熒光抗體。進(jìn)一步，所述試劑還可以包括核酸染色劑、捕獲增強(qiáng)試劑、通透試劑中的一種或多種。

陰性富集法中最大的干擾是白細(xì)胞和紅細(xì)胞，上述方法采用多聯(lián)抗體將白細(xì)胞與紅細(xì)胞結(jié)合起來；在本實(shí)用新型的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述結(jié)合體的密度較大，經(jīng)密度梯度離心而沉淀，而作為目標(biāo)的CTC位于中間層，該層中除了目標(biāo)CTC以外，還可能有與其密度相類似的其它細(xì)胞，這些其它細(xì)胞可能也是CTC，或是值得進(jìn)一步分析研究的非CTC細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述耗材包括一次性移液槍頭。

進(jìn)一步，所述離心單元還包括視覺識(shí)別系統(tǒng)，用于對(duì)離心液體分層的成像、各層吸取液體量和高度的計(jì)算。

優(yōu)選地，所述視覺識(shí)別系統(tǒng)的計(jì)算方法分為兩部分，均是根據(jù)視覺識(shí)別照片(上下層以光電傳感器對(duì)顏色加以區(qū)分)來計(jì)算的：

1)計(jì)算需抽掉的上層液體高度值：根據(jù)樣本所在高度減去照片中上層與下層相接處的高度的差，加上調(diào)整的高度(防止抽液過多對(duì)下層造成擾動(dòng))；

2)計(jì)算需添加的液體高度值：用設(shè)定的最終高度減去現(xiàn)有液面的高度，必要時(shí)還要減去添加目標(biāo)液體之前所需添加的小劑量試劑的高度。

進(jìn)一步，所述離心單元采用的離心機(jī)為步進(jìn)式離心機(jī)，可根據(jù)需要任意移動(dòng)樣本的通道位置；進(jìn)一步，所述步進(jìn)式移動(dòng)樣本通道位置即：在操作者上機(jī)時(shí)在離心機(jī)上放置離心管或轉(zhuǎn)移單元添加和吸取液體時(shí)，離心機(jī)可以緩慢順時(shí)針或逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)移動(dòng)，將已操作通道移走，并將相鄰?fù)ǖ擂D(zhuǎn)至操作位。采用所述步進(jìn)式移動(dòng)樣品通道位置，便于上機(jī)放置樣品管，同時(shí)可以便于配合轉(zhuǎn)移單元工作，使轉(zhuǎn)移單元與樣本品通道通過最短路徑配合，能夠節(jié)約轉(zhuǎn)移單元反復(fù)移動(dòng)位置所消耗的時(shí)間，加快整個(gè)流程的進(jìn)度。

優(yōu)選地，所述離心單元能夠?qū)崟r(shí)記憶和記錄每個(gè)樣本通道的位置，便于將樣本初始編號(hào)和提取物/分析物樣本編號(hào)的對(duì)應(yīng)，并且每一個(gè)生物樣本在離心過程中的任意位置是有路徑記憶以及動(dòng)態(tài)與靜態(tài)位置可設(shè)定和控制的。

更優(yōu)選地，所述離心機(jī)為數(shù)字化離心機(jī)，在離心過程中，操作者可根據(jù)樣本的離心要求設(shè)定加速與減速曲線，采用的減速曲線是智能可控的有剎車減速，在不擾動(dòng)樣本分層的基礎(chǔ)上，能夠快速剎車，節(jié)省了時(shí)間，而現(xiàn)有的離心機(jī)減速，為了避免樣本的分層擾動(dòng)，都是采取無剎車減速，減速時(shí)間非常長(zhǎng)。

進(jìn)一步，本實(shí)用新型所述離心單元還具有混勻機(jī)構(gòu)，所述混勻機(jī)構(gòu)被設(shè)置在離心機(jī)的每個(gè)樣本通道底部，該機(jī)構(gòu)可帶動(dòng)離心試管進(jìn)行自旋和/或搖晃運(yùn)動(dòng)。

進(jìn)一步，所述轉(zhuǎn)移單元由一個(gè)或多個(gè)機(jī)械臂組成，所述機(jī)械臂能夠進(jìn)行上下、左右和/或轉(zhuǎn)軸運(yùn)動(dòng)；優(yōu)選地，所述機(jī)械臂可兼容hamilton的移動(dòng)系統(tǒng)；在本實(shí)用新型的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述多個(gè)機(jī)械臂分別用于轉(zhuǎn)移樣品、廢棄液、試劑和固體材料；在本實(shí)用新型的另一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述機(jī)械臂具有“一臂多用”的特點(diǎn)，可用于移取液體或固體材料。

