發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及在過繼性細(xì)胞療法(act)中有用的嵌合蛋白。所述嵌合蛋白可以起自殺基因作用，使得表達(dá)所述嵌合蛋白的細(xì)胞能夠被刪除。本發(fā)明還提供編碼此類嵌合蛋白的核酸，包含此類核酸的細(xì)胞及其治療用途。

發(fā)明背景

過繼性細(xì)胞療法

過繼免疫療法是已經(jīng)建立且不斷發(fā)展的治療方法。在同種異體造血干細(xì)胞移植(hsct)的背景中，經(jīng)常給予供體淋巴細(xì)胞輸注(dli)以治療血液惡性腫瘤的復(fù)發(fā)。腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(til)在治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中是有效的。對t細(xì)胞的遺傳工程化大大增加了t細(xì)胞療法的范圍和效力：t細(xì)胞受體轉(zhuǎn)移允許靶向細(xì)胞內(nèi)癌癥抗原，而嵌合抗原受體(car)允許靶向表面癌癥或譜系特異性抗原。已經(jīng)使用兩種方法觀察了臨床反應(yīng)，并且正在進(jìn)行許多進(jìn)一步的試驗(yàn)。

過繼性免疫療法后可發(fā)生急性不良事件。移植物抗宿主病(gvhd)是dli的常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥。工程化t細(xì)胞的施用也導(dǎo)致毒性。例如，在針對黑色素瘤抗原的天然t細(xì)胞受體轉(zhuǎn)移研究中已經(jīng)報(bào)道了中靶脫腫瘤毒性(on-targetoff-tumourtoxicity)；再定向(re-directed)至腎細(xì)胞癌抗原碳酸酐酶ix(caix)的t細(xì)胞產(chǎn)生出乎意料的肝毒性。cd19car療法后報(bào)道了免疫激活綜合征。最后，載體誘導(dǎo)的插入誘變導(dǎo)致淋巴增殖性病癥的理論風(fēng)險。這些毒性的發(fā)生率和嚴(yán)重性是不可預(yù)知的。此外，與其不良事件通常以治療劑的半衰期減退的治療性蛋白或小分子相反，t細(xì)胞植入并且復(fù)制，這潛在地導(dǎo)致升高且暴發(fā)性毒性。

自殺基因

自殺基因是遺傳編碼的機(jī)制，其允許在面對不可接受的毒性時選擇性地破壞過繼性轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，例如t細(xì)胞。已經(jīng)在臨床研究中測試了兩種自殺基因：單純皰疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)和誘導(dǎo)型胱天蛋白酶9(icasp9)。

單純皰疹病毒i來源的胸苷激酶(hsv-tk)基因已經(jīng)用作供體t細(xì)胞輸注的體內(nèi)自殺開關(guān)，用于治療造血干細(xì)胞移植后的復(fù)發(fā)性惡性腫瘤和埃巴病毒(ebv)淋巴增殖。然而，對引起移植物抗宿主病的t細(xì)胞的破壞是不完全的，并且使用更昔洛韋(或類似物)作為前藥來激活hsv-tk，排除了更昔洛韋作為巨細(xì)胞病毒感染的抗病毒藥物的施用。此外，即使在免疫抑制的人類免疫缺陷病毒和骨髓移植患者中，hsv-tk導(dǎo)向的免疫應(yīng)答也導(dǎo)致hsv-tk轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的消除，損害了輸注的t細(xì)胞的持續(xù)性并因此降低其功效。

在原始icasp9分子中利用了胱天蛋白酶9背后的活化機(jī)制。胱天蛋白酶被活化所需要的所有，是克服胱天蛋白酶同二聚化的能量障礙。同二聚體經(jīng)歷構(gòu)象變化，且二聚體對之一的蛋白水解結(jié)構(gòu)域變得有活性。在生理上，這通過胱天蛋白酶9的card結(jié)構(gòu)域結(jié)合到apaf-1而發(fā)生。在icasp9中，apaf-1結(jié)構(gòu)域被修飾的fkbp12替代，所述修飾的fkbp12已經(jīng)突變以選擇性地結(jié)合二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)。cid的存在導(dǎo)致同二聚化和活化。icasp9基于與人fk506結(jié)合蛋白(fkbp)融合的經(jīng)修飾的人胱天蛋白酶9(straathofetal.,(2005)blood105：4247-4254)。其使得能夠在稱為ap1903的小分子cid的存在下進(jìn)行條件性二聚化。ap1903是一種實(shí)驗(yàn)性藥物，并認(rèn)為是生物惰性的，因?yàn)樗慌c野生型fkbp12相互作用。然而，使用該試劑的臨床經(jīng)驗(yàn)限于非常少數(shù)的患者(distasi,a.etal.(2011)n.engl.j.med.365,1673–1683；andiuliucci,j.d.etal.(2001)j.clin.pharmacol.41,870–879)。ap1903也是一種相對較大的極性分子，且不太可能穿過血腦屏障。

在一種替代方法中，使用復(fù)雜策略可以通過小分子活化執(zhí)行劑(executioner)胱天蛋白酶，該策略涉及將煙草蝕刻病毒(tev)蛋白水解位點(diǎn)導(dǎo)入胱天蛋白酶3或6或7和與分開的tev蛋白酶(其在雷帕霉素的存在下重組)共表達(dá)(morganetal(2014)methodsenzymol.544:179-213)。這由于一些原因?qū)τ谂R床上有用的自殺開關(guān)來說是不滿意的策略：首先需要三種分開的蛋白質(zhì)，這是高度復(fù)雜的：分別是修飾的胱天蛋白酶和拆分的tev蛋白酶的兩個組分；其次，tev組分是異種的(xenogeneic)，可能具有免疫原性；最后，該策略僅活化蛋白酶敏感的胱天蛋白酶分子，其是頂端(apical)胱天蛋白酶下游的且相比頂端(apical)胱天蛋白酶較不敏感。

已經(jīng)描述了基于fas的cid活化的自殺基因(amaraetal(1999)hum.genether.10,2651–2655)。這也取決于該cid用于激活，并且由于它不直接活化細(xì)胞凋亡級聯(lián)，因此逃避(通過fas抗性)是可能的。

基于替換實(shí)驗(yàn)性cid需求的標(biāo)準(zhǔn)藥物的同二聚化體系將是有吸引力的替代方案。然而，沒有同二聚化小分子藥物可用。

已經(jīng)提出了其它自殺基因，例如全長cd20，當(dāng)在t細(xì)胞上表達(dá)時可以使t細(xì)胞對通過治療性抗cd20抗體利妥昔單抗(rituximab)的裂解易感(introna,m.etal.(2000)hum.genether.11,611–620)。關(guān)于抗體識別這一主題還描述了其它自殺基因，例如：rqr8使t細(xì)胞對cd20易感，但比全長cd20分子更緊湊(philip,b.etal.(2014)blooddoi:10.1182/blood-2014-01-545020)；egfr的截短形式(huegfrt)使得細(xì)胞對通過抗egfrmab的裂解易感(wang,x.etal.(2011)blood118,1255–1263)；以及在細(xì)胞表面上表達(dá)的myc表位標(biāo)簽使得細(xì)胞對使用抗myc抗體的裂解易感(kiebacketal(2008)proc.natl.acad.sci.u.s.a.105,623–628)。這些抗體依賴性方法的主要限制是它們依賴于起作用的高局部濃度的治療性抗體的生物可用度。已知例如裂解性抗體對于大塊疾病(bulkydisease)并不特別有效，并且基于抗體的自殺基因的限制是在沒有達(dá)到高抗體濃度的細(xì)胞駐留者(resident)將會逃逸。此外，在某些情況下：例如由cart細(xì)胞誘導(dǎo)的嚴(yán)重的巨噬細(xì)胞活化綜合征或細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokinestorm)；由單克隆抗體誘導(dǎo)的額外的免疫活化可能對自殺基因活化嘗試治療的臨床情況是有害的。

因此，需要與上述缺點(diǎn)不相關(guān)的替代性自殺基因。

附圖簡述

圖1-顯示rapcasp9的不同方法的草圖。(a)雙重構(gòu)建體，其中兩個分子單獨(dú)表達(dá)。每個分子具有分別與fkbp12或frb融合的casp9的催化結(jié)構(gòu)域。(b)單一構(gòu)建體，其中fkbp12和frb直接融合在一起，然后通過柔性接頭與casp9的催化結(jié)構(gòu)域融合。在此取向上，自身異二聚化應(yīng)當(dāng)是不可能的。(c)單一構(gòu)建體，其中胱天蛋白酶9的催化結(jié)構(gòu)域側(cè)翼有frb和fkbp12。這里，自身異二聚化可以發(fā)生，因此預(yù)計(jì)這種重復(fù)(iteration)不會很好地發(fā)揮功能。(d)雙重構(gòu)建體，其中半胱氨酸蛋白酶9的催化結(jié)構(gòu)域融合到fkbp12融合和分開的小蛋白質(zhì)，其是共表達(dá)的兩拷貝frb的融合物。

圖2-證明了可以用異二聚化劑(heterodimerizer)活化胱天蛋白酶9。t細(xì)胞用單獨(dú)egfp轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖2a)，或用fkbp12-dcasp9(共表達(dá)egfp)和frb-dcasp9(共表達(dá)ebfp2)共轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖2b)。有意地僅部分轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞，使得非轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞作為內(nèi)部對照起作用。然后將t細(xì)胞暴露于降低濃度的雷帕霉素。48小時后，細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白-v和7aad染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析，觀察表達(dá)熒光蛋白的活細(xì)胞比例。即使在最低濃度的雷帕霉素的存在下也非常有效地刪除表達(dá)egfp和ebfp2兩者的t細(xì)胞。

圖3-rapcasp9變體的功能。(a)使用單獨(dú)的egfp轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞；(b)使用分別與egfp和ebfp2共表達(dá)的fkbp12-casp9和frb-casp9雙重轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞；(c)使用frb-fkbp12-casp9轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞以及(d)使用frb-casp9-fkbp12轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞和(e)fbp12-casp9-2a-frb-frbw轉(zhuǎn)導(dǎo)。僅轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的部分，陰性細(xì)胞作為內(nèi)部陰性對照起作用。將t細(xì)胞暴露于2.5nm雷帕霉素48小時。然后用膜聯(lián)蛋白-v和7aad染色t細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。如通過膜聯(lián)蛋白-v和7aad染色測定，在活細(xì)胞上顯示了egfp對ebfp2。

圖4-雷帕霉素和雷帕霉素類似物(rapalogs)。a)雷帕霉素；b)c-20-methyllyrlrapamycin(marap)；c)c16(s)-丁基磺胺雷帕霉素(c16(s)-butylsulfonamidorapamycin)(c16-bs-rap)；d)c16-(s)-3-甲基吲哚雷帕霉素(c16-(s)-3-mehylindolerapamycin)(c16-irap)；和e)c16-(s)-7-甲基吲哚雷帕霉素(c16-(s)-7-methylindolerapamycin)(ap21976/c16-airap)。

圖5-實(shí)施例3中測試的構(gòu)建體的總結(jié)。

圖6-實(shí)施例3的門控(gating)策略總結(jié)。

圖7、8和9-研究顯示用各種濃度的雷帕霉素孵育后用圖5中所示構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的jurkat細(xì)胞的殺傷。

圖10-總結(jié)圖7、8和9所示的facs數(shù)據(jù)的圖。

圖11-比較雷帕霉素對替西羅莫司(temsirolimus)存在下的jurkat細(xì)胞殺傷的圖。

發(fā)明概述

本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了新的自殺基因，其在二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)例如雷帕霉素或雷帕霉素類似物的存在下二聚化。

雷帕霉素和雷帕霉素類似物通過在mtor的frb結(jié)構(gòu)域和fkbp12之間形成界面誘導(dǎo)異二聚化。該結(jié)合導(dǎo)致fkbp12阻斷對mtor活性位點(diǎn)的接近，從而抑制其功能。盡管mtor是一種非常大的蛋白，但對于與雷帕霉素相互作用所要求的mtor的精確小區(qū)段是已知的并可以使用。

本發(fā)明人已經(jīng)顯示了可以使用由雷帕霉素介導(dǎo)的異二聚化來誘導(dǎo)胱天蛋白酶的同二聚化。具體而言，他們已經(jīng)令人驚訝地顯示了可以創(chuàng)建多結(jié)構(gòu)域分子，其包括(i)mtor的frb結(jié)構(gòu)域；(ii)fkbp12；和(iii)胱天蛋白酶，使用該分子的一個拷貝的frb結(jié)構(gòu)域和該分子的另一個拷貝的fkb12結(jié)構(gòu)域之間的異二聚化以引起胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域的同二聚化。

因此，在本發(fā)明的第一個方面的第一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有以下式的嵌合蛋白：

ht1-ht2-casp

其中

casp是胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域；

ht1是第一異二聚化結(jié)構(gòu)域；和

ht2是第二異二聚化結(jié)構(gòu)域

且其中，在二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)的存在下，嵌合蛋白的相同對相互作用使得來自一個嵌合蛋白的ht1與來自另一個嵌合蛋白的ht2異二聚化，導(dǎo)致兩個胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域的同二聚化。

構(gòu)造為使得ht1不以任何顯著程度與相同嵌合蛋白中的ht2異二聚化。

胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域可以包含選自下組的引發(fā)劑(initiator)胱天蛋白酶：胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-10，或選自胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7的執(zhí)行劑(executioner)胱天蛋白酶。

