專利名稱：一種抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒，更具體地說，本發(fā)明涉及一種操作簡單、 且能夠提高PCR擴(kuò)增特異性的、高特異性的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，即抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒，屬于分子生物學(xué)檢測技術(shù)中的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是最主要的也是很有效的常用技術(shù)。在常規(guī)PCR中，經(jīng)常遇到引物二聚體和其它非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生，最易產(chǎn)生引物二聚體和其它非特異性擴(kuò)增的時段為反應(yīng)液混合后至溫度升高到設(shè)定溫度前，其次為擴(kuò)增的最初數(shù)個循環(huán)，因?yàn)榇藭r引物濃度最高，最易引發(fā)非特異擴(kuò)增，而一旦產(chǎn)生非特異性模板包括引物二聚體，由于其與特異性擴(kuò)增的效率相當(dāng)，并竟?fàn)幍孜锱c酶，往往與特異性擴(kuò)增差不多同時進(jìn)入擴(kuò)增的平臺期，這不僅使擴(kuò)增結(jié)果難以判斷，而且使特異性擴(kuò)增效率降低，尤其在擴(kuò)增粗提的臨床標(biāo)本時，常導(dǎo)致臨床基因診斷的假陽性和假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。用于提高PCR擴(kuò)增特異性的方法已有熱啟動法、固體石蠟?zāi)し?、抗體-酶法等，但這些方法只能部分地達(dá)到降低非特異性擴(kuò)增的目的，而一旦非特異性模板產(chǎn)生，它們均不能有效抑制非特異擴(kuò)增的繼續(xù)進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種操作簡單，且能提高PCR擴(kuò)展特異性的、高特異性的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，即抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒，其英文名稱是suppression polymerase chain reaction， 英文縮寫是S-PCR。本發(fā)明的技術(shù)方案是首先根據(jù)待擴(kuò)增靶DNA序列合成一對特殊的抑制引物，該引物的3’端約15 18個堿基與模板DNA序列互補(bǔ)，其5’端11 14個堿基則與其自身序列形成反向互補(bǔ)；然后溶解引物使引物形成部分雙鏈結(jié)構(gòu)；最后將抑制引物加入含有耐熱 DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水等組成的PCR擴(kuò)增緩沖反應(yīng)體系中，在熱循環(huán)儀上進(jìn)行高溫、低溫、中溫的反復(fù)熱循環(huán)；在溫度較低時(即常規(guī)PCR條件下最易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增和引物二聚體)，由于抑制引物主要以雙鏈形式存在，處于失活狀態(tài)，故大大降低了非特異擴(kuò)增和引物二聚體產(chǎn)生的可能性；以使模板DNA變性、引物與模板復(fù)性、 引物沿模板DNA延伸反復(fù)進(jìn)行，而達(dá)到靶DNA片段在體外呈2n倍擴(kuò)增(其中η為熱循環(huán)次數(shù))，在擴(kuò)增的過程中，當(dāng)溫度降低到退火溫度時，除了與模板特異結(jié)合外，還會有大量的抑制引物自身復(fù)性成雙鏈引物，從而快速降低有效引物的濃度，抑制非特異擴(kuò)增的產(chǎn)生；而一旦產(chǎn)生了非特異性擴(kuò)增的模板，則在后續(xù)的熱循環(huán)中，由于鏈內(nèi)復(fù)性的優(yōu)先性，則會使大部分非特異性擴(kuò)增的單鏈兩端復(fù)性產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)，失去成為有效PCR模板的活性，因而提高了擴(kuò)增的特異性。所用擴(kuò)增緩沖反應(yīng)體系是由抑制引物、耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg++、PCR緩沖液、超純水等組成的，各個成分的終濃度分別如下特異的引物每條0. 2-0. 4umol/ L、Taq DNA聚合酶 l-3U/50ul、dNTPs 底物 0. 2-0. 5讓01/1、模板0嫩若干、]\%++1. 5-3. 5mmol/ L、緩沖液 1-1.5XPCR;其中 IXPCR 緩沖液包括 50mmol/L KC1、lOmmol/LTris. HC1PH8. 3、 0.01%明膠。該S-PCR由于不僅能夠抑制非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生而且能夠抑制非特異性擴(kuò)增進(jìn)行，與常規(guī)PCR方法和其它常見的提高PCR特異性的方法相比，具有很大的優(yōu)越性。根據(jù)上述S-PCR原理，將上述引物和其他PCR試劑混合后分裝到PCR擴(kuò)增管中，并配以系列稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)DNA模板組裝成S-PCR試劑盒。有鑒于此，我們設(shè)計了一種操作簡單、不僅能夠抑制非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生而且能夠抑制非特異性擴(kuò)增進(jìn)行的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)即抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.材料用本室常規(guī)的鹽析法提取30份正常人外周血DNA，作為待擴(kuò)增模板。