在本實(shí)用新型的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述全自動(dòng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集裝置還包括攪拌棒。優(yōu)選地，所述攪拌棒通過電磁場(chǎng)被所述機(jī)械臂抓取而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述攪拌棒為螺旋槳狀。

優(yōu)選地，所述機(jī)械臂能帶動(dòng)所述攪拌棒進(jìn)行自轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)攪拌和混勻的動(dòng)作。

進(jìn)一步，所述收集分析單元具有觀察窗，可供操作者觀察或機(jī)器自動(dòng)拍照。

此外，本實(shí)用新型還提供一種全自動(dòng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法，包括以下步驟：

1)在離心單元中，交錯(cuò)放置裝有全血樣本的試管A和裝有密度梯度離心液的試管B，在離心單元外的試管架中放置干凈的試管C；

2)向全血樣本試管A中加入緩沖液和交聯(lián)抗體試劑，進(jìn)行混勻和孵育；

3)將孵育后的全血樣本輕輕加入旁邊預(yù)裝了密度梯度離心液的試管B中，經(jīng)離心后進(jìn)行視覺識(shí)別與計(jì)算，然后吸取循環(huán)腫瘤細(xì)胞層；

4)將吸取的循環(huán)腫瘤細(xì)胞層移入離心單元外的試管C中，并用轉(zhuǎn)移單元將試管B從離心單元中移出；

5)用轉(zhuǎn)移單元將試管C移入離心單元中，加入緩沖液后離心，棄去上清；

6)向試管C中加入免疫熒光染色試劑，經(jīng)染色孵育后，加入緩沖液，再經(jīng)離心棄上清后，加入固定試劑并混勻；

7)將用固定試劑重懸后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至收集分析單元內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

本實(shí)用新型具有以下有益效果：

(1)本實(shí)用新型的陰性富集裝置是首次實(shí)現(xiàn)陰性富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的自動(dòng)化設(shè)備，結(jié)構(gòu)緊湊，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集和染色步驟均可在離心單元內(nèi)完成，不需要專設(shè)染色平臺(tái)；

(2)本實(shí)用新型的離心單元采用步進(jìn)式移動(dòng)樣本通道位置，便于配合機(jī)械臂工作，使機(jī)械臂與樣本通道通過最短路徑配合，能夠節(jié)約機(jī)械臂反復(fù)移動(dòng)所需時(shí)間，加快整個(gè)流程的進(jìn)度；所述離心平臺(tái)所用離心機(jī)的減速曲線采用智能可控的有剎車減速，與傳統(tǒng)的離心機(jī)自由停車相比，即避免了離心停車對(duì)液體的擾動(dòng)，又節(jié)約了離心時(shí)間。

(3)本實(shí)用新型每個(gè)通道的樣本和試劑操作是獨(dú)立的，樣本和試劑沒有交叉污染，本實(shí)用新型的孵育過程是動(dòng)態(tài)的，有攪拌和外磁強(qiáng)化，且本實(shí)用新型需要對(duì)生物樣本進(jìn)行預(yù)處理的過程是全自動(dòng)的。