在本發(fā)明的第一個方面的此第一個實(shí)施方案的多結(jié)構(gòu)域蛋白中，一個異二聚化結(jié)構(gòu)域可以包含fk506結(jié)合蛋白(fkbp)，而另一個異二聚化結(jié)構(gòu)域可以包含mtor的frb結(jié)構(gòu)域。

對于該異二聚化結(jié)構(gòu)域組合，適合的cid是雷帕霉素或雷帕霉素類似物。

在本發(fā)明的第一個方面的第二個實(shí)施方案中，提供了包含胱天蛋白酶和異二聚化結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白，所述異二聚化結(jié)構(gòu)域包含fk506結(jié)合蛋白(fkbp)，和包含胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域和異二聚化結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白，所述異二聚化結(jié)構(gòu)域包含mtor的frb結(jié)構(gòu)域。

在本發(fā)明的該方面的第三個實(shí)施方案中，提供以下兩種蛋白：

ht1-casp和ht2-ht2

其中ht1-casp是包含胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域(casp)和第一異二聚化結(jié)構(gòu)域(ht1)的嵌合蛋白；且ht2-ht2是包含兩個或更多個第二異二聚化結(jié)構(gòu)域(ht2)的界面蛋白；并且

其中在二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)的存在下，嵌合蛋白ht1-casp9的對相互作用使得來自每個嵌合蛋白的ht1與來自界面(interfacing)蛋白的ht2結(jié)構(gòu)域異二聚化，導(dǎo)致兩個胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域的同二聚化。

在本發(fā)明的該方面的第四個實(shí)施方案中，提供了具有以下式的嵌合蛋白：

ht1-casp-ht2

其中

casp是胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域；

ht1是第一異二聚化結(jié)構(gòu)域；和

ht2是第二異二聚化結(jié)構(gòu)域

且其中，在二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)的存在下，嵌合蛋白的相同對相互作用使得來自一個嵌合蛋白的ht1與來自另一個嵌合蛋白的ht2異二聚化，導(dǎo)致兩個胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域的同二聚化。

關(guān)于本發(fā)明的第一個方面的該第四個實(shí)施方案，在一個異二聚化結(jié)構(gòu)域包含fk506結(jié)合蛋白(fkbp)而另一個二聚化結(jié)構(gòu)域包含mtor的frb結(jié)構(gòu)域，且cid為雷帕霉素或其衍生物的情況下，則可以使用小于5nm的濃度，例如1-3nm或約1nm以引起兩個胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域的同二聚化。

嵌合蛋白可以包含與fkbp12融合的胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域，且界面蛋白可以是兩個或更多個frb結(jié)構(gòu)域的融合。這兩個或更多個frb結(jié)構(gòu)域作為界面起作用，使兩個fkbp12-casp結(jié)構(gòu)域在一起。

在第二個方面，本發(fā)明提供核酸序列，其編碼根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的嵌合蛋白。

核酸序列可以以核酸構(gòu)建體的形式，其包含多個核酸序列。例如，構(gòu)建體可以包含一個或多個根據(jù)本發(fā)明的第二個方面的核酸序列和編碼t細(xì)胞受體(tcr)或嵌合抗原受體(car)的核酸序列。

核酸構(gòu)建體可以包含：

i)編碼嵌合蛋白的第一核酸，所述嵌合蛋白包含胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域和異二聚化結(jié)構(gòu)域，所述異二聚化結(jié)構(gòu)域包含fk506結(jié)合蛋白(fkbp)；和

ii)編碼嵌合蛋白的第二核酸，所述嵌合蛋白包含胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域和異二聚化結(jié)構(gòu)域，所述異二聚化結(jié)構(gòu)域包含mtor的frb結(jié)構(gòu)域。

還提供了具有以下結(jié)構(gòu)的核酸構(gòu)建體：

ht1-casp-coexpr-ht2-ht2

其中

casp是編碼胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域的核酸序列；

ht1是編碼第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的核酸序列；

ht2是編碼第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的核酸序列；和

coexpr是允許ht1-casp和ht2-ht2共表達(dá)的核酸序列，

其中所述核酸構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致嵌合蛋白ht1-casp和界面蛋白ht2-ht2的產(chǎn)生，且其中在二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)的存在下，所述嵌合蛋白ht1-casp9的對相互作用，使得來自每個嵌合蛋白的ht1與來自界面蛋白的ht2結(jié)構(gòu)域異二聚化，導(dǎo)致兩個胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域的同二聚化。

ht1可以包含fk506結(jié)合蛋白(fkbp)且ht2可以包含mtor的frb結(jié)構(gòu)域。

核酸構(gòu)建體還可以包含編碼t細(xì)胞受體(tcr)或嵌合抗原受體(car)的核酸序列。

在第三個方面，本發(fā)明提提供載體，其包含根據(jù)本發(fā)明的第二個方面的核酸序列或核酸構(gòu)建體。

載體還可以包含感興趣的核苷酸，例如編碼嵌合抗原受體或t細(xì)胞受體的核苷酸序列，使得當(dāng)載體用于轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞時，靶細(xì)胞共表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的嵌合蛋白和嵌合抗原受體或t細(xì)胞受體。

在本發(fā)明的第四個方面，提供細(xì)胞，其表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的嵌合蛋白。

細(xì)胞可以包含：

i)第一嵌合蛋白，所述第一嵌合蛋白包含胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域和異二聚化結(jié)構(gòu)域，所述異二聚化結(jié)構(gòu)域包含fk506結(jié)合蛋白(fkbp)；和

ii)第二嵌合蛋白，所述第二嵌合蛋白包含胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域和異二聚化結(jié)構(gòu)域，所述異二聚化結(jié)構(gòu)域包含mtor的frb結(jié)構(gòu)域。

還提供表達(dá)兩種蛋白的細(xì)胞：

ht1-casp和ht2-ht2

其中ht1-casp是包含胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域(casp)和第一異二聚化結(jié)構(gòu)域(ht1)的嵌合蛋白；且ht2-ht2是包含兩個第二異二聚化結(jié)構(gòu)域(ht2)的界面蛋白；且

其中在二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)的存在下，所述嵌合蛋白ht1-casp9的對相互作用，使得來自每個嵌合蛋白的ht1與來自界面蛋白的ht2結(jié)構(gòu)域異二聚化，導(dǎo)致兩個胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域的同二聚化。

細(xì)胞可以包含根據(jù)本發(fā)明的第二個方面的核酸序列或構(gòu)建體。

細(xì)胞可以例如是造血干細(xì)胞，淋巴細(xì)胞或t細(xì)胞。

還提供了制備根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞的方法，其包括使用根據(jù)本發(fā)明的第三個方面的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟。

還提供刪除根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞的方法，其包括將細(xì)胞暴露于二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)的步驟。

cid可以是雷帕霉素或雷帕霉素類似物。

還提供用于預(yù)防或治療受試者中的疾病的方法，其包括向所述受試者施用根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞的步驟。

該方法可以包括以下步驟：

(i)使用根據(jù)根據(jù)本發(fā)明的第二個方面的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染從受試者分離的細(xì)胞樣品，和

(ii)將轉(zhuǎn)導(dǎo)的/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞施用至患者。

方法可以用于治療癌癥。

還提供用于預(yù)防和/或治療受試者中病理性免疫反應(yīng)的方法，所述病理性免疫反應(yīng)由將根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞施用至受試者引起，所述方法包括向所述受試者施用雷帕霉素或雷帕霉素類似物的步驟。

病理性免疫反應(yīng)可以選自下組：移植物抗宿主??；中靶脫腫瘤毒性(on-target,off-tumourtoxicity)；免疫活化綜合征；和淋巴組織增殖性病癥。

用于治療或預(yù)防受試者中的疾病的方法可以包括以下步驟：

(i)將根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞施用至所述受試者；

(ii)監(jiān)控所述受試者的病理性免疫反應(yīng)的形成；和

(iii)如果所述受試者顯示正在形成或已經(jīng)形成病理性免疫反應(yīng)的體征，則向所述受試者施用雷帕霉素或雷帕霉素類似物。

還提供了根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞，其用于造血干細(xì)胞移植、淋巴細(xì)胞輸注或過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

還提供雷帕霉素或雷帕霉素類似物，其用于預(yù)防或治療由向受試者施用根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞引起的病理性免疫反應(yīng)。

因此，本發(fā)明提供了自殺基因，其面對不可接受的毒性時允許選擇性破壞過繼輸注的細(xì)胞，且其由雷帕霉素和/或其類似物活化。

雷帕霉素是具有充分了解的性質(zhì)，極好的生物利用度和分布體積、且廣泛可用的標(biāo)準(zhǔn)藥物。雷帕霉素也不加重所治療的病癥，事實(shí)上，由于它是一種免疫抑制劑，其可能對不需要的毒性以及其自殺基因功能具有有益的影響。

發(fā)明詳述

嵌合蛋白

本發(fā)明涉及嵌合蛋白，其作為自殺基因發(fā)揮作用。通過施用二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)例如雷帕霉素或雷帕霉素類似物可以在體內(nèi)或體外刪除表達(dá)該嵌合蛋白的細(xì)胞。

嵌合蛋白可以具有以下式：

ht1-ht2-casp

其中

casp是胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域；

ht1是第一異二聚化結(jié)構(gòu)域；和

ht2是第二異二聚化結(jié)構(gòu)域。

嵌合蛋白可以具有以下式：

ht1-ht2-l-casp

其中casp、ht1和ht2如上文所定義，且l是任選的接頭。

構(gòu)造應(yīng)當(dāng)使得ht1不與相同嵌合蛋白分子中的ht2顯著異二聚化，但當(dāng)兩個嵌合蛋白在二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)的存在下在一起時，來自一個嵌合蛋白的ht1與來自另一個嵌合蛋白的ht2異二聚化，導(dǎo)致兩個胱天蛋白酶的同二聚化。

構(gòu)造使得ht1不以任何顯著的程度與相同嵌合蛋白中的ht2異二聚化。例如，在表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的第一方面的該實(shí)施方案的嵌合蛋白的細(xì)胞中，cid的存在應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致比相同嵌合蛋白內(nèi)的異二聚化更大比例的兩個嵌合蛋白之間的二聚化。在細(xì)胞或細(xì)胞群體中或在溶液中相同分子內(nèi)的異二聚化的嵌合蛋白的量在cid的存在下可以是與分開的嵌合蛋白分子異二聚化的嵌合蛋白的量的小于50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％。

嵌合蛋白可以包含如seqidno.1所示的序列：

seqidno.1(frb-fkbp12-l3-dcasp9)

在以上序列中“fkbp12”是指fkbp12的序列；“dcasp9”是指casp9的催化結(jié)構(gòu)域；“l(fā)1”是一重復(fù)接頭(onerepeatlinker)；“fmd-2a”是口蹄疫2a樣肽erav；“frb”是mtor的frb結(jié)構(gòu)域；“l(fā)3”是二重復(fù)接頭(tworepeatlinker)；且“frbw”是密碼子擺動的frb。

在第二個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供“兩分子”自殺基因系統(tǒng)，其中cid是雷帕霉素或雷帕霉素類似物。

因此，本發(fā)明還提供i)嵌合蛋白，其包含胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域和異二聚化結(jié)構(gòu)域，所述異二聚化結(jié)構(gòu)域包含fk506結(jié)合蛋白(fkbp12)；和ii)嵌合蛋白，其包含胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域和異二聚化結(jié)構(gòu)域，所述異二聚化結(jié)構(gòu)域包含mtor的frb結(jié)構(gòu)域。

當(dāng)細(xì)胞例如t細(xì)胞表達(dá)這些嵌合蛋白兩者時，雷帕霉素或雷帕霉素類似物的存在導(dǎo)致i)的包含fkbp的結(jié)構(gòu)域的與ii)的包含frb的結(jié)構(gòu)域異二聚化，從而導(dǎo)致i)和ii)的胱天蛋白酶的同二聚化。

在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，嵌合蛋白可以包含如seqidno.2或3所示的序列。

seqidno.2(fkbp12-dcasp9)

seqidno.3(frb-dcasp9)

在第三個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了備選的“兩分子”方法，其具有比第二個實(shí)施方案更小的足跡(footprint)。這里，ht1與胱天蛋白酶融合，以及第二分子包含共表達(dá)的ht2-ht2融合物。在cid的存在下，ht2-ht2將兩個個ht1-casp分子帶到一起。實(shí)際上，這可以通過共表達(dá)fkbp12-casp9與frb-frb并使用雷帕霉素活化來實(shí)施。方便地，這些組分可以與口蹄疫2a樣肽共表達(dá)。編碼第二ht2(例如frb)的序列可以進(jìn)行密碼子擺動以防止重組。

seqidno.4(fkbp12-dcasp9-2a-frb-frbw)

在上述序列中，“fkbp12”指代fkbp12；“dcasp9”是casp9的催化結(jié)構(gòu)域；“l(fā)1”是一重復(fù)接頭；“fmd-2a”是口蹄疫2a樣肽erav；“frb”是mtor的frb結(jié)構(gòu)域；“l(fā)2”是二重復(fù)接頭；且“frbw”是密碼子擺動的frb。

胱天蛋白酶

胱天蛋白酶，或半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶或半胱氨酸依賴性天冬氨酸定向蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族，其在凋亡中發(fā)揮重要功能。