引物設(shè)計根據(jù)脆性X智力低下1號基因(fragile X mental retardation 1， FMRl)的 5，非翻譯區(qū)序列(GenBanK S74494 和 Nature Genet，8 (1) 88-94，1994)合成以下特異的內(nèi)外側(cè)引物，其中非陰影部分為FMRl特異序列，與模板互補(bǔ)，陰影部分為與其自身序列形成反向互補(bǔ)的序列上游抑制引物Pl :5，-CCA CCG GAA GGT GAT CAC CTT CCG GTG GAG-3，(SEQ ID NO 1)；下游抑制引物P2 :5，-GGC TGA AGA GAA GCT TCT CTT CAG CCC TG-3，(SEQ ID NO 2)；2.抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒的反應(yīng)S-PCR 混合50ul反應(yīng)體系，內(nèi)含內(nèi)、外側(cè)引物(PI、P2)各IOpmol，正常人DNA 5-10ng, IX PCR 緩沖液，Taq DNA 聚合酶 2u，Mg++ 終濃度 2mmol/L，然后在 PE9600 上 96°C下變性5分鐘，然后按96°C 20秒，65°C 40秒，72°C 1分30秒熱循環(huán)35次。3. 2. 5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，GelDoclOOO下觀察，灰度掃描分析記錄各聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的結(jié)果。4.結(jié)果在30個標(biāo)本的S-PCR反應(yīng)和對應(yīng)的常規(guī)PCR中都獲得了預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物條帶，未加DNA標(biāo)本的陰性對照未見相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物，并且未發(fā)現(xiàn)非特異擴(kuò)增的產(chǎn)物帶。本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測技術(shù)中的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種操作簡單、特異性高的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)即抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒， 其英文名稱是suppression polymerase chain reaction英文縮寫是S-PCR ；首先根據(jù)待擴(kuò)增靶DNA序列合成一對特殊的抑制引物，該引物的3’端約15 18個堿基與模板DNA序列互補(bǔ)，其5’端11 14個堿基則與其自身序列形成反向互補(bǔ)；然后溶解引物使引物形成部分雙鏈結(jié)構(gòu)；最后將抑制引物加入含有耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水等組成的PCR擴(kuò)增緩沖反應(yīng)體系中，在熱循環(huán)儀上進(jìn)行高溫、低溫、中溫的反復(fù)熱循環(huán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒，其特征在于所用引物為一對特殊的抑制引物，該引物的3’端約15 18個堿基與模板DNA序列互補(bǔ)，其5’端 11 14個堿基則與其自身序列形成反向互補(bǔ)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒，其特征在于所述擴(kuò)增緩沖反應(yīng)體系中各成分及其濃度含量分別如下抑制引物各0. 2-0. 4umol/L、Taq DNA聚合酶 l-3U/50ul、dNTPs 底物 0. 2-0. 5mmol/L、模板 DNA 若干、Mg++1. 5-3. 5mmol/L、緩沖液 1-1.5XPCR;其中 IXPCR 緩沖液包括 50mmol/L KCU10mmol/L Tris. HC1PH8. 3、0. 01 % 明膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒，根據(jù)該技術(shù)要求所組裝的抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種操作簡單、特異性高的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)即抑制聚合酶鏈反應(yīng)檢測試劑盒，其英文名稱是suppression polymerase chain reaction，英文縮寫是S-PCR，首先根據(jù)待擴(kuò)增靶DNA序列合成一對特殊的抑制引物，該引物的3’端約15～18個堿基與模板DNA序列互補(bǔ)，其5’端11～14個堿基則與其自身序列形成反向互補(bǔ)；然后溶解引物使引物形成部分雙鏈結(jié)構(gòu)；最后將抑制引物加入含有耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水等組成的PCR擴(kuò)增緩沖反應(yīng)體系中，在熱循環(huán)儀上進(jìn)行高溫、低溫、中溫的反復(fù)熱循環(huán)；在擴(kuò)增的過程中，當(dāng)溫度降低到退火溫度時，除了與模板特異結(jié)合外，還會有大量的抑制引物自身復(fù)性成雙鏈引物，由于鏈內(nèi)復(fù)性的優(yōu)先性，則會使大部分非特異性擴(kuò)增的單鏈兩端復(fù)性產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)，失去成為有效PCR模板的活性，因而提高了擴(kuò)增的特異性。
文檔編號C12Q1/68GK102251027SQ20111015026
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者劉欽松, 夏慶杰 申請人:劉欽松