附圖說明

圖1是本實(shí)用新型的一個(gè)較佳實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本實(shí)用新型中機(jī)械臂的另一個(gè)較佳實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)以下實(shí)施例中具體方案的替換、轉(zhuǎn)用或組合均包含于本實(shí)用新型的保護(hù)范圍之內(nèi)。采用與本實(shí)用新型裝置類似設(shè)計(jì)流程樣本處理的液體工作站形式，或者采用與本實(shí)用新型方法類似的富集方法，均在本實(shí)用新型的構(gòu)思范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種全自動(dòng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集裝置(圖1)，包括離心單元、轉(zhuǎn)移單元、儲(chǔ)料單元和收集分析單元；其中，離心單元的核心部件為具有12個(gè)樣本通道的數(shù)字化離心機(jī)1，所述離心單元用于液體的離心以及細(xì)胞的染色、清洗和孵育；轉(zhuǎn)移單元由具有橫向(X)和縱向(Y)軌道的兩個(gè)轉(zhuǎn)移機(jī)械頭2-1、2-2組成，該兩個(gè)轉(zhuǎn)移機(jī)械頭還可在垂直操作面的方向上(Z，圖中未示出)移動(dòng)；儲(chǔ)料單元包括試劑儲(chǔ)料倉3、移液槍頭儲(chǔ)料倉4、攪拌棒儲(chǔ)料倉5、試管儲(chǔ)料倉6和廢液儲(chǔ)料倉7，所述試劑儲(chǔ)料倉3中至少儲(chǔ)存有密度梯度離心液、多聯(lián)抗體試劑、免疫熒光染色試劑、細(xì)胞固定試劑和緩沖液，多聯(lián)抗體試劑可結(jié)合白細(xì)胞與紅細(xì)胞；收集分析單元，該收集分析單元包括多個(gè)讀數(shù)盒8，用于收集富集獲得的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)或分析。

進(jìn)一步，離心平臺(tái)的離心機(jī)1為步進(jìn)式離心機(jī)，可根據(jù)需要任意移動(dòng)樣本的通道位置，在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，如圖1所示的a和b位為機(jī)械臂的操作位，每次需要移液操作時(shí)，將樣本離心管轉(zhuǎn)至a和b位，兩個(gè)轉(zhuǎn)移機(jī)械頭2-1、2-2同時(shí)移動(dòng)至此位進(jìn)行添加或吸取液體，固定操作位后，由于機(jī)械臂的移動(dòng)路徑被縮短，且機(jī)械臂和離心機(jī)同時(shí)參與位移，使總的運(yùn)行流程縮短。此外該數(shù)字化離心機(jī)可根據(jù)樣本的離心要求設(shè)定加速與減速曲線，采用的減速曲線是智能可控的有剎車減速，在不擾動(dòng)樣本分層的基礎(chǔ)上，能夠快速剎車，可進(jìn)一步節(jié)省時(shí)間。該離心機(jī)還能夠?qū)崟r(shí)記憶和記錄每個(gè)樣本通道的位置，便于將樣本初始編號(hào)和提取物/分析物樣品編號(hào)的對(duì)應(yīng)，并且每一個(gè)生物樣本在離心過程中的任意位置是有路徑記憶，以及動(dòng)態(tài)與靜態(tài)位置可設(shè)定和控制。

本實(shí)施例的離心單元還包括視覺識(shí)別系統(tǒng)，能夠?qū)﹄x心液體分層的成像、各層吸取液體量和高度進(jìn)行計(jì)算；此外離心機(jī)的通道底部還設(shè)置有混勻機(jī)構(gòu)，可通過自旋和/或搖晃使樣品中的液體混勻。

所述轉(zhuǎn)移單元的機(jī)械臂連有兩個(gè)轉(zhuǎn)移機(jī)械頭2-1和2-2，可以插取和釋放移液槍頭，吸取和吹出液體，此外還可以通過電磁場(chǎng)抓取、轉(zhuǎn)移攪拌棒，所述攪拌棒的上端設(shè)置有鐵磁性物質(zhì)，可被轉(zhuǎn)移機(jī)械頭抓取，此處抓取方式不唯一，能滿足要求的抓取方式都是可行的。

在本實(shí)用新型的另一種實(shí)施方式中，機(jī)械臂除了可以設(shè)置直線軌道外，還可以設(shè)置成繞軸旋轉(zhuǎn)的形式，如圖2所示，該離心單元有兩個(gè)旋轉(zhuǎn)式機(jī)械臂2-3和2-4，它們從左側(cè)可沿軌道滑動(dòng)的儲(chǔ)料倉9中移取槍頭、試劑等，為離心機(jī)1提供液體轉(zhuǎn)移。

如圖1中所示，本實(shí)施例中的離心機(jī)內(nèi)樣本通道為兩個(gè)一組，共6組，機(jī)器運(yùn)行之前在每組通道中的a位置放置全血樣本，b位置放置密度梯度離心液，轉(zhuǎn)移單元?jiǎng)t可在離心機(jī)a通道和b通道之間轉(zhuǎn)移液體，以及在離心機(jī)和試管架之間轉(zhuǎn)移液體和離心試管。