已經(jīng)在人類中鑒定了12種胱天蛋白酶。存在兩種類型的凋亡胱天蛋白酶：引發(fā)劑胱天蛋白酶和執(zhí)行劑胱天蛋白酶。引發(fā)劑胱天蛋白酶，如胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-10，切割效應(yīng)胱天蛋白酶的非活性的原形式，從而活化它們。執(zhí)行劑胱天蛋白酶，例如胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6和胱天蛋白酶-7，然后切割細(xì)胞內(nèi)的其它蛋白底物，以觸發(fā)凋亡過程。

本發(fā)明的第一個方面的嵌合蛋白的胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域可以包含選自胱天蛋白酶-2；胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-10的引發(fā)劑胱天蛋白酶；或者選自胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6和胱天蛋白酶-7的執(zhí)行劑胱天蛋白酶。

特別地，本發(fā)明的第一個方面的嵌合蛋白的胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域可以包含胱天蛋白酶-9。胱天蛋白酶-9是關(guān)鍵的引發(fā)劑胱天蛋白酶，因此其活化是對于凋亡誘導(dǎo)非常敏感的觸發(fā)子(trigger)。此外，同二聚化是活化所需要的全部，而不是同二聚化和蛋白水解切割。

全長胱天蛋白酶-9具有如seqidno.5所示的序列。

seqidno.5(胱天蛋白酶-9)

1mdeadrrllrrcrlrlveelqvdqlwdallsselfrphmiediqragsgsrrdqarqlii

61dletrgsqalplfiscledtgqdmlasflrtnrqaaklskptlenltpvvlrpeirkpev

121lrpetprpvdigsggfgdvgaleslrgnadlayilsmepcghcliinnvnfcresglrtr

181tgsnidceklrrrfssphfmvevkgdltakkmvlallelaqqdhgaldccvvvilshgcq

241ashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevas

301tspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksg

361swyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcfnflrkklffkts

可以截短胱天蛋白酶-9，例如去除胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域。截短的胱天蛋白酶-9如seqidno.6所示。

seqidno.6(截短的胱天蛋白酶-9，缺少card結(jié)構(gòu)域)

gfgdvgaleslrgnadlayilsmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelaqqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcfnflrkklffkts

本發(fā)明的第一個方面的嵌合蛋白可以包含seqidno.5或seqidno.6或其保留了二聚化從而觸發(fā)凋亡的能力的片段或變體。

變體胱天蛋白酶可以與seqidno.5或6具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性。

可以通過程序例如blast(其在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov可免費(fèi)獲得)容易地確定兩條肽序列之間的百分比同一性。

在體內(nèi)，蛋白酶胱天蛋白酶9是稱為凋亡體(apoptosome)的多組分通路的中心參與者，所述凋亡體控制胚胎發(fā)生期間的細(xì)胞刪除，以及觸發(fā)細(xì)胞死亡以及致死細(xì)胞損害，例如離子輻射或化療藥物的生理應(yīng)答。胱天蛋白酶9的功能是通過有限的蛋白水解生成活性形式的胱天蛋白酶3和7，并從而將凋亡信號傳輸至執(zhí)行階段。然而，胱天蛋白酶9在其緊密相關(guān)物中的不尋常之處在于大亞基和小亞基之間的蛋白水解不將潛伏的酶原(zymogen)轉(zhuǎn)化為催化形式。事實(shí)上，對于活化所必需的是同二聚化。

異二聚化結(jié)構(gòu)域

大環(huán)內(nèi)酯類雷帕霉素和fk506通過誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白的異二聚化發(fā)揮作用。每個藥物以高親和力結(jié)合fkbp12蛋白，創(chuàng)建藥物-蛋白復(fù)合物，其隨后分別結(jié)合并失活mtor/frap和鈣依賴磷酸酶(calcineurin)。已經(jīng)定義了mtor的fkbp-雷帕霉素結(jié)合(frb)結(jié)構(gòu)域并作為分離的89個氨基酸的蛋白部分應(yīng)用，其可以與感興趣的蛋白融合。然后雷帕霉素可以誘導(dǎo)frb融合物與fkbp12或與fkbp12融合的蛋白的接近。

在本發(fā)明的語境中，異二聚化結(jié)構(gòu)域之一(ht1或ht2)可以是或包含frb或其變體，且另一個異二聚化結(jié)構(gòu)域(ht2或ht1)可以是或包含fkbp12或其變體。

雷帕霉素具有理想的二聚化劑的幾個特性：當(dāng)結(jié)合至fkbp12時，其對于frb具有高親和力(kd＜1nm)，且對于mtor的frb結(jié)構(gòu)域具有高特異性。雷帕霉素是一種有效的治療性免疫抑制劑，其在哺乳動物中具有有利的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)概況。具有不同的藥代動力學(xué)和動態(tài)特性的雷帕霉素的藥理學(xué)類似物例如依維莫司(everolimus)、替西羅莫司(temsirolimus)和德福莫林(deforolimus)(benjaminetal,naturereviews,drugdiscovery,2011)也可以根據(jù)臨床設(shè)置使用。

為了防止雷帕霉素結(jié)合并失活內(nèi)源性mtor，可以修飾接觸frb的雷帕霉素的表面。對frb結(jié)構(gòu)域的補(bǔ)償突變以形成容納“突起的”雷帕霉素的表面(burface)僅恢復(fù)與frb突變體而不與內(nèi)源性mtor蛋白的二聚化相互作用。

bayle等人(chembio；2006；13；99-107)描述了多種雷帕霉素類似物，或“rapalog”，以及其相應(yīng)的經(jīng)修飾的frb結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，bayle等人(2006)描述了以下雷帕霉素類似物：c-20-methyllyrlrapamycin(marap)；c16(s)-丁基磺胺雷帕霉素(c16-bs-rap)和c16-(s)-7-甲基吲哚雷帕霉素(ap21976/c16-airap)，如圖3中所示，與每種各自的相應(yīng)互補(bǔ)結(jié)合結(jié)構(gòu)域組合。其它雷帕霉素/雷帕霉素類似物包括西羅莫司(sirolimus)和他克莫司(tacrolimus)。

嵌合蛋白的異二聚化結(jié)構(gòu)域可以是或包含如seqidno:7至seqidno:11所示的序列之一，或其變體。

seqidno7-fkbp12結(jié)構(gòu)域

mgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkfdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkle

seqidno8-mtor的野生型frb區(qū)段

masrilwhemwhegleeasrlyfgernvkgmfevleplhammergpqtlketsfnqaygrdlmeaqewcrkymksgnvkdltqawdlyyhvfrriskles

seqidno9-2098處具有t至l取代的frb，其允許結(jié)合ap21967

masrilwhemwhegleeasrlyfgernvkgmfevleplhammergpqtlketsfnqaygrdlmeaqewcrkymksgnvkdllqawdlyyhvfrriskles

seqidno10-mtor的frb區(qū)段，其在完全mtor的2098處具有t至h取代和殘基2101處的f取代為w，其以相對于野生型降低的親和力結(jié)合雷帕霉素

masrilwhemwhegleeasrlyfgernvkgmfevleplhammergpqtlketsfnqaygrdlmeaqewcrkymksgnvkdlhqafdlyyhvfrriskles

seqidno11-mtor的frb區(qū)段，其在完全mtor的殘基2095處具有k至p取代，其以降低的親和力結(jié)合雷帕霉素

masrilwhemwhegleeasrlyfgernvkgmfevleplhammergpqtlketsfnqaygrdlmeaqewcrkymksgnvpdltqawdlyyhvfrriskles

變體序列可以與seqidno.7至11具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，條件是該序列提供了有效的二聚化系統(tǒng)。也就是說，條件是該序列促進(jìn)兩個嵌合蛋白的充分共定位以允許兩個胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域的同二聚化。

示于seqidno.8的“野生型”frb結(jié)構(gòu)域包含人mtor的氨基酸2025-2114。使用人類mtor的氨基酸編號系統(tǒng)，本發(fā)明的嵌合蛋白的frb序列可以包含在以下一個或多個位置處的氨基酸取代：2095、2098、2101。

本發(fā)明的嵌合蛋白中使用的變體frb可以包含在位置2095、2098和2101處的以下氨基酸之一：

2095：k、p、t或a

2098：t、l、h或f

2101：w或f

bayle等人(如上文)描述了以下frb變體，其根據(jù)位置2095、2098和2101處的氨基酸進(jìn)行注釋(參見表1)：ktw、plf、klw、plw、tlw、alw、ptf、atf、ttf、klf、plf、tlf、alf、ktf、khf、kff、klf。這些變體能夠以不同程度結(jié)合雷帕霉素和雷帕霉素類似物，如bayle等人的表1和圖5a中所示。本發(fā)明的嵌合蛋白可以包含這些frb變體之一。

接頭

可以包括接頭以空間上分開胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域和異二聚化結(jié)構(gòu)域。

在本發(fā)明的第一個方面的第一個實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含兩個異二聚化結(jié)構(gòu)域，其保持在以下構(gòu)造中，使得它們在cid的存在下在單個分子中不能彼此異二聚化，但一個分子上的ht1能夠與具有相同異二聚化結(jié)構(gòu)域的另一個嵌合分子上的ht2異二聚化(圖1b)。在其中ht1和ht2在胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域側(cè)翼的設(shè)計(jì)(ht1-casp-ht2)中，活化不如其中ht1和ht2連接到一起的設(shè)計(jì)，表明防止來自單個分子的ht1和ht2對單個cid的非產(chǎn)生性結(jié)合的重要性。

在該實(shí)施方案中，接頭(l1)應(yīng)當(dāng)提供足夠的柔性，使得催化結(jié)構(gòu)域能夠同二聚化，但非如此大量的柔性，使得不能克服同二聚化的能量障礙(圖1)。例如，接頭長度可以少于15個，少于10個或5-15個或5-10個氨基酸。

在本發(fā)明的第一個方面的第二個實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含單個異二聚化結(jié)構(gòu)域，其在cid的存在下能夠與第二嵌合蛋白上的互補(bǔ)異二聚化結(jié)構(gòu)域異二聚化。

在備選的構(gòu)造中，可以在具有長接頭(l2)的單個分子上提供兩個異二聚化結(jié)構(gòu)域，提供具有以下式的構(gòu)建體：

ht1-casp1-l2-ht2-casp2

ht和casp結(jié)構(gòu)域在接頭的每一側(cè)可以以任一順序。

在該實(shí)施方案中，接頭l2可以賦予足夠的柔性，使得第一異二聚化結(jié)構(gòu)域能夠與第二異二聚化結(jié)構(gòu)域異二聚化；并使得對應(yīng)“第一嵌合蛋白”的分子的部分中的胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域能夠與對應(yīng)“第二嵌合蛋白”的分子的部分中的胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域同二聚化。

在本發(fā)明的第一個方面的第三個實(shí)施方案中，casp與單個異二聚化結(jié)構(gòu)域融合，但第二分子是另一個異二聚化結(jié)構(gòu)域的兩個或多個拷貝的融合。可以共表達(dá)兩種分子。在這種情況下，第二分子起界面作用，在cid的存在下將兩個或多個casp結(jié)構(gòu)域帶到一起。在這種情況下，兩個或更多個拷貝的異二聚化結(jié)構(gòu)域必須以如下方式融合，使得允許casp9結(jié)構(gòu)域的接近足以活化它們。

界面蛋白可以是多聚體的，包含多于兩個ht2結(jié)構(gòu)域。例如，可以在單個界面蛋白中組合多個ht2結(jié)構(gòu)域，其使用多聚化接頭例如卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。

在該實(shí)施方案中，界面蛋白可以具有式ht2-l2-ht2，或ht2-l2，其中l(wèi)2是螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域。

螺旋卷曲是一種結(jié)構(gòu)基序，其中2至7個α螺旋纏繞在一起，類似繩索的股。螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域公知的，例如如lupas&gruber(advancesinproteinchemistry；2007；70；37-38)所述。

螺旋卷曲通常含有疏水(h)和帶電荷(c)的氨基酸殘基的重復(fù)的模式，hxxhcxc，稱為七元重復(fù)(heptadrepeat)。七元重復(fù)中的位置通常標(biāo)記為abcdefg，其中a和d是疏水位置，通常被異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸占據(jù)。將具有該重復(fù)模式的序列折疊為α螺旋二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致疏水殘基被呈現(xiàn)為“條紋(stripe)”，其以左手的方式輕柔盤繞螺旋，形成兩親性結(jié)構(gòu)。對于兩個此類螺旋將它們自身排列在細(xì)胞質(zhì)中最有利的方式是在將疏水性鏈彼此纏繞，夾在親水性氨基酸之間。因此，疏水性表面的埋藏為寡聚化提供了熱力學(xué)驅(qū)動力。螺旋卷曲界面中的包裝非常緊密，在a和d殘基的側(cè)鏈之間具有幾乎完全范德華力接觸。

含有螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域的蛋白的實(shí)例包括但不限于驅(qū)動蛋白馬達(dá)蛋白(motorprotein)，丁型肝炎δ抗原，古細(xì)菌盒c/dsrnp核心蛋白，軟骨低聚基質(zhì)蛋白(comp)，甘露糖結(jié)合蛋白a，富含絲氨酸的卷曲螺旋蛋白1(coiled-coilserine-richprotein1)，多肽釋放因子2，snap-25，snare，lac阻遏物或載脂蛋白e。

二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)

二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)可以是任何分子，其誘導(dǎo)具有相同的ht1和ht2結(jié)構(gòu)域上的單獨(dú)的嵌合分子上的ht1和ht2之間的異二聚化。

cid可以是雷帕霉素或雷帕霉素類似物(“rapalog”)，其具有相對于雷帕霉素改進(jìn)的或不同的藥代動力學(xué)或藥效學(xué)特定，但具有相同的廣泛作用機(jī)制。cid可以是具有對互補(bǔ)fkbp12或frb的工程化特異性的改變的雷帕霉素，例如如圖4中所示。bayle等人(2006，如上文)描述了在c16和/或c20處功能化的多種雷帕霉素類似物。

第一類中的此類雷帕霉素類似物的例子包括西羅莫司(sirolimus)、依維莫司(everolimus)、替西羅莫司(temsirolimus)和德福莫林(deforolimus)。第二類中的雷帕霉素類似物的例子包括c-20-methyllyrlrapamycin(marap)；c16(s)-丁基磺胺雷帕霉素(c16-bs-rap)；c16-(s)-3-甲基吲哚雷帕霉素(c16-irap)；和c16-(s)-7-甲基吲哚雷帕霉素(ap21976/c16-airap)。

在cid的存在下胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域的同二聚化可以導(dǎo)致胱天蛋白酶活化，其比在cid不存在下發(fā)生的胱天蛋白酶活化高2、5、10、50、100、1000或10000倍。

雷帕霉素是一種強(qiáng)力的免疫抑制劑。雷帕霉素的類似物(rapalogues)用于日常臨床用途。現(xiàn)代雷帕霉素類似物具有極好的生物可用性和分布體積。盡管它們是強(qiáng)力的免疫抑制劑，短劑量(以活化自殺基因)應(yīng)當(dāng)具有最小限度的副作用。此外，與單抗的施用不同，雷帕霉素和類似物的藥理學(xué)效果在自殺基因要求活化的臨床場景，如脫腫瘤毒性(off-tumortoxicity)或免疫超活化綜合征中可以完全是有利的。

核酸序列

本發(fā)明的第二個方面提供核酸序列，其編碼根據(jù)本發(fā)明的嵌合蛋白。

如本文所使用的，術(shù)語“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”意圖彼此同義。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，由于遺傳密碼的簡并性，許多不同的多核苷酸和核酸可以編碼相同的多肽。此外，應(yīng)當(dāng)理解理解技術(shù)人員可以使用常規(guī)技術(shù)，進(jìn)行核苷酸取代以反映在其中表達(dá)多肽的任何具體宿主微生物的密碼子選擇，所述核苷酸取代不影響本文所述的多核苷酸編碼的多肽序列。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面的核酸可以包含dna或rna。它們可以是單鏈的或雙鏈的。它們也可以是在它們中包括合成的或修飾的核苷酸的多核苷酸。對寡核苷酸的許多不同類型的修飾在本領(lǐng)域中是已知的。這些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主鏈，在分子的3’和/或5’末端添加吖啶或多聚賴氨酸鏈。為了如本文所述的用途的目的，應(yīng)當(dāng)理解可以通過本領(lǐng)域可用的任何方法修飾多核苷酸。為了提高感興趣的多核苷酸的體內(nèi)活性或壽命可以進(jìn)行此類修飾。

關(guān)于核苷酸序列，術(shù)語“變體”、“同源物”或“衍生物”包括在對序列的一個(或多個)核酸的任何取代、變異、修飾、置換、缺失或添加。

在本發(fā)明的該方面的第一個實(shí)施方案中，提供核酸序列，其編碼具有以下式的嵌合蛋白：

ht1-ht2-l-casp

ht1是第一異二聚化結(jié)構(gòu)域；和

ht2是第二異二聚化結(jié)構(gòu)域。

l是任選的接頭；

casp是胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域；

核酸序列可以編碼如seqidno.1所示的嵌合蛋白序列或其變體。

例如，核苷酸序列可以包含如seqidno.12所示的序列

seqidno.12(frb-fkbp12-l3-casp9)

atggcttctagaatcctctggcatgagatgtggcatgaaggcctggaagaggcatctcgtttgtactttggggaaaggaacgtgaaaggcatgtttgaggtgctggagcccttgcatgctatgatggaacggggcccccagactctgaaggaaacatcctttaatcaggcctatggtcgagatttaatggaggcccaagagtggtgcaggaagtacatgaaatcagggaatgtcaaggacctcctccaagcctgggacctctattatcatgtgttccgacgaatctcaaagctcgagtatagcggcggcggcagcctggagggcgtgcaggtggagaccatcagcccaggcgacggcagaaccttccccaagagaggccagacctgcgtggtgcactataccggcatgctggaggacggcaagaagttcgacagcagccgcgaccgcaataagcccttcaagttcatgctgggcaagcaggaggtgatcagaggctgggaggagggcgtggcccagatgagcgtgggccagagagccaagctgaccatcagccccgactacgcctatggcgccaccggccaccccggcatcatcccaccccacgccaccctggtgtttgatgtggagctgctgaagctggagtccggcggaggcgggtctggaggaggcggcagcggcggcggcgggtcaggcgtggatggcttcggcgacgtgggagccctggagagcctgagaggcaacgccgatctggcctacatcctgagcatggagccctgtggccactgcctgatcatcaacaacgtgaacttctgccgggagagcggcctgcggacccggaccggcagcaacatcgactgcgagaagctgaggaggcgcttctcctccctgcactttatggtggaggtgaaaggcgatctgactgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggcccagcaggaccacggagccctggattgctgtgtggtggtgatcctgtcccacggctgccaggccagccacctgcagttccccggagccgtgtacggcaccgacggctgtcccgtgtccgtggagaagatcgtgaacatcttcaacggcacctcctgcccctccctgggcggcaagcccaagctgttctttatccaggcctgtggcggcgagcagaaggaccacggctttgaggtggccagcacctcccccgaggacgagagcccaggcagcaaccccgagcccgacgccacccccttccaggagggcctgcgcaccttcgaccagctggacgccatcagcagcctgcccacccccagcgacatcttcgtgagctacagcacctttcccggcttcgtgagctggcgcgatcccaagtccggctcttggtatgtggagaccctggacgacatctttgagcagtgggctcatagcgaggacctgcagagcctgctgctgcgcgtggccaatgccgtgagcgtgaagggcatctacaagcagatgccaggctgcttcaacttcctgcggaagaagctgttcttcaagaccagcgcctcctga

在本發(fā)明的該方面的第二個實(shí)施方案中，提供編碼具有以下式的嵌合蛋白的核酸序列：ht1-l-casp

其中

ht1是異二聚化結(jié)構(gòu)域。

l是任選的接頭；和

casp是胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域；

核酸序列可以編碼如seqidno.2或3所示的嵌合蛋白序列或其變體。

例如，核苷酸序列可以包含如seqidno.13或14所示的序列

seqidno.13(fkbp12-dcasp9)

atgctggagggcgtgcaggtggagaccatcagcccaggcgacggcagaaccttccccaagagaggccagacctgcgtggtgcactataccggcatgctggaggacggcaagaagttcgacagcagccgcgaccgcaataagcccttcaagttcatgctgggcaagcaggaggtgatcagaggctgggaggagggcgtggcccagatgagcgtgggccagagagccaagctgaccatcagccccgactacgcctatggcgccaccggccaccccggcatcatcccaccccacgccaccctggtgtttgatgtggagctgctgaagctggagtccggaggcggctccggcgtggatggcttcggcgacgtgggagccctggagagcctgagaggcaacgccgatctggcctacatcctgagcatggagccctgtggccactgcctgatcatcaacaacgtgaacttctgccgggagagcggcctgcggacccggaccggcagcaacatcgactgcgagaagctgaggaggcgcttctcctccctgcactttatggtggaggtgaaaggcgatctgactgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggcccagcaggaccacggagccctggattgctgtgtggtggtgatcctgtcccacggctgccaggccagccacctgcagttccccggagccgtgtacggcaccgacggctgtcccgtgtccgtggagaagatcgtgaacatcttcaacggcacctcctgcccctccctgggcggcaagcccaagctgttctttatccaggcctgtggcggcgagcagaaggaccacggctttgaggtggccagcacctcccccgaggacgagagcccaggcagcaaccccgagcccgacgccacccccttccaggagggcctgcgcaccttcgaccagctggacgccatcagcagcctgcccacccccagcgacatcttcgtgagctacagcacctttcccggcttcgtgagctggcgcgatcccaagtccggctcttggtatgtggagaccctggacgacatctttgagcagtgggctcatagcgaggacctgcagagcctgctgctgcgcgtggccaatgccgtgagcgtgaagggcatctacaagcagatgccaggctgcttcaacttcctgcggaagaagctgttcttcaagaccagcgcctcctga

seqidno.14.(frb-dcasp9)

atggcttctagaatcctctggcatgagatgtggcatgaaggcctggaagaggcatctcgtttgtactttggggaaaggaacgtgaaaggcatgtttgaggtgctggagcccttgcatgctatgatggaacggggcccccagactctgaaggaaacatcctttaatcaggcctatggtcgagatttaatggaggcccaagagtggtgcaggaagtacatgaaatcagggaatgtcaaggacctcctccaagcctgggacctctattatcatgtgttccgacgaatctcaaagctcgagtatagcggcggcggcagcggcgtggatggcttcggcgacgtgggagccctggagagcctgagaggcaacgccgatctggcctacatcctgagcatggagccctgtggccactgcctgatcatcaacaacgtgaacttctgccgggagagcggcctgcggacccggaccggcagcaacatcgactgcgagaagctgaggaggcgcttctcctccctgcactttatggtggaggtgaaaggcgatctgactgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggcccagcaggaccacggagccctggattgctgtgtggtggtgatcctgtcccacggctgccaggccagccacctgcagttccccggagccgtgtacggcaccgacggctgtcccgtgtccgtggagaagatcgtgaacatcttcaacggcacctcctgcccctccctgggcggcaagcccaagctgttctttatccaggcctgtggcggcgagcagaaggaccacggctttgaggtggccagcacctcccccgaggacgagagcccaggcagcaaccccgagcccgacgccacccccttccaggagggcctgcgcaccttcgaccagctggacgccatcagcagcctgcccacccccagcgacatcttcgtgagctacagcacctttcccggcttcgtgagctggcgcgatcccaagtccggctcttggtatgtggagaccctggacgacatctttgagcagtgggctcatagcgaggacctgcagagcctgctgctgcgcgtggccaatgccgtgagcgtgaagggcatctacaagcagatgccaggctgcttcaacttcctgcggaagaagctgttcttcaagaccagcgcctcctga

在第二個實(shí)施方案中，可以以構(gòu)建體的形式提供核酸序列，所述構(gòu)建體編碼兩種嵌合蛋白。

構(gòu)建體可以編碼具有以下式的多肽：

ht1-l2-casp-coexpr-ht2-l2-casp

其中

ht1是第一異二聚化結(jié)構(gòu)域；

l1和l2是任選的接頭，其可以是相同的或不同的；

coexpr是使得能夠共表達(dá)以下兩種蛋白的序列：ht1-l1-casp和ht2-l2-casp；

ht2是第二異二聚化結(jié)構(gòu)域；和

casp是胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域。

在存在編碼相同或相似的序列，例如兩個胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域的核酸序列的情況下，序列之一可以進(jìn)行密碼子擺動以避免同源重組。

在第三個實(shí)施方案中，提供核酸序列，其編碼具有以下式的序列：

ht1-casp-coexpr-ht2-ht2

其中

casp是胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域；

ht1是第一異二聚化結(jié)構(gòu)域；

coexpr是使得蛋白ht1-casp和ht2-ht2能夠共表達(dá)的序列，例如切割位點(diǎn)；和

ht2是第二異二聚化結(jié)構(gòu)域，其在二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)的存在下與ht1異二聚化。

在編碼第二蛋白ht2-ht2的序列中，編碼ht2的序列之一可以進(jìn)行密碼子擺動以避免同源重組。

根據(jù)第三個實(shí)施方案的核酸構(gòu)建體可以具有如seqidno.15所示的序列。

seqidno.15(fkbp12-casp9-2a-frb-frbw)

atgctggagggcgtgcaggtggagaccatcagcccaggcgacggcagaaccttccccaagagaggccagacctgcgtggtgcactataccggcatgctggaggacggcaagaagttcgacagcagccgcgaccgcaataagcccttcaagttcatgctgggcaagcaggaggtgatcagaggctgggaggagggcgtggcccagatgagcgtgggccagagagccaagctgaccatcagccccgactacgcctatggcgccaccggccaccccggcatcatcccaccccacgccaccctggtgtttgatgtggagctgctgaagctggagtccggaggcggctccggcgtggatggcttcggcgacgtgggagccctggagagcctgagaggcaacgccgatctggcctacatcctgagcatggagccctgtggccactgcctgatcatcaacaacgtgaacttctgccgggagagcggcctgcggacccggaccggcagcaacatcgactgcgagaagctgaggaggcgcttctcctccctgcactttatggtggaggtgaaaggcgatctgactgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggcccagcaggaccacggagccctggattgctgtgtggtggtgatcctgtcccacggctgccaggccagccacctgcagttccccggagccgtgtacggcaccgacggctgtcccgtgtccgtggagaagatcgtgaacatcttcaacggcacctcctgcccctccctgggcggcaagcccaagctgttctttatccaggcctgtggcggcgagcagaaggaccacggctttgaggtggccagcacctcccccgaggacgagagcccaggcagcaaccccgagcccgacgccacccccttccaggagggcctgcgcaccttcgaccagctggacgccatcagcagcctgcccacccccagcgacatcttcgtgagctacagcacctttcccggcttcgtgagctggcgcgatcccaagtccggctcttggtatgtggagaccctggacgacatctttgagcagtgggctcatagcgaggacctgcagagcctgctgctgcgcgtggccaatgccgtgagcgtgaagggcatctacaagcagatgccaggctgcttcaacttcctgcggaagaagctgttcttcaagaccagcgcctcccagtgcaccaattatgctttgcttaagctggcaggcgatgtggaatcaaacccgggtcctggggtacaggtggagaccatctctcctggcgacgggagaacatttcctaaaaggggccaaacatgcgtggttcactataccggtatgctggaggatggcaaaaaagtagactccagccgggatagaaacaaaccctttaagttcatgctgggtaagcaggaagttatacggggctgggaagagggagtagctcagatgtctgtgggccagagggccaagctgaccatctcaccggactacgcctacggcgctaccggccaccctggcattataccaccccatgcaactctcgtcttcgatgttgagttgctcaaactggaatcaggcggaggcgggtctggaggaggcggcagcatgctggagggcgtgcaggtggagaccatcagcccaggcgacggcagaaccttccccaagagaggccagacctgcgtggtgcactataccggcatgctggaggacggcaagaagttcgacagcagccgcgaccgcaataagcccttcaagttcatgctgggcaagcaggaggtgatcagaggctgggaggagggcgtggcccagatgagcgtgggccagagagccaagctgaccatcagccccgactacgcctatggcgccaccggccaccccggcatcatcccaccccacgccaccctggtgtttgatgtggagctgctgaagctggagtcctga

具有高度相似性的核酸序列，例如胱天蛋白酶序列或frb序列可以進(jìn)行密碼子擺動以避免重組。

核酸構(gòu)建體

本發(fā)明還提供核酸構(gòu)建體，其包含：

i)編碼嵌合蛋白的第一核酸序列，所述嵌合蛋白包含胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域和異二聚化結(jié)構(gòu)域，所述異二聚化結(jié)構(gòu)域包含fk506結(jié)合蛋白(fkbp)；和

ii)編碼嵌合蛋白的第二核酸序列，所述嵌合蛋白包含胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域和異二聚化結(jié)構(gòu)域，所述異二聚化結(jié)構(gòu)域包含mtor的frb結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明還提供核酸構(gòu)建體，其包含編碼一種或多種嵌合蛋白的核酸序列和進(jìn)一步感興趣的核酸(noi)。該noi可以例如編碼t細(xì)胞受體(tcr)或嵌合抗原受體(car)。

核酸序列可以通過允許兩種或更多種核酸序列的共表達(dá)的序列連接。例如，構(gòu)建體可以包含內(nèi)部啟動子，內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列(ires)序列或編碼切割位點(diǎn)的序列。切割位點(diǎn)可以是自切割的，使得當(dāng)多肽產(chǎn)生時，其立即切割為離散的蛋白而不需要任何外部切割活性。

多種自切割位點(diǎn)是已知的，包括口蹄疫病毒(fmdv)2a自切割肽，其具有如seqidno.16或17所示的序列。

seqidno.16

raegrgslltcgdveenpgp

或者

seqidno17

qctnyallklagdvesnpgp

共表達(dá)序列可以是內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列(ires)。共表達(dá)序列可以是內(nèi)部啟動子。

t細(xì)胞受體(tcr)

t細(xì)胞受體或tcr是t細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的分子，其負(fù)責(zé)識別結(jié)合主要組織相容性復(fù)合物(mhc)分子的抗原。tcr和抗原之間的結(jié)合是相對低親和力的并且是簡并的：許多tcr識別相同的抗原且許多抗原被相同的tcr識別。

tcr由兩條不同的蛋白鏈組成，即其是異二聚體。在95％的t細(xì)胞中，其由alpha(α)和beta(β)組成，而在5％的t細(xì)胞中，這由gamma和delta(γ/δ)鏈組成。該比率在個體發(fā)育期間和疾病狀態(tài)中改變。

當(dāng)tcr與抗原性肽和mhc(肽/mhc)接合時，t淋巴細(xì)胞通過由相關(guān)酶、共受體、特化的銜接頭分子，以及活化或釋放的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的一系列生物化學(xué)事件活化。

本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或載體可以包含編碼tcrα鏈、tcrβ鏈、tcrγ鏈或tcrδ鏈的核酸序列。其可以例如包含編碼tcrα鏈的核酸序列和編碼tcrβ鏈的核酸序列；或編碼tcrγ鏈的核酸序列或編碼tcrδ鏈的核酸序列。兩個核酸序列可以通過使得能夠共表達(dá)兩條tcr鏈的序列連接，例如內(nèi)部啟動子、ires序列或切割位點(diǎn)例如自切割位點(diǎn)。

嵌合抗原受體(car)

感興趣的核酸序列(noi)可以編碼嵌合抗原受體(car)。

經(jīng)典的car是嵌合i型跨膜蛋白，其將細(xì)胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域(結(jié)合劑)與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(胞內(nèi)域(endodomain))連接。結(jié)合劑通常是衍生于單克隆抗體(mab)的單鏈可變片段(scfv)，但其可以基于包含抗原識別位點(diǎn)的其它形式例如配體。為了將結(jié)合劑從膜分開并允許其適當(dāng)定向，間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是必要的。使用的常見間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域是igg1的fc。取決于抗原，更緊密的間隔區(qū)可以足夠，例如來自cd8α的莖部和甚至僅單獨(dú)的igg1鉸鏈?？缒そY(jié)構(gòu)域?qū)⒌鞍族^定在細(xì)胞膜中并將間隔區(qū)連接至胞內(nèi)域，所述胞內(nèi)域可以包含細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。

早期的car設(shè)計(jì)具有來源于fcεr1或cd3ζ的γ鏈的細(xì)胞內(nèi)部分的胞內(nèi)域。因此，這些第一代受體傳輸免疫信號1，其足夠觸發(fā)t細(xì)胞殺傷關(guān)聯(lián)靶細(xì)胞，但不能完全活化t細(xì)胞以增殖或存活。為了克服這一限制，構(gòu)建了復(fù)合信號傳導(dǎo)域：將t細(xì)胞共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)部分融合至cd3ζ的細(xì)胞內(nèi)部分，產(chǎn)生了第二代受體，其在抗原識別后能夠同時傳輸活化和共刺激信號。最通常使用的共刺激結(jié)構(gòu)域是cd28的共刺激結(jié)構(gòu)域。這提供了最強(qiáng)力的共刺激信號-即免疫信號2，其觸發(fā)t細(xì)胞增殖。已經(jīng)描述了一些受體，其包括tnf受體家族胞內(nèi)域，例如緊密相關(guān)的ox40和41bb，其傳輸存活信號?，F(xiàn)在已經(jīng)描述了甚至更強(qiáng)力的第三代car，其具有能夠傳輸活化，增殖和存活信號的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。

可以使用例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將編碼car的核酸轉(zhuǎn)移至t細(xì)胞。以這種方式，可以生成大量抗原特異性t細(xì)胞用于用于過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移。當(dāng)car結(jié)合靶抗原時，這導(dǎo)致活化信號傳輸至上面表達(dá)有它的t細(xì)胞。因此，car將t細(xì)胞的特異性和細(xì)胞毒性引導(dǎo)至表達(dá)靶向抗原的細(xì)胞。

載體

在第三個方面，本發(fā)明提供載體，其包含本發(fā)明的核酸序列或核酸構(gòu)建體。

本發(fā)明還提供載體，或載體的試劑盒，其包含一種或多種本發(fā)明的核酸序列或核酸構(gòu)建體和任選地一種或多種另外的感興趣的核酸序列(noi)。此類載體可以用于將核酸序列或核酸構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞，使得其表達(dá)一種或多種根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的嵌合蛋白，和任選地一種或多種其它的感興趣的蛋白(poi)。該試劑盒還可以包含cid。

載體可以是例如質(zhì)?；虿《据d體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體，或基于轉(zhuǎn)座子的載體或合成的mrna。

載體可以能夠轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞。

noi可以例如編碼嵌合抗原受體或t細(xì)胞受體，使得當(dāng)載體用于轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞時，靶細(xì)胞共表達(dá)嵌合蛋白和嵌合抗原受體或t細(xì)胞受體。

細(xì)胞

本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的嵌合蛋白的細(xì)胞。

細(xì)胞可以表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的第一個實(shí)施方案的具有兩個異二聚化結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白。

細(xì)胞可以表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的第二個實(shí)施方案的兩種嵌合蛋白，一種表達(dá)胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域和異二聚化結(jié)構(gòu)域，所述異二聚化結(jié)構(gòu)域包含fk506結(jié)合蛋白(fkbp)；和一種表達(dá)胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域和異二聚化結(jié)構(gòu)域，所述異二聚化結(jié)構(gòu)域包含mtor的frb，

還提供表達(dá)以下兩種蛋白的細(xì)胞：

ht1-casp和ht2-ht2

其中ht1-casp是包含胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域(casp)和第一異二聚化結(jié)構(gòu)域(ht1)的嵌合蛋白；且ht2-ht2是包含兩個第二異二聚化結(jié)構(gòu)域(ht2)的界面蛋白

使得在二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)的存在下，嵌合蛋白ht1-casp9的對相互作用使得來自每個嵌合蛋白的ht1與來自界面蛋白的ht2結(jié)構(gòu)域異二聚化，導(dǎo)致兩個胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域的同二聚化(參見圖1d)。

細(xì)胞可以是例如免疫細(xì)胞如t細(xì)胞或自然殺傷(nk)細(xì)胞。

細(xì)胞可以是干細(xì)胞例如造血干細(xì)胞。

t細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的類型，其在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮中心作用。通過細(xì)胞表面上的t細(xì)胞受體(tcr)的存在，它們可以與其它淋巴細(xì)胞例如b細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(nk細(xì)胞)區(qū)分。

輔助性t輔助細(xì)胞(th細(xì)胞)在免疫學(xué)過程中輔助其他白細(xì)胞，包括b細(xì)胞成熟為漿細(xì)胞和記憶b細(xì)胞，以及活化細(xì)胞毒性t細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。th細(xì)胞在其表面上表達(dá)cd4。th細(xì)胞當(dāng)通過抗原呈遞細(xì)胞(apc)表面上的mhcii類分子給它們呈遞肽抗原時被激活。這些細(xì)胞可以分化成幾種亞型之一，包括th1，th2，th3，th17，th9或tfh，其分泌不同的細(xì)胞因子以促進(jìn)不同類型的免疫應(yīng)答。

細(xì)胞毒性t細(xì)胞(tc細(xì)胞或ctl)破壞病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，并且也涉及移植物排斥。ctl在其表面表達(dá)cd8。這些細(xì)胞通過與存在于所有有核細(xì)胞表面上的mhci類結(jié)合的抗原結(jié)合而識別其靶標(biāo)。通過調(diào)節(jié)性t細(xì)胞分泌的il-10，腺苷和其他分子，可以將cd8+細(xì)胞失活至無變應(yīng)性狀態(tài)，這防止自身免疫疾病，如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎。

記憶t細(xì)胞是抗原特異性t細(xì)胞的子集，該細(xì)胞在感染已經(jīng)消退之后長期持續(xù)。它們在再次暴露于其關(guān)聯(lián)抗原后迅速擴(kuò)增為大量效應(yīng)t細(xì)胞，從而為免疫系統(tǒng)提供了針對過去感染的“記憶”。記憶t細(xì)胞包括三種亞型：中央記憶t細(xì)胞(tcm細(xì)胞)和兩種類型的效應(yīng)記憶t細(xì)胞(tem細(xì)胞和temra細(xì)胞)。記憶細(xì)胞可以是cd4+或cd8+。記憶t細(xì)胞通常表達(dá)細(xì)胞表面蛋白cd45ro。

以前稱為抑制物t細(xì)胞的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg細(xì)胞)對于維持免疫耐受性至關(guān)重要。它們的主要作用是關(guān)閉t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫朝向免疫反應(yīng)的結(jié)束，以及抑制逃避胸腺中陰性選擇過程的自身反應(yīng)性t細(xì)胞。

已經(jīng)描述了兩種主要類型的cd4+treg細(xì)胞-天然發(fā)生的treg細(xì)胞和適應(yīng)性treg細(xì)胞。

天然存在的treg細(xì)胞(也稱為cd4+cd25+foxp3+treg細(xì)胞)出現(xiàn)在胸腺中，并與已經(jīng)與發(fā)育中的t細(xì)胞和已經(jīng)用tslp激活的髓樣(cd11c+)和漿細(xì)胞樣(cd123+)樹突狀細(xì)胞之間的相互作用相關(guān)。天然存在的treg細(xì)胞可以通過稱為foxp3的細(xì)胞內(nèi)分子的存在與其它t細(xì)胞區(qū)分開來。foxp3基因的突變可以阻止調(diào)節(jié)性t細(xì)胞發(fā)育，導(dǎo)致致命的自身免疫性疾病ipex。

適應(yīng)性treg細(xì)胞(也稱為tr1細(xì)胞或th3細(xì)胞)可以在正常免疫應(yīng)答期間起源。

自然殺傷細(xì)胞(或nk細(xì)胞)是形成先天免疫系統(tǒng)的一部分的一類細(xì)胞溶解性細(xì)胞。nk細(xì)胞以不依賴于mhc的方式對來自病毒感染的細(xì)胞的先天信號提供快速應(yīng)答。

nk細(xì)胞(屬于先天性淋巴樣細(xì)胞群)被定義為大顆粒淋巴細(xì)胞(lgl)，并構(gòu)成從產(chǎn)生b和t淋巴細(xì)胞的共同淋巴樣祖細(xì)胞分化的第三種細(xì)胞。已知nk細(xì)胞在骨髓，淋巴結(jié)，脾，扁桃體和胸腺中分化和成熟，在那里它們進(jìn)入循環(huán)。

干細(xì)胞是未分化的細(xì)胞，其可以分化為特化的細(xì)胞。在哺乳動物中，存在兩大類型的干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞，其是從胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離，和成體干細(xì)胞，其在各種組織中存在。在成年生物體中，干細(xì)胞和祖細(xì)胞充當(dāng)機(jī)體的修復(fù)系統(tǒng)，補(bǔ)充成體組織。在發(fā)育中的胚胎中，干細(xì)胞可以分化成所有的特化細(xì)胞-外胚層，內(nèi)胚層和中胚層(見誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)-但還維持再生器官如血液，皮膚或腸組織的正常周轉(zhuǎn)。

在人類中存在三種已知的可及的自體成體干細(xì)胞來源：

1.骨髓，其需要通過收獲來提取，即鉆入骨中。

2.脂肪組織，其需要通過抽脂術(shù)提取。

3.血液，這需要通過單采血液成分(apheresis)提取，其中血液從供體采集并通過機(jī)器，該機(jī)器提取干細(xì)胞并將血液的其它部分返回供體。

成體干細(xì)胞經(jīng)常在藥物療法中使用，例如在骨髓移植中。現(xiàn)在干細(xì)胞可以人工生長并轉(zhuǎn)化(分化)為具有與多種組織例如肌肉或神經(jīng)的細(xì)胞一致的特征的特化細(xì)胞類型。通過體細(xì)胞核移植或去分化生成的自體胚胎干細(xì)胞和胚胎細(xì)胞系也可以用于生成特化的細(xì)胞類型用于細(xì)胞療法。

造血干細(xì)胞(hsc)是血細(xì)胞，其產(chǎn)生所有其它的血細(xì)胞，并來源于中胚層。它們定位于在大多數(shù)骨骼的核心中含有的紅骨髓。

它們產(chǎn)生髓樣細(xì)胞(單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞/血小板、樹突狀細(xì)胞)，和淋巴樣譜系(t細(xì)胞、b細(xì)胞、nk細(xì)胞)。造血組織含有具有長期和短期再生能力的細(xì)胞，和定型(committed)多能、寡能和單能祖細(xì)胞。

hsc是異質(zhì)性群體。存在三類干細(xì)胞，通過血液中它們的淋巴樣對髓樣后代的比率(l/m)區(qū)分。髓樣偏好的(my-bi)hsc具有低的l/m比率(0和3之間)，而淋巴樣偏好的(ly-bi)的hsc顯示大的比率(＞10)。第三類由平衡的(bala)hsc組成，其l/m比率在3和10之間。僅髓樣偏好的和平衡的hsc具有持久的自我更新特性。

本發(fā)明的表達(dá)嵌合蛋白的細(xì)胞可以是上述任何細(xì)胞類型。

表達(dá)一種或多種根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的嵌合蛋白的t或nk細(xì)胞可以從患者自己的外周血(第一方)離體產(chǎn)生，或在來自供體外周血的造血干細(xì)胞移植物(第二方)的設(shè)置中產(chǎn)生，或自不相關(guān)供體的外周血(第三方)產(chǎn)生。

或者，表達(dá)一種或多種根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的嵌合蛋白的t或nk細(xì)胞可以衍生自誘導(dǎo)型祖細(xì)胞或胚胎祖細(xì)胞離體分化為t細(xì)胞?；蛘撸梢允褂帽Ａ羝淙芙夤δ懿⑶铱梢云鹬委焺┳饔玫挠郎痶細(xì)胞系。

在所有這些實(shí)施方案中，通過諸如使用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或使用dna或rna轉(zhuǎn)染等手段，引入編碼嵌合蛋白或每種嵌合蛋白和任選的noi的dna或rna來生成表達(dá)嵌合蛋白的細(xì)胞。

本發(fā)明的細(xì)胞可以是來自受試者的離體t或nk細(xì)胞。t或nk細(xì)胞可以來自外周血單核細(xì)胞(pbmc)樣品。t或nk細(xì)胞可以在用編碼一種或多種根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的嵌合蛋白的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)之前進(jìn)行活化和/或擴(kuò)增，例如通過使用抗cd3單克隆抗體處理。

本發(fā)明的t或nk細(xì)胞可以如下制備：

(i)從受試者或上文列出的其它來源分離含t或nk細(xì)胞的樣品；和

(ii)使用編碼一種或多種根據(jù)本發(fā)明的第二個方面的核酸序列轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染t或nk細(xì)胞。

本發(fā)明還提供試劑盒，其包含t或nk細(xì)胞和cid，所述t或nk細(xì)胞包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的第一個發(fā)明的嵌合蛋白。

藥物組合物

本發(fā)明還涉及藥物組合物，其含有多種根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞。藥物組合物可以另外包含藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。藥物組合物可以任選地包含一種或多種另外的藥學(xué)活性多肽和/或化合物。此類配制劑可以例如為適合用于靜脈輸注的形式。

方法

本發(fā)明還提供用于制備根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞的方法，其包括使用根據(jù)本發(fā)明的第三個方面的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟。

載體可以是例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體。

本發(fā)明還提供用于刪除根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞的方法，其包括將細(xì)胞暴露于cid例如雷帕霉素或雷帕霉素類似物的步驟。細(xì)胞可以在體內(nèi)或離體暴露于cid。在cid誘導(dǎo)的胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域的同二聚化后，可以通過由胱天蛋白酶活化誘導(dǎo)的凋亡引起細(xì)胞的刪除。

可以以藥物組合物的形式施用cid。藥物組合物可以另外包含藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。藥物組合物可以任選地包含一種或多種另外的藥學(xué)活性多肽和/或化合物。此類配制劑可以為例如適合用于靜脈輸注的形式。

本發(fā)明還提供用于預(yù)防和/或治療受試者中由對受試者施用根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞引起的病理性免疫反應(yīng)的方法，其包括向所述受試者施用cid例如雷帕霉素或雷帕霉素類似物的步驟。

病理性免疫反應(yīng)可以選自下組：移植物抗宿主?。恢邪忻撃[瘤毒性(on-target,off-tumourtoxicity)；免疫活化綜合征；和淋巴組織增殖性病癥。

本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防受試者中的疾病的方法，其包括向所述受試者施用根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞的步驟。該細(xì)胞可以以如上文定義的藥物組合物的形式。

所述方法可以包括以下步驟：

(i)使用根據(jù)本發(fā)明的第三個方面的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染從受試者分離的細(xì)胞樣品，和

(ii)將轉(zhuǎn)導(dǎo)的/轉(zhuǎn)染的細(xì)胞施用至患者。

用于治療疾病的方法涉及本發(fā)明的細(xì)胞的治療性用途。本文中，可以將細(xì)胞施用至具有已經(jīng)存在的疾病或狀況的受試者，以減輕，降低或改善至少一種與該疾病相關(guān)的癥狀和/或減慢、降低或阻斷疾病的進(jìn)展。

用于預(yù)防疾病的方法涉及本發(fā)明的免疫細(xì)胞的預(yù)防性用途。本文中，可以將此類細(xì)胞施用至尚未感染疾病和/或沒有顯示疾病的任何癥狀的受試者，以預(yù)防或削弱疾病的原因或降低或防止與疾病相關(guān)的至少一種癥狀的形成。該受試者可以具有形成疾病的素因或認(rèn)為具有形成疾病的風(fēng)險。

本發(fā)明提供的用于治療疾病的方法可以涉及監(jiān)控疾病的進(jìn)展和監(jiān)控任何毒性活性和調(diào)整施用至受試者的cid的劑量，以提供可接受水平的疾病進(jìn)展和毒性活性。

監(jiān)控疾病的進(jìn)展意味著隨時間評估與疾病相關(guān)的癥狀以確定其是否在降低/改善或增加/惡化。

毒性活性指在將本發(fā)明的細(xì)胞施用至受試者后由其引起的副作用。毒性活性可以包括例如免疫毒性、膽汁毒性和呼吸窘迫綜合征。

特別地，本發(fā)明提供用于治療受試者中的疾病的方法，其包括以下步驟：

(i)將根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞施用至受試者；

(ii)監(jiān)控所述受試者的病理性免疫反應(yīng)的形成；和

(iii)如果所述受試者顯示正在形成或已經(jīng)形成病理性免疫反應(yīng)的體征，則向所述受試者施用雷帕霉素或雷帕霉素類似物。

本發(fā)明提供本發(fā)明的細(xì)胞，其用于治療和/或預(yù)防疾病。

該細(xì)胞可以例如用于造血干細(xì)胞移植、淋巴細(xì)胞輸注或過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的細(xì)胞在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的用途。

本發(fā)明還提供用于治療和/或預(yù)防毒性活性的cid劑，其能夠誘導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的嵌合蛋白二聚化。

本發(fā)明還提供cid試劑，其用于活化細(xì)胞中的根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的嵌合蛋白的胱天蛋白酶結(jié)構(gòu)域?qū)Α?/p>

通過本發(fā)明的細(xì)胞和方法治療和/或預(yù)防的疾病可以是感染，例如病毒感染。

本發(fā)明的方法還可以用于控制病理性免疫應(yīng)答，例如在自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)和移植物抗宿主排斥中。

在本發(fā)明的細(xì)胞表達(dá)tcr或car的情況下，它們可以用于治療癌性疾病，例如膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌(腎細(xì)胞)、白血病、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲狀腺癌。

本發(fā)明的表達(dá)tcr/car的細(xì)胞可以能夠殺傷靶細(xì)胞，例如癌細(xì)胞。

本發(fā)明還提供雷帕霉素或雷帕霉素類似物，用于預(yù)防或治療受試者中由對受試者施用根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的細(xì)胞引起的病理性免疫反應(yīng)。

本發(fā)明的細(xì)胞可以用于任何細(xì)胞療法，其中將經(jīng)修飾或未修飾的細(xì)胞施用至患者。細(xì)胞治療的一個例子是在cd34+干細(xì)胞移植后的過繼性t細(xì)胞轉(zhuǎn)移。干細(xì)胞轉(zhuǎn)移后施用t細(xì)胞有助于加速患者受體免疫系統(tǒng)的重建。當(dāng)匹配的相關(guān)或不相關(guān)的供體不可用時，或者該疾病對于廣泛的供體搜索來說太具攻擊性時，使用hla單倍體相同的(haploidentical)家族供體可以是有效的。此類供體可以是父母，兄弟姐妹或二級親屬。此類輸注可以增強(qiáng)免疫恢復(fù)，并且從而降低病毒感染和消除復(fù)發(fā)性白血病細(xì)胞。然而，供體干細(xì)胞移植物中同種異體反應(yīng)性(alloreactive)t細(xì)胞的共存可以導(dǎo)致抑制物抗宿主病(gvhd)，其中供體細(xì)胞針對接受體起反應(yīng)，這可以逐漸損傷接受體的皮膚、腸、肝和其它器官。

細(xì)胞療法的其它實(shí)例包括使用天然(native)細(xì)胞或遺傳工程改造以表達(dá)異源基因的細(xì)胞。這些治療用于許多病癥，包括血液病癥，但這些治療方法可以具有負(fù)面的副作用。在另一種方法中，可以分化成許多類型的成熟細(xì)胞的未成熟祖細(xì)胞(例如間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞)可用于通過置換患病細(xì)胞的功能來治療病癥。本發(fā)明提供了快速且有效的機(jī)制，以去除細(xì)胞療法中使用的供體細(xì)胞可能的負(fù)面影響。

本發(fā)明提供在供體t細(xì)胞移植后，降低人類患者中移植物抗宿主病的作用的方法，其包括用根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞培養(yǎng)物中的人類供體t細(xì)胞；向患者施用轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的t細(xì)胞；隨后檢測患者中存在或不存在移植物抗宿主病；以及向檢測到移植物抗宿主病存在的患者施用二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑(cid)。t細(xì)胞可以是非同種異體耗竭的(non-allodepleted)。

本發(fā)明提供了干細(xì)胞移植的方法，包括向人類患者施用單倍體相同的干細(xì)胞移植物；以及向所述患者施用單倍體相同的供體t細(xì)胞，其中使用根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)單倍體相同的供體細(xì)胞培養(yǎng)物中的t細(xì)胞。

細(xì)胞可以是供體細(xì)胞培養(yǎng)物中的非同種異體耗竭的人類供體t細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了干細(xì)胞移植的方法，包括向人類患者施用單倍體相同的干細(xì)胞移植物；以及向所述患者施用非同種異體耗竭的供體t細(xì)胞，其中使用根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)單倍體相同的供體細(xì)胞培養(yǎng)物中的t細(xì)胞。

單倍體相同的干細(xì)胞移植物可以是cd34+單倍體相同的干細(xì)胞移植物。人類供體t細(xì)胞可以與患者的t細(xì)胞單倍體相同的?；颊呖梢曰加锌梢酝ㄟ^干細(xì)胞移植減輕的任何疾病或病癥?；颊呖梢曰加邪┌Y，例如實(shí)體瘤或血液或骨髓的癌癥。患者可以患有血液或骨髓疾病。患者可以患有鐮狀細(xì)胞性貧血或異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良。

可以從骨髓樣品或外周血制備供體細(xì)胞培養(yǎng)物。可以從供體外周血單核細(xì)胞制備供體細(xì)胞培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)之前從供體細(xì)胞培養(yǎng)物同種異體耗竭供體t細(xì)胞。在施用至患者之前，轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的t細(xì)胞可以在il-2的存在下培養(yǎng)。

將通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例旨在幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明，且不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1-產(chǎn)生表達(dá)嵌合蛋白的t細(xì)胞

使用不同的構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞。對于雙分子rapcasp9(圖1a)，使用兩種載體轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞：一種編碼通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的方式與綠色熒光蛋白egfp共表達(dá)的fkbp12-casp9，而另一種編碼與藍(lán)色熒光蛋白ebfp2共表達(dá)的frb-casp9。對于一分子rapcasp9(圖1b)，使用編碼相應(yīng)的與egfp共表達(dá)的rapcasp9的僅一種載體轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞。提供fkb12-casp9和frb-frbw的構(gòu)建體在三順反子(tri-cistronic)基因盒中編碼，其中使用fmd-2a樣肽共表達(dá)fkb12-casp9和frb-frbw，且egfp與ires共表達(dá)。有意地僅部分轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞，使得細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)，細(xì)胞的部分保持未轉(zhuǎn)導(dǎo)以起內(nèi)部陰性對照作用。作為進(jìn)一步的對照，僅使用編碼egfp的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞以排除雷帕霉素對轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的非特異性效果。

實(shí)施例2-測試使用雷帕霉素刪除表達(dá)嵌合蛋白的細(xì)胞

將t細(xì)胞暴露不同濃度的雷帕霉素，并孵育48小時。此后，t細(xì)胞使用膜聯(lián)蛋白-v和7add染色并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。通過在活細(xì)胞上門控，和詢問表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞，可以清楚地測量轉(zhuǎn)導(dǎo)的和非轉(zhuǎn)導(dǎo)的群體的存活。雙重frb-casp9和fkbp12-casp9方法產(chǎn)生僅對雙重陽性細(xì)胞的有效刪除，如預(yù)期的。fkbp-frb-casp9構(gòu)建體產(chǎn)生對單陽性細(xì)胞的有效刪除。fkbp12-casp9-frb構(gòu)建體產(chǎn)生最小刪除。fkbp12-casp9/frb-frbw產(chǎn)生對單陽性細(xì)胞的有效刪除。對照產(chǎn)生無特異性刪除(圖2和圖3)。

實(shí)施例3-測試構(gòu)建體的擴(kuò)展組

生成了如圖5中所示的構(gòu)建體并轉(zhuǎn)導(dǎo)至jurkat細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞與非轉(zhuǎn)導(dǎo)的(nt)細(xì)胞混合以在群體中具有兩種構(gòu)建體陽性和陰性的細(xì)胞。以0、1、10、100和1000nm的濃度添加雷帕霉素，并將細(xì)胞孵育24小時。收獲后，細(xì)胞使用pi和膜聯(lián)蛋白v染色并通過facs分析。結(jié)果示于圖6至9并總結(jié)于圖10中。

具有根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的第一個實(shí)施方案定義的構(gòu)造的構(gòu)建體，即mp20244，在該測定中表現(xiàn)非常好，在高于并包括1nm的雷帕霉素濃度下產(chǎn)生對轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的非常有效的殺傷。

具有根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的第二個實(shí)施方案定義的構(gòu)造的構(gòu)建體，即mp20206和mp20207，也表現(xiàn)非常好，在高于并包括1nm的雷帕霉素濃度下產(chǎn)生對轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的非常有效的殺傷。

具有根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的第三個實(shí)施方案定義的構(gòu)造的構(gòu)建體，即mp20265，也表現(xiàn)良好，在1nm雷帕霉素下產(chǎn)生一些殺傷，并在10nm和以上的雷帕霉素濃度下產(chǎn)生有效殺傷。

具有根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的第四個實(shí)施方案定義的構(gòu)造的構(gòu)建體，即mp20263、mp20264和mp21067在1nm雷帕霉素下表現(xiàn)良好，但在較高濃度的雷帕霉素下殺傷不太有效。

實(shí)施例4-使用替西羅莫司測試構(gòu)建體

在與實(shí)施例3中描述的實(shí)驗(yàn)的等同實(shí)驗(yàn)中，使用雷帕霉素和替西羅莫司(雷帕霉素類似物)處理表達(dá)如圖5中所示的構(gòu)建體的細(xì)胞。

與實(shí)施例3中概述的實(shí)驗(yàn)一樣，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的jurkat細(xì)胞與非轉(zhuǎn)導(dǎo)(nt)混合，產(chǎn)生含有表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞和非轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞兩者的群體。

以2x10⁵細(xì)胞每孔的濃度的細(xì)胞保持未處理，或使用以下濃度的雷帕霉素或替西羅莫司處理：0.01、0.1、1、10nm(雷帕霉素或替西羅莫司)。

細(xì)胞孵育24h，然后對于膜聯(lián)蛋白v和pi染色并通過facs分析。結(jié)果如圖11所示。

在替西羅莫司的存在下，使用圖5中所示的多種構(gòu)建體觀察到了jurkat細(xì)胞殺傷的等同的模式，如先前已經(jīng)在存在雷帕霉素的情況下觀察到的。

特別地，具有根據(jù)本發(fā)明第一個方面的第一個實(shí)施方案定義的構(gòu)造的構(gòu)建體mp20244；和具有根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的第二個實(shí)施方案定義的構(gòu)造的構(gòu)建體對mp20206和mp20207，兩者均表現(xiàn)良好。兩者都在高于和包括1nm的所有濃度的替西羅莫司下有效殺傷轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

上述說明書中提到的所有出版物通過引用并入本文。在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本發(fā)明所述的方法和系統(tǒng)的各種修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。盡管已經(jīng)結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施例描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，所要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)被不適當(dāng)?shù)叵抻谶@些具體實(shí)施例。實(shí)際上，對于分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的用于實(shí)施本發(fā)明描述的模式的各種修改意圖在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

序列表

<110>ucl商務(wù)股份有限公司

synconapartnersllp

<120>嵌合蛋白

<130>p106629pct

<150>gb1503133.9

<151>2015-02-24

<160>17

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>517

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合蛋白frb-fkbp12-l3-dcasp9

<400>1

metalaserargileleutrphisglumettrphisgluglyleuglu

151015

glualaserargleutyrpheglygluargasnvallysglymetphe

202530

gluvalleugluproleuhisalametmetgluargglyproglnthr

354045

leulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleumetglu

505560

alaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnvallysasp

65707580

leuleuglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargargileser

859095

lysleuglutyrserglyglyglyserleugluglyvalglnvalglu

100105110

thrileserproglyaspglyargthrpheprolysargglyglnthr

115120125

cysvalvalhistyrthrglymetleugluaspglylyslyspheasp

130135140

serserargaspargasnlysprophelysphemetleuglylysgln

145150155160

gluvalileargglytrpglugluglyvalalaglnmetservalgly

165170175

glnargalalysleuthrileserproasptyralatyrglyalathr

180185190

glyhisproglyileileproprohisalathrleuvalpheaspval

195200205

gluleuleulysleugluserglyglyglyglyserglyglyglygly

210215220

serglyglyglyglyserglyvalaspglypheglyaspvalglyala

225230235240

leugluserleuargglyasnalaaspleualatyrileleusermet

245250255

gluprocysglyhiscysleuileileasnasnvalasnphecysarg

260265270

gluserglyleuargthrargthrglyserasnileaspcysglulys

275280285

leuargargargpheserserleuhisphemetvalgluvallysgly

290295300

aspleuthralalyslysmetvalleualaleuleugluleualagln

305310315320

glnasphisglyalaleuaspcyscysvalvalvalileleuserhis

325330335

glycysglnalaserhisleuglnpheproglyalavaltyrglythr

340345350

aspglycysprovalservalglulysilevalasnilepheasngly

355360365

thrsercysproserleuglyglylysprolysleuphepheilegln

370375380

alacysglyglygluglnlysasphisglyphegluvalalaserthr

385390395400

serprogluaspgluserproglyserasnprogluproaspalathr

405410415

propheglngluglyleuargthrpheaspglnleuaspalaileser

420425430

serleuprothrproseraspilephevalsertyrserthrphepro

435440445

glyphevalsertrpargaspprolysserglysertrptyrvalglu

450455460

thrleuaspaspilephegluglntrpalahissergluaspleugln

465470475480

serleuleuleuargvalalaasnalavalservallysglyiletyr

485490495

lysglnmetproglycyspheasnpheleuarglyslysleuphephe

500505510

lysthrseralaser

515

<210>2

<211>402

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合蛋白fkbp12-dcasp9

<400>2

metleugluglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyarg

151015

thrpheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymet

202530

leugluaspglylyslyspheaspserserargaspargasnlyspro

354045

phelysphemetleuglylysglngluvalileargglytrpgluglu

505560

glyvalalaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileser

65707580

proasptyralatyrglyalathrglyhisproglyileilepropro

859095

hisalathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleuglusergly

100105110

glyglyserglyvalaspglypheglyaspvalglyalaleugluser

115120125

leuargglyasnalaaspleualatyrileleusermetgluprocys

130135140

glyhiscysleuileileasnasnvalasnphecysargglusergly

145150155160

leuargthrargthrglyserasnileaspcysglulysleuargarg

165170175

argpheserserleuhisphemetvalgluvallysglyaspleuthr

180185190

alalyslysmetvalleualaleuleugluleualaglnglnasphis

195200205

glyalaleuaspcyscysvalvalvalileleuserhisglycysgln

210215220

alaserhisleuglnpheproglyalavaltyrglythraspglycys

225230235240

provalservalglulysilevalasnilepheasnglythrsercys

245250255

proserleuglyglylysprolysleuphepheileglnalacysgly

260265270

glygluglnlysasphisglyphegluvalalaserthrserproglu

275280285

aspgluserproglyserasnprogluproaspalathrprophegln

290295300

gluglyleuargthrpheaspglnleuaspalaileserserleupro

305310315320

thrproseraspilephevalsertyrserthrpheproglypheval

325330335

sertrpargaspprolysserglysertrptyrvalgluthrleuasp

340345350

aspilephegluglntrpalahissergluaspleuglnserleuleu

355360365

leuargvalalaasnalavalservallysglyiletyrlysglnmet

370375380

proglycyspheasnpheleuarglyslysleuphephelysthrser

385390395400

alaser

<210>3

<211>392

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合蛋白frb-dcasp9

<400>3

metalaserargileleutrphisglumettrphisgluglyleuglu

151015

glualaserargleutyrpheglygluargasnvallysglymetphe

202530

gluvalleugluproleuhisalametmetgluargglyproglnthr

354045

leulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleumetglu

505560

alaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnvallysasp

65707580

leuleuglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargargileser

859095

lysleuglutyrserglyglyglyserglyvalaspglypheglyasp

100105110

valglyalaleugluserleuargglyasnalaaspleualatyrile

115120125

leusermetgluprocysglyhiscysleuileileasnasnvalasn

130135140

phecysarggluserglyleuargthrargthrglyserasnileasp

145150155160

cysglulysleuargargargpheserserleuhisphemetvalglu

165170175

vallysglyaspleuthralalyslysmetvalleualaleuleuglu

180185190

leualaglnglnasphisglyalaleuaspcyscysvalvalvalile

195200205

leuserhisglycysglnalaserhisleuglnpheproglyalaval

210215220

tyrglythraspglycysprovalservalglulysilevalasnile

225230235240

pheasnglythrsercysproserleuglyglylysprolysleuphe

245250255

pheileglnalacysglyglygluglnlysasphisglyphegluval

260265270

alaserthrserprogluaspgluserproglyserasnproglupro

275280285

aspalathrpropheglngluglyleuargthrpheaspglnleuasp

290295300

alaileserserleuprothrproseraspilephevalsertyrser

305310315320

thrpheproglyphevalsertrpargaspprolysserglysertrp

325330335

tyrvalgluthrleuaspaspilephegluglntrpalahisserglu

340345350

aspleuglnserleuleuleuargvalalaasnalavalservallys

355360365

glyiletyrlysglnmetproglycyspheasnpheleuarglyslys

370375380

leuphephelysthrseralaser

385390

<210>4

<211>651

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合蛋白fkbp12-dcasp9-2a-frb-frbw

<400>4

metleugluglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyarg

151015

thrpheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymet

202530

leugluaspglylyslyspheaspserserargaspargasnlyspro

354045

phelysphemetleuglylysglngluvalileargglytrpgluglu

505560

glyvalalaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileser

65707580

proasptyralatyrglyalathrglyhisproglyileilepropro

859095

hisalathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleuglusergly

100105110

glyglyserglyvalaspglypheglyaspvalglyalaleugluser

115120125

leuargglyasnalaaspleualatyrileleusermetgluprocys

130135140

glyhiscysleuileileasnasnvalasnphecysargglusergly

145150155160

leuargthrargthrglyserasnileaspcysglulysleuargarg

165170175

argpheserserleuhisphemetvalgluvallysglyaspleuthr

180185190

alalyslysmetvalleualaleuleugluleualaglnglnasphis

195200205

glyalaleuaspcyscysvalvalvalileleuserhisglycysgln

210215220

alaserhisleuglnpheproglyalavaltyrglythraspglycys

225230235240

provalservalglulysilevalasnilepheasnglythrsercys

245250255

proserleuglyglylysprolysleuphepheileglnalacysgly

260265270

glygluglnlysasphisglyphegluvalalaserthrserproglu

275280285

aspgluserproglyserasnprogluproaspalathrprophegln

290295300

gluglyleuargthrpheaspglnleuaspalaileserserleupro

305310315320

thrproseraspilephevalsertyrserthrpheproglypheval

325330335

sertrpargaspprolysserglysertrptyrvalgluthrleuasp

340345350

aspilephegluglntrpalahissergluaspleuglnserleuleu

355360365

leuargvalalaasnalavalservallysglyiletyrlysglnmet

370375380

proglycyspheasnpheleuarglyslysleuphephelysthrser

385390395400

alaserglncysthrasntyralaleuleulysleualaglyaspval

405410415

gluserasnproglyproglyvalglnvalgluthrileserprogly

420425430

aspglyargthrpheprolysargglyglnthrcysvalvalhistyr

435440445

thrglymetleugluaspglylyslysvalaspserserargasparg

450455460

asnlysprophelysphemetleuglylysglngluvalilearggly

465470475480

trpglugluglyvalalaglnmetservalglyglnargalalysleu

485490495

thrileserproasptyralatyrglyalathrglyhisproglyile

500505510

ileproprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleu

515520525

gluserglyglyglyglyserglyglyglyglysermetleuglugly

530535540

valglnvalgluthrileserproglyaspglyargthrpheprolys

545550555560

argglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleugluaspgly

565570575

lyslyspheaspserserargaspargasnlysprophelysphemet

580585590

leuglylysglngluvalileargglytrpglugluglyvalalagln

595600605

metservalglyglnargalalysleuthrileserproasptyrala

610615620

tyrglyalathrglyhisproglyileileproprohisalathrleu

625630635640

valpheaspvalgluleuleulysleugluser

645650

<210>5

<211>416

<212>prt

<213>人類

<400>5

metaspglualaaspargargleuleuargargcysargleuargleu

151015

valglugluleuglnvalaspglnleutrpaspalaleuleuserser

202530

gluleupheargprohismetilegluaspileglnargalaglyser

354045

glyserargargaspglnalaargglnleuileileaspleugluthr

505560

argglyserglnalaleuproleupheilesercysleugluaspthr

65707580

glyglnaspmetleualaserpheleuargthrasnargglnalaala

859095

lysleuserlysprothrleugluasnleuthrprovalvalleuarg

100105110

progluilearglysprogluvalleuargprogluthrproargpro

115120125

valaspileglyserglyglypheglyaspvalglyalaleugluser

130135140

leuargglyasnalaaspleualatyrileleusermetgluprocys

145150155160

glyhiscysleuileileasnasnvalasnphecysargglusergly

165170175

leuargthrargthrglyserasnileaspcysglulysleuargarg

180185190

argpheserserprohisphemetvalgluvallysglyaspleuthr

195200205

alalyslysmetvalleualaleuleugluleualaglnglnasphis

210215220

glyalaleuaspcyscysvalvalvalileleuserhisglycysgln

225230235240

alaserhisleuglnpheproglyalavaltyrglythraspglycys

245250255

provalservalglulysilevalasnilepheasnglythrsercys

260265270

proserleuglyglylysprolysleuphepheileglnalacysgly

275280285

glygluglnlysasphisglyphegluvalalaserthrserproglu

290295300

aspgluserproglyserasnprogluproaspalathrprophegln

305310315320

gluglyleuargthrpheaspglnleuaspalaileserserleupro

325330335

thrproseraspilephevalsertyrserthrpheproglypheval

340345350

sertrpargaspprolysserglysertrptyrvalgluthrleuasp

355360365

aspilephegluglntrpalahissergluaspleuglnserleuleu

370375380

leuargvalalaasnalavalservallysglyiletyrlysglnmet

385390395400

proglycyspheasnpheleuarglyslysleuphephelysthrser

405410415

<210>6

<211>282

<212>prt

<213>人類

<400>6

glypheglyaspvalglyalaleugluserleuargglyasnalaasp

151015

leualatyrileleusermetgluprocysglyhiscysleuileile

202530

asnasnvalasnphecysarggluserglyleuargthrargthrgly

354045

serasnileaspcysglulysleuargargargpheserserleuhis

505560

phemetvalgluvallysglyaspleuthralalyslysmetvalleu

65707580

alaleuleugluleualaglnglnasphisglyalaleuaspcyscys

859095

valvalvalileleuserhisglycysglnalaserhisleuglnphe

100105110

proglyalavaltyrglythraspglycysprovalservalglulys

115120125

ilevalasnilepheasnglythrsercysproserleuglyglylys

130135140

prolysleuphepheileglnalacysglyglygluglnlysasphis

145150155160

glyphegluvalalaserthrserprogluaspgluserproglyser

165170175

asnprogluproaspalathrpropheglngluglyleuargthrphe

180185190

aspglnleuaspalaileserserleuprothrproseraspilephe

195200205

valsertyrserthrpheproglyphevalsertrpargaspprolys

210215220

serglysertrptyrvalgluthrleuaspaspilephegluglntrp

225230235240

alahissergluaspleuglnserleuleuleuargvalalaasnala

245250255

valservallysglyiletyrlysglnmetproglycyspheasnphe

260265270

leuarglyslysleuphephelysthrser

275280

<210>7

<211>108

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>fkbp12domain

<400>7

metglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthrphe

151015

prolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleuglu

202530

aspglylyslyspheaspserserargaspargasnlysprophelys

354045

phemetleuglylysglngluvalileargglytrpglugluglyval

505560

alaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileserproasp

65707580

tyralatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohisala

859095

thrleuvalpheaspvalgluleuleulysleuglu

100105

<210>8

<211>100

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mtor的野生型frb區(qū)段

<400>8

metalaserargileleutrphisglumettrphisgluglyleuglu

151015

glualaserargleutyrpheglygluargasnvallysglymetphe

202530

gluvalleugluproleuhisalametmetgluargglyproglnthr

354045

leulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleumetglu

505560

alaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnvallysasp

65707580

leuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargargileser

859095

lysleugluser

100

<210>9

<211>100

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>具有允許與ap21967結(jié)合的2098處t至l取代的frb

<400>9

metalaserargileleutrphisglumettrphisgluglyleuglu

151015

glualaserargleutyrpheglygluargasnvallysglymetphe

202530

gluvalleugluproleuhisalametmetgluargglyproglnthr

354045

leulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleumetglu

505560

alaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnvallysasp

65707580

leuleuglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargargileser

859095

lysleugluser

100

<210>10

<211>100

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>在全長mtor的2098處具有t至h取代和殘基2101處的f取代為w的mtor的frb區(qū)段

<400>10

metalaserargileleutrphisglumettrphisgluglyleuglu

151015

glualaserargleutyrpheglygluargasnvallysglymetphe

202530

gluvalleugluproleuhisalametmetgluargglyproglnthr

354045

leulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleumetglu

505560

alaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnvallysasp

65707580

leuhisglnalapheaspleutyrtyrhisvalpheargargileser

859095

lysleugluser

100

<210>11

<211>100

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>在全長mtor的殘基2095處具有k至p取代的mtor的frb區(qū)段

<400>11

metalaserargileleutrphisglumettrphisgluglyleuglu

151015

glualaserargleutyrpheglygluargasnvallysglymetphe

202530

gluvalleugluproleuhisalametmetgluargglyproglnthr

354045

leulysgluthrserpheasnglnalatyrglyargaspleumetglu

505560

alaglnglutrpcysarglystyrmetlysserglyasnvalproasp

65707580

leuthrglnalatrpaspleutyrtyrhisvalpheargargileser

859095

lysleugluser

100

<210>12

<211>1554

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>frb-fkbp12-l3-casp9核苷酸序列

<400>12

atggcttctagaatcctctggcatgagatgtggcatgaaggcctggaagaggcatctcgt60

ttgtactttggggaaaggaacgtgaaaggcatgtttgaggtgctggagcccttgcatgct120

atgatggaacggggcccccagactctgaaggaaacatcctttaatcaggcctatggtcga180

gatttaatggaggcccaagagtggtgcaggaagtacatgaaatcagggaatgtcaaggac240

ctcctccaagcctgggacctctattatcatgtgttccgacgaatctcaaagctcgagtat300

agcggcggcggcagcctggagggcgtgcaggtggagaccatcagcccaggcgacggcaga360

accttccccaagagaggccagacctgcgtggtgcactataccggcatgctggaggacggc420

aagaagttcgacagcagccgcgaccgcaataagcccttcaagttcatgctgggcaagcag480

gaggtgatcagaggctgggaggagggcgtggcccagatgagcgtgggccagagagccaag540

ctgaccatcagccccgactacgcctatggcgccaccggccaccccggcatcatcccaccc600

cacgccaccctggtgtttgatgtggagctgctgaagctggagtccggcggaggcgggtct660

ggaggaggcggcagcggcggcggcgggtcaggcgtggatggcttcggcgacgtgggagcc720

ctggagagcctgagaggcaacgccgatctggcctacatcctgagcatggagccctgtggc780

cactgcctgatcatcaacaacgtgaacttctgccgggagagcggcctgcggacccggacc840

ggcagcaacatcgactgcgagaagctgaggaggcgcttctcctccctgcactttatggtg900

gaggtgaaaggcgatctgactgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggcccag960

caggaccacggagccctggattgctgtgtggtggtgatcctgtcccacggctgccaggcc1020

agccacctgcagttccccggagccgtgtacggcaccgacggctgtcccgtgtccgtggag1080

aagatcgtgaacatcttcaacggcacctcctgcccctccctgggcggcaagcccaagctg1140

ttctttatccaggcctgtggcggcgagcagaaggaccacggctttgaggtggccagcacc1200

tcccccgaggacgagagcccaggcagcaaccccgagcccgacgccacccccttccaggag1260

ggcctgcgcaccttcgaccagctggacgccatcagcagcctgcccacccccagcgacatc1320

ttcgtgagctacagcacctttcccggcttcgtgagctggcgcgatcccaagtccggctct1380

tggtatgtggagaccctggacgacatctttgagcagtgggctcatagcgaggacctgcag1440

agcctgctgctgcgcgtggccaatgccgtgagcgtgaagggcatctacaagcagatgcca1500

ggctgcttcaacttcctgcggaagaagctgttcttcaagaccagcgcctcctga1554

<210>13

<211>1209

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>fkbp12-dcasp9核苷酸序列

<400>13

atgctggagggcgtgcaggtggagaccatcagcccaggcgacggcagaaccttccccaag60

agaggccagacctgcgtggtgcactataccggcatgctggaggacggcaagaagttcgac120

agcagccgcgaccgcaataagcccttcaagttcatgctgggcaagcaggaggtgatcaga180

ggctgggaggagggcgtggcccagatgagcgtgggccagagagccaagctgaccatcagc240

cccgactacgcctatggcgccaccggccaccccggcatcatcccaccccacgccaccctg300

gtgtttgatgtggagctgctgaagctggagtccggaggcggctccggcgtggatggcttc360

ggcgacgtgggagccctggagagcctgagaggcaacgccgatctggcctacatcctgagc420

atggagccctgtggccactgcctgatcatcaacaacgtgaacttctgccgggagagcggc480

ctgcggacccggaccggcagcaacatcgactgcgagaagctgaggaggcgcttctcctcc540

ctgcactttatggtggaggtgaaaggcgatctgactgccaagaaaatggtgctggccctg600

ctggagctggcccagcaggaccacggagccctggattgctgtgtggtggtgatcctgtcc660

cacggctgccaggccagccacctgcagttccccggagccgtgtacggcaccgacggctgt720

cccgtgtccgtggagaagatcgtgaacatcttcaacggcacctcctgcccctccctgggc780

ggcaagcccaagctgttctttatccaggcctgtggcggcgagcagaaggaccacggcttt840

gaggtggccagcacctcccccgaggacgagagcccaggcagcaaccccgagcccgacgcc900

acccccttccaggagggcctgcgcaccttcgaccagctggacgccatcagcagcctgccc960

acccccagcgacatcttcgtgagctacagcacctttcccggcttcgtgagctggcgcgat1020

cccaagtccggctcttggtatgtggagaccctggacgacatctttgagcagtgggctcat1080

agcgaggacctgcagagcctgctgctgcgcgtggccaatgccgtgagcgtgaagggcatc1140

tacaagcagatgccaggctgcttcaacttcctgcggaagaagctgttcttcaagaccagc1200

gcctcctga1209

<210>14

<211>1179

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>frb-dcasp9核苷酸序列

<400>14

atggcttctagaatcctctggcatgagatgtggcatgaaggcctggaagaggcatctcgt60

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