本發(fā)明一般地涉及可促進(jìn)納米顆粒載體與抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合并隨后被細(xì)胞內(nèi)化的嵌合蛋白，以及包含這些嵌合蛋白的納米顆粒載體。本發(fā)明還涉及使用包含嵌合蛋白的納米顆粒載體，使抗原在抗原呈遞細(xì)胞中內(nèi)化的方法和在對象中引起針對抗原之免疫應(yīng)答的方法。

相關(guān)申請

本申請涉及并要求于2014年10月9日提交的題目為“chimericproteins”的澳大利亞臨時專利申請no.20140904028的優(yōu)先權(quán)。澳大利亞臨時專利申請no.20140904028的內(nèi)容通過引用整體并入本文。

背景技術(shù)：

最佳疫苗設(shè)計需要最大免疫原性、安全性和耐受性之間的平衡?，F(xiàn)代重組疫苗的改進(jìn)的安全性特性通常伴隨著較低的免疫原性特性。因此，需要增強(qiáng)免疫原性同時保持安全性和耐受性的佐劑和新的遞送系統(tǒng)。

發(fā)明概述

在一方面，本發(fā)明涉及包含第一多肽和第二多肽的嵌合蛋白，其中所述第一多肽是toll樣受體5(tolllikereceptor5，tlr5)激動劑；并且所述第二多肽與seqidno：1所示gp120多肽具有至少50％的序列同一性和至少8個n-糖基化位點(diǎn)。

在一些實(shí)施方案中，tlr5激動劑是鞭毛蛋白多肽、抗tlr5抗體或抗tlr5適配體。例如，tlr5激動劑可以是選自以下的鞭毛蛋白多肽：沙門菌屬(salmonellaspp)、埃希菌屬(escherichiaspp)、疏螺旋體屬(borreliaspp)、螺桿菌屬(helicobacterspp)、彎曲菌屬(campylobacterspp)、柄桿菌屬(caulobacterspp)、弧菌屬(vibriospp)、芽孢桿菌屬(bacillusspp)、假單胞菌屬(pseudomonasspp)、根瘤菌屬(rhizobiumspp)、鹽桿菌屬(halobacteriumspp)、富鹽菌屬(haloferaxspp)、梭菌屬(clostridiumspp)、腸桿菌屬(enterobacterspp)、歐文菌屬(erwiniaspp)、克雷伯菌屬(klebsiellaspp)、耶爾森菌屬(yersiniaspp)、變形桿菌屬(proteusspp)、沙雷菌屬(serratiaspp)、希瓦菌(shewanellaspp)、志賀菌屬(shigellaspp)和鏈霉菌屬(streptomycesspp)的鞭毛蛋白。在一個特別的實(shí)例中，鞭毛蛋白多肽的氨基酸序列與seqidno：2所示序列具有至少90％的序列同一性。

在一些實(shí)施方案中，第二多肽與seqidno：1所示gp120多肽具有至少90％的序列同一性。

在一個實(shí)施方案中，第一多肽的c末端與第二多肽的n末端相連接。在另一個實(shí)施方案中，第一多肽的n末端與第二多肽的c末端相連接。

在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，嵌合蛋白還可包含標(biāo)簽，例如組氨酸標(biāo)簽。

在一個特別的實(shí)施方案中，tlr5激動劑是鞭毛蛋白多肽，并且與gp120多肽相連接。在另一個實(shí)施方案中，嵌合蛋白與seqidno：5所示多肽具有至少90％的序列同一性。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，嵌合蛋白是糖基化的。例如，嵌合蛋白可包含昆蟲細(xì)胞糖基化模式。

在另一方面，本發(fā)明涉及核酸分子，其編碼上述和本文中所述的嵌合蛋白。

本發(fā)明的另一方面涉及納米顆粒載體，其包含上述和本文中所述的嵌合蛋白。

在一個實(shí)施方案中，納米顆粒載體包含至少一種另外的tlr激動劑，例如pam3cys、pam2cys、malp2、mpla、三酰化脂肽、細(xì)菌肽聚糖、細(xì)菌脂蛋白、脂磷壁酸、脂多糖、gpi-錨蛋白、奈瑟菌孔蛋白(neisserialporin)、磷脂甘露聚糖(phospholipomannan)、cfa、fsl-1、hib-ompc、rsvf蛋白、糖肌醇磷脂(glycoinositolphospholipid)、hsp60、hsp70、纖連蛋白結(jié)構(gòu)域a、表面活性蛋白a、透明質(zhì)酸(hyaluronan)、hmgb-1、agp、rc-529、mdf2β、酚可溶性調(diào)控蛋白(phenol-solublemodulin)、二酰化脂肽、lta、酵母聚糖、咪唑并喹啉、洛索立賓(loxoribine)和瘧原蟲色素(hemozoin)。

在一些實(shí)施方案中，嵌合蛋白通過螯合作用附接于納米顆粒載體的表面。例如，嵌合蛋白可包含組氨酸標(biāo)簽，并且納米顆粒載體可包含氨三乙酸部分(nitrilotriaceticacidmoiety)，并且嵌合蛋白通過組氨酸標(biāo)簽、氨三乙酸部分和金屬離子之間的螯合作用附接于納米顆粒載體。在一些實(shí)例中，氨三乙酸部分是氨三乙酸(nitrilotriaceticacid，nta)或三氨三乙酸(trinitrilotriaceticacid，3nta)。在一個實(shí)施方案中，氨三乙酸部分附接于至少一個脂族鏈。在一些特別的實(shí)例中，氨三乙酸部分附接于二(十四烷基)胺(ditetradecylamine，dtda)、pam2cys或pam3cys。在一個實(shí)施方案中，納米顆粒載體包含氨三乙酸-二(十四烷基)胺(nta-dtda)或3(氨三乙酸)-二(十四烷基)胺(3ntadtda)或pam2cysserlys8cys-3nta。

在一些實(shí)施方案中，納米顆粒載體選自脂質(zhì)體、病毒微體、病毒樣顆粒、古細(xì)菌脂質(zhì)體(archaeosome)、質(zhì)膜囊泡、非離子表面活性劑囊泡(niosome)、脂質(zhì)核心肽、免疫刺激復(fù)合物和基于聚合物的納米顆粒。

在一個實(shí)施方案中，納米顆粒載體還包含抗原。在一些實(shí)例中，抗原附接于納米顆粒載體的表面。在另一些實(shí)例中，抗原包封在納米顆粒載體內(nèi)。

在另一些方面，本發(fā)明涉及在對象中引起針對抗原之免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯冒鲜龊捅疚闹兴龅那逗系鞍缀涂乖募{米顆粒載體。在一些實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答包括cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答。在另一些實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答包含cd4⁺t細(xì)胞應(yīng)答和抗體應(yīng)答。

在另一方面，本發(fā)明涉及使抗原在抗原呈遞細(xì)胞中內(nèi)化的方法，所述方法包括使抗原呈遞細(xì)胞與包含上述和本文中所述的嵌合蛋白和抗原的納米顆粒載體接觸。在一些特別的實(shí)施方案中，抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì)胞。

附圖簡述

圖1示出了fg115嵌合蛋白。(a)fg115表達(dá)盒的核苷酸序列。(b)fg115嵌合蛋白的氨基酸序列。(c)fg115嵌合蛋白的示意圖，示出了潛在n-糖基化位點(diǎn)。(d)在sf9細(xì)胞中表達(dá)的經(jīng)純化fg115嵌合蛋白的sds-page分析，示出了合并峰a(泳道2)和峰b(泳道3)級分，以及泳道1中分子量標(biāo)記。

圖2示出了用接枝有fg115、flgt或dms5000抗體的脂質(zhì)體或者未接枝脂質(zhì)體培養(yǎng)的人單核細(xì)胞衍生樹突細(xì)胞(monocyte-deriveddendriticcell，modc)的fac分析。

圖3示出了評估人modc對fg115接枝脂質(zhì)體內(nèi)化的兩個研究的結(jié)果。將fg115、dms5000接枝的脂質(zhì)體或者未接枝脂質(zhì)體與人modc在4℃或37℃下培養(yǎng)。然后用pbs或pbs/咪唑洗滌細(xì)胞-脂質(zhì)體混合物，并通過facs進(jìn)行分析。示出了反映來自第一供體(a)和第二供體(b)的內(nèi)化脂質(zhì)體的mfi。

圖4示出了用來自dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠(dc-signtg)的cd11c⁺細(xì)胞孵育的ot-i細(xì)胞的fac分析的結(jié)果，所述cd11c⁺細(xì)胞已經(jīng)用負(fù)載有高水平ova(lipova(高)：100μg/ml每7.38mm脂質(zhì)終濃度)或低水平ova(lipova(低)：100μg/ml每20.75mm脂質(zhì)終濃度)并且接枝有fg115、flic或gp120的脂質(zhì)體培養(yǎng)。本研究中還使用了未接枝脂質(zhì)體(uneng)。在20.75mm脂質(zhì)以104μg/ml或在20.75mm以37μg/ml(fg115(低))來接枝fg115。還包括對照，其使用經(jīng)來自dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠的cd11c⁺細(xì)胞和鹽水或ova，或者來自野生型小鼠(wt)的樹突細(xì)胞和鹽水或ova培養(yǎng)的ot-i細(xì)胞，或者單獨(dú)t細(xì)胞的fac分析。示出了活化的cd69hicd44hicd8t細(xì)胞的百分比。

圖5示出了用來自c57bl/6j野生型小鼠的cd11c⁺細(xì)胞孵育的ot-i細(xì)胞的fac分析的結(jié)果，所述cd11c⁺細(xì)胞已經(jīng)用負(fù)載有ova(lipova)并且接枝有fg115的脂質(zhì)體培養(yǎng)。使用具有多種骨架的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體骨架包括dopc(‘lipova-dopc’)、dopc/dpop(30％)(‘lipova-dopc/dopg’)、dopc/dops(30％)(‘lipova-dopc/dops’)、dopc/dotap(30％)(‘lipova-dopc/dotap’)、popc(lipova-popc)、popc/dopg(30％)(‘lipova-popc/dopg’)、popc/dope(30％)(‘lipova-popc/dope’)、popc/dotap(30％)(‘lipova-popc/dotap)、dopc/mpla(‘lipova-dopc/mpla)和dopc/lipokel(lipova-dopc/lipokel)。本研究中還使用了未接枝脂質(zhì)體(uneng)。還包括對照，其使用用cd11c+細(xì)胞和鹽水(“nil”)或ova培養(yǎng)的ot-i細(xì)胞。示出了活化的cd69hicd44hicd8t細(xì)胞的百分比。

圖6示出了用負(fù)載有ova(lipova)并接枝有fg115的脂質(zhì)體免疫接種小鼠之后的cd8⁺t細(xì)胞增殖，以及隨后體內(nèi)細(xì)胞應(yīng)答活化。

圖7示出了用接枝有fg115并負(fù)載有不同量ova的脂質(zhì)體免疫接種小鼠之后的cd8⁺t細(xì)胞增殖，使得每只小鼠接受0.57、0.68、1.19或2μgova。

圖8示出了用接枝有fg115或flic并負(fù)載有ova的脂質(zhì)體免疫接種小鼠之后的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。(a)用曲線下面積(auc)值表示的以肽脈沖靶細(xì)胞之后的特異性殺傷。(b)ifn-γcd8⁺t細(xì)胞。(c)用auc表示的輔助性t細(xì)胞應(yīng)答。

發(fā)明詳述

在整個說明書中，詞語“包括”或變化形式如“包含”或“含有”應(yīng)理解為意指包括指出的要素、整體或步驟或者要素、整體或步驟的組，但是不排除任何其他要素整體或步驟或者要素、整體或步驟的組。

本說明書中提及的所有出版物通過引用并入本文。對于已經(jīng)包括在本說明書中的文件、動作、材料、裝置、物品等的任何討論僅是為了提供本發(fā)明的背景。不應(yīng)視為承認(rèn)由于其在本申請的每一項(xiàng)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前存在于澳大利亞或其他地方，所以任何或所有這些事項(xiàng)構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分，或是本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的一般常識。

如本說明書中所使用的，除非上下文另有明確規(guī)定，否則沒有數(shù)量詞修飾的名詞表示一個/種或更多個/種。因此，例如，提及沒有數(shù)量詞修飾的名詞表示單個以及兩個或更多個，等。

本文中使用的術(shù)語“toll樣受體5”或“tlr5”具有其在本領(lǐng)域中的一般含義，并且旨在意指任何物種的toll樣受體5。最典型地，tlr5是人tlr5。tlr5在單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞上表達(dá)?；罨?，tlr5通過轉(zhuǎn)導(dǎo)通過一系列信號分子從細(xì)胞表面?zhèn)鞑サ郊?xì)胞核的細(xì)胞內(nèi)信號來誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。通常來說，tlr5的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域招募銜接體蛋白質(zhì)myd88，其募集絲氨酸/蘇氨酸激酶irak(irak-1和irak-4)。irak與traf6形成復(fù)合物，其隨后與參與轉(zhuǎn)導(dǎo)tlr信號的多種分子相互作用。這些分子和其他tlr5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組分刺激轉(zhuǎn)錄因子(例如nf-kb)的活化，以及相應(yīng)誘導(dǎo)一系列炎性相關(guān)靶基因，例如il-8和tnf-α。

本文中使用的tlr5激動劑是可以活化tlr5的任何分子。對于本發(fā)明的目的，tlr5激動劑是多肽?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法(例如檢測和/或測量nf-kb活化的方法)來評估多肽活化tlr5的能力(即表現(xiàn)“tlr5激動劑活性”)。例如，在nf-kb應(yīng)答元件(例如，hek-blue^tmhtlr5或mtlr5：invivogen)的轉(zhuǎn)錄控制下穩(wěn)定表達(dá)tlr5和報道基因的tlr5報道細(xì)胞系可用于評估多肽的tlr5激動劑活性。

術(shù)語“n-糖基化位點(diǎn)”是指在糖基化期間糖部分與天冬酰胺殘基連接的多肽中位點(diǎn)。n-糖基化位點(diǎn)通過序列基序nxs/t/c鑒定，其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸殘基，n是天冬酰胺，并且s/t/c是絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸，優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸，且最優(yōu)選蘇氨酸。

術(shù)語“納米顆粒載體”是指可以連接一個或更多個多肽或蛋白質(zhì)的小于約1000nm直徑的小顆粒。納米顆粒載體可以是中性的、陰離子型的或陽離子型的，并且包括例如脂質(zhì)體、病毒微體、病毒樣顆粒(vlp)、古細(xì)菌脂質(zhì)體、質(zhì)膜囊泡(pmv)、非離子表面活性劑囊泡、脂質(zhì)核心肽(lcp)、免疫刺激復(fù)合物(iscom)和基于聚合物的納米顆粒(例如，生物可降解的納米顆粒，例如聚(d，l-乳酸-乙醇酸)共聚物(plga)納米顆粒、聚丙烯硫化物納米顆粒和多羥基化納米顆粒)。

術(shù)語“連接”和“附接”可互換使用并且涉及連接兩個實(shí)體例如兩個多肽或者嵌合蛋白和納米顆粒的任何類型的相互作用，并且包括共價鍵或非共價鍵，例如疏水/親水相互作用、范德華力、離子鍵或氫鍵。

本文中使用的“抗體”是指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，無論是天然的還是部分或完全合成的，例如重組產(chǎn)生的，包括包含保留了全長免疫球蛋白的結(jié)合特異性能力的免疫球蛋白分子可變區(qū)的至少一部分的其任何片段。因此，抗體包括具有與免疫球蛋白抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(抗體結(jié)合位點(diǎn))同源或基本同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何蛋白質(zhì)。抗體包括抗體片段。本文中使用的術(shù)語抗體包括合成抗體、重組產(chǎn)生的抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人抗體、非人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、胞內(nèi)抗體和抗體片段，例如但不限于fab片段、fab1片段、f(ab′)2片段、fv片段、二硫化物連接的fv(dsfv)、fd片段、fd′片段、單鏈fv(scfv)、單鏈fab(scfab)、雙抗體或上述任何一種的抗原結(jié)合片段。本文中提供的抗體包括任何免疫球蛋白類型(例如，igg、igm、igd、ige、iga和igy)、任何類別(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亞類(例如，igg2a和igg2b)的成員。

本文中使用的抗體的“抗原結(jié)合片段”包括保留抗體與相同抗原結(jié)合能力的任何抗體片段。通常來說，抗原結(jié)合片段與抗原結(jié)合，其親和力為抗體表現(xiàn)的結(jié)合親和力的至少或約30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。示例性抗原結(jié)合片段包括但不限于fab片段、fab1片段、f(ab′)2片段、fv片段、二硫化物連接的fv(dsfv)、fd片段，fd′片段、單鏈fv(scfv)、單鏈fab(scfab)和雙抗體。

本文中使用的術(shù)語“％同一性”意指在兩個序列在特定區(qū)域上的比較中，兩個序列具有指定數(shù)目的相同位置的相同殘基。術(shù)語“％相似性”具有類似含義，但是除了兩個序列之間的相同氨基酸的數(shù)目之外，還要考慮不相同但是是保守替換的氨基酸。

本文使用的術(shù)語“對象”是指可從本發(fā)明的醫(yī)學(xué)方案獲益的動物，特別是哺乳動物且更特別是靈長類動物(包括低級靈長類動物)，且甚至更特別是人。無論是人或非人動物或胚胎，對象可以稱為個體、對象、動物、患者、宿主或接受者。本發(fā)明具有人和獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用。為了方便起見，“動物”特別地包括家畜動物，例如牛、馬、綿羊、豬、駱駝、山羊和驢。對于馬，這些包括賽馬行業(yè)中使用的馬，以及在娛樂或畜牧業(yè)中使用的馬。實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動物的實(shí)例包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和倉鼠。兔和嚙齒動物(例如大鼠和小鼠)提供如靈長類動物和低等靈長類動物一樣方便的測試系統(tǒng)或動物模型。在一些實(shí)施方案中，對象是人。

表a：序列表

嵌合蛋白

本發(fā)明的嵌合蛋白包含第一多肽(其為tlr5激動劑)和第二多肽(其與seqidno：1所示gp120多肽具有至少50％的序列同一性)以及至少8個n-糖基化位點(diǎn)。因此，當(dāng)以促進(jìn)糖基化的方式產(chǎn)生時，第二多肽是高度糖基化的糖蛋白。嵌合蛋白可用于促進(jìn)納米顆粒載體與抗原呈遞細(xì)胞的結(jié)合和/或促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞)對納米顆粒載體的內(nèi)化。因此，嵌合蛋白可促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞對包封在納米顆粒載體內(nèi)或附接于其上的抗原的內(nèi)化，并且還促進(jìn)對該抗原的免疫應(yīng)答。

不希望受到理論的約束，推測本發(fā)明的嵌合蛋白通過高度糖基化的第二多肽結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞)，所述第二多肽與seqidno：1所示gp120多肽具有至少50％序列同一性并且具有至少8個n-糖基化位點(diǎn)。該糖蛋白可以與抗原呈遞細(xì)胞上的凝集素(例如dc-sign或甘露糖受體)相互作用。嵌合蛋白也可以通過嵌合蛋白中的tlr5激動劑與細(xì)胞表面上的tlr5之間的相互作用來結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞，例如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞。因此，本發(fā)明的嵌合蛋白可用于促進(jìn)將接枝有嵌合蛋白的納米顆粒載體遞送至抗原呈遞細(xì)胞，并隨后促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞對載體的內(nèi)化。當(dāng)納米顆粒載體負(fù)載有抗原(即，抗原包封在載體內(nèi)和/或附接于載體表面)時，嵌合蛋白促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞對抗原的內(nèi)化。通常來說，抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì)胞。

如本文中所證實(shí)的，與未接枝載體相比，接枝有嵌合蛋白的納米顆粒載體表現(xiàn)出提高的與抗原呈遞細(xì)胞的結(jié)合和提高的抗原呈遞細(xì)胞的內(nèi)化。此外，嵌合蛋白中的tlr5激動劑活化tlr5可以幫助刺激對包封在載體內(nèi)和/或附接于載體表面的抗原的促炎應(yīng)答。tlr5激動劑活化tlr5可以導(dǎo)致例如誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和趨化因子，增多t和b細(xì)胞募集到次級淋巴樣細(xì)胞，活化dc，直接刺激cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞，以及誘導(dǎo)以高滴度的igg1和igg2a為特征的體液免疫應(yīng)答。此外，如果第二多肽含有“非自身”聚糖結(jié)構(gòu)或模式，即不同于施用嵌合蛋白的物種中通常產(chǎn)生的聚糖結(jié)構(gòu)或模式的聚糖結(jié)構(gòu)或模式，則可以進(jìn)一步增強(qiáng)對抗原的免疫應(yīng)答。嵌合蛋白提供的增強(qiáng)的內(nèi)化、嵌合蛋白中的tlr5激動劑活化tlr5的佐劑作用以及在某些情況下第二多肽的“非自身”糖基化的佐劑作用的組合導(dǎo)致與使用未接枝納米顆粒載體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相比，對接枝有嵌合蛋白的納米顆粒載體內(nèi)包封的和/或表面附接的抗原的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。

tlr5激動劑

可用于本發(fā)明的tlr5激動劑包括可活化tlr5的任何多肽，包括但不限于鞭毛蛋白多肽、抗tlr5抗體和抗tlr5適配體。最典型地，tlr5激動劑活化人tlr5，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，根據(jù)期望的嵌合蛋白的特異性和效用，也可以使用活化來自其他物種的tlr5的tlr5激動劑。在一些情況下，tlr5激動劑活化來自多種物種的tlr5。

在一些實(shí)例中，本發(fā)明的嵌合蛋白中的tlr5激動劑是鞭毛蛋白多肽。鞭毛蛋白是細(xì)菌鞭毛的一部分，其負(fù)責(zé)運(yùn)動和趨化性。根據(jù)細(xì)菌種類，鞭毛蛋白的分子量范圍為28至80kda。鞭毛蛋白具有位于高變區(qū)側(cè)翼的n末端(約170個氨基酸殘基)和c末端(約100個氨基酸殘基)的保守區(qū)域。鞭毛蛋白的n末端部分和c末端部分形成填充的α-螺旋結(jié)構(gòu)，其構(gòu)成d0和d1結(jié)構(gòu)域。研究表明，d1結(jié)構(gòu)域參與高親和力結(jié)合和tlr5信號傳導(dǎo)，而d0有助于tlr5活化，但對結(jié)合沒有或幾乎沒有影響(yoon等(2012)science.335(6070)：859-864)。

已經(jīng)顯示鞭毛蛋白具有強(qiáng)大的佐劑作用，包括但不限于誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子、增多t和b細(xì)胞募集到次級淋巴樣部位、活化dc、直接刺激cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞以及誘導(dǎo)以高滴度的igg1和igg2a為特征的體液免疫應(yīng)答(mizel&bates2010jimmunol.185(10)：5677-82)。鞭毛蛋白還具有在低劑量下有效、不促進(jìn)ige應(yīng)答的優(yōu)點(diǎn)，并且其佐劑作用不受預(yù)先存在的免疫力的損害(mizel&bates2010jimmunol.185(10)：5677-82)。

能夠活化tlr5的任何鞭毛蛋白多肽均可用于本發(fā)明，包括但不限于來自于以下的鞭毛蛋白：沙門菌屬、埃希菌屬、疏螺旋體屬、螺桿菌屬、彎曲菌屬、柄桿菌屬、弧菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、鹽桿菌屬、富鹽菌屬、梭菌屬、腸桿菌屬、歐文菌屬、克雷伯菌屬、耶爾森菌屬、變形桿菌屬、沙雷菌屬、希瓦菌、志賀菌屬和鏈霉菌屬。鞭毛蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列可在ncbigenbank和uniprot數(shù)據(jù)庫中公開獲得?？捎糜诒景l(fā)明的鞭毛蛋白多肽的非限制性實(shí)例包括腸道沙門菌腸道亞種(salmonellaentericasubsp.enterica)鼠傷寒血清變型鞭毛蛋白(鼠傷寒沙門菌(s.typhimurium)；例如，uniprotacc.no.p06179)、都柏林沙門菌(s.dublin)鞭毛蛋白(例如，uniprotacc.no.q06971)、副傷寒沙門菌(s.paratyphi)鞭毛蛋白(例如，uniprotacc.no.p06178)、腸炎沙門菌(s.enteritidis)鞭毛蛋白(例如，uniprotacc.no.q06972)、大腸桿菌(escherichiacoli)鞭毛蛋白(例如，uniprotacc.no.p04949)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)鞭毛蛋白(例如，uniprotacc.no.p21184和p72151)、福氏志賀菌(shigellaflexneri)鞭毛蛋白(例如，uniprotacc.no.q08860)、奇異變形桿菌(proteusmirabilis)鞭毛蛋白(例如，uniprotacc.no.p42272和p42273)、黏質(zhì)沙雷菌(serratiamarcescens)鞭毛蛋白(例如，uniprotacc.no.p13713)和馬耳他布氏菌(brucellamelitensis)鞭毛蛋白(例如，uniprotacc.no.q8ydm5)。

可用于本發(fā)明的鞭毛蛋白多肽包括鞭毛蛋白衍生多肽，例如保留tlr5激動劑活性的野生型鞭毛蛋白的片段和變體。通常來說，片段或變體保留野生型鞭毛蛋白多肽的tlr5激動劑活性的至少20％(例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟悉可用于評估tlr5激動劑活性的許多方法，例如，利用穩(wěn)定表達(dá)tlr5的tlr5報道細(xì)胞系以及在nf-kb應(yīng)答元件的轉(zhuǎn)錄控制下的報道基因的測定。在一些情況下，與野生型多肽相比，變體具有改善的tlr5激動劑活性(參見例如wo2008097016)。片段或變體通常與野生型鞭毛蛋白的區(qū)域(例如：d0和/或d1區(qū)域)具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，為了產(chǎn)生或鑒定保留tlr5激動劑活性的鞭毛蛋白變體，與對tlr5結(jié)合和/或活化關(guān)鍵的區(qū)域(如d0和d1區(qū)域)相比，不參與tlr5結(jié)合和/或活化的鞭毛蛋白多肽的區(qū)域(如高變區(qū))通常更易受變異的影響。因此，在一些情況下，鞭毛蛋白變體或片段主要是在高變區(qū)中修飾。在一些情況下，具有全部或部分高變區(qū)缺失的鞭毛蛋白多肽可以是有利的，因?yàn)榕c野生型鞭毛蛋白相比，這樣的多肽可以表現(xiàn)出降低的免疫原性(參見例如，nempontetal.(2008)j.immunol.181：2036-2043)。高變區(qū)完全或部分缺失的基本上含有d0和d1區(qū)域的鞭毛蛋白多肽是本領(lǐng)域已知的，并且可用作本發(fā)明嵌合多肽中的tlr5激動劑(參見例如：us20090011982、wo2009156405、burdelyaetal.(2008)science320：226-230和nempontetal.(2008)j.immunol.181：2036-2043)。產(chǎn)生、選擇和/或鑒定適用于本發(fā)明目的的鞭毛蛋白多肽在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。

在一個具體實(shí)例中，本發(fā)明嵌合蛋白中的tlr5激動劑是來自于鼠傷寒沙門菌的flic基因的鞭毛蛋白多肽。在一個實(shí)施方案中，鞭毛蛋白多肽包含seqidno：2所示氨基酸序列。在另一個實(shí)例中，tlr5激動劑是鞭毛蛋白多肽，其包含與seqidno：2所示序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

或者，根據(jù)本發(fā)明的tlr5激動劑可以是抗tlr5抗體或其抗原結(jié)合片段?？梢允褂糜糜谥苽溽槍乖目贵w的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來產(chǎn)生充當(dāng)tlr5激動劑的抗tlr5抗體(綜述參見例如yamashitaetal