在本實(shí)用新型的一種優(yōu)選實(shí)施例中，樣本的稀釋步驟和密度梯度離心步驟分別在離心機(jī)的a和b位置進(jìn)行，收集獲得的CTC細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至試管儲(chǔ)料倉6上的干凈試管中，然后將該試管轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中進(jìn)行后續(xù)的染色步驟，在此實(shí)施例中轉(zhuǎn)移單元可轉(zhuǎn)移試管，轉(zhuǎn)移試管的方式可以是夾取式、磁抓取式等；在本實(shí)用新型的另一種優(yōu)選實(shí)施例中，樣本的稀釋步驟在試管儲(chǔ)料倉6上的試管中進(jìn)行，用攪拌棒進(jìn)行攪拌混勻，混勻后的液體樣本轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中的a位置，密度梯度離心步驟在b位置進(jìn)行，此實(shí)施例中無需轉(zhuǎn)移試管。

本實(shí)施例中的裝置可同批富集和檢測(cè)6個(gè)樣本，且兼容了樣本前處理過程，運(yùn)行時(shí)間短、效率高。

實(shí)施例2

本實(shí)用新型所述的視覺識(shí)別系統(tǒng)的一種優(yōu)選實(shí)施例的具體計(jì)算方法包括兩部分，分別是吸取液體高度的計(jì)算和需要添加液體高度的計(jì)算，都是根據(jù)視覺識(shí)別系統(tǒng)所拍攝的照片進(jìn)行計(jì)算。

計(jì)算需抽掉的上層液體高度值：根據(jù)樣本所在高度減去照片中上層與下層相接處的高度的差，加上調(diào)整的高度(防止抽液過多對(duì)下層造成擾動(dòng))；

計(jì)算需添加的液體高度值：用設(shè)定的最終高度減去現(xiàn)有液面的高度，必要時(shí)還要減去添加目標(biāo)液體之前所需添加的小劑量試劑的高度。

例如，默認(rèn)全血樣本體積為10mL，離心后樣本分為上層血漿和下層血細(xì)胞，吸取上層血漿后，需添加0.2mL的試劑，然后添加稀釋緩沖液至5mL，其中調(diào)整的高度為0.8mL液體對(duì)應(yīng)的高度，則其計(jì)算的總步驟為兩步：

1)計(jì)算需抽掉的上層血漿的高度值：10mL樣本所在高度減去照片中上層血漿與下層血細(xì)胞相接處的高度的差，加上7mm的高度(0.8mL液體對(duì)應(yīng)的高度)；

2)計(jì)算需添加的稀釋緩沖液高度值：所需稀釋緩沖液為5mL所在高度值減去抽取血漿后的液面高度與需在稀釋緩沖液之前添加的0.2mL的小劑量試劑之和；

例：10mL樣本中共有7mL的上層血漿，則抽取值為6.2mL(7-0.8)，需添加的稀釋緩沖液為1mL(5-3.8-0.2)。

實(shí)施例3

一種全自動(dòng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陰性富集方法，主要包括以下步驟：

1)在離心單元中，交錯(cuò)放置裝有全血樣本的試管A和裝有密度梯度離心液的試管B，在離心單元外的試管架中放置干凈的試管C；

2)向全血樣本試管A中加入緩沖液和交聯(lián)抗體試劑，進(jìn)行混勻和孵育；

3)將孵育后的全血樣本輕輕加入旁邊預(yù)裝了密度梯度離心液的試管B中，經(jīng)離心后進(jìn)行視覺識(shí)別與計(jì)算，然后吸取循環(huán)腫瘤細(xì)胞層；

4)將吸取的循環(huán)腫瘤細(xì)胞層移入離心單元外的試管C中，并用轉(zhuǎn)移單元將試管B從離心單元中移出；

5)用轉(zhuǎn)移單元將試管C移入離心單元中，加入緩沖液后離心，棄去上清；

6)向試管C中加入免疫熒光染色試劑，經(jīng)染色孵育后，加入緩沖液，再經(jīng)離心棄上清后，加入固定試劑并混勻；

7)將用固定試劑重懸后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至收集分析單元內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

具體地，所述陰性富集方法的自動(dòng)化操作步驟可參見表1。

表1CTC陰性富集自動(dòng)化操作步驟

以上詳細(xì)描述了本實(shí)用新型的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本實(shí)用新型的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本實(shí)用新型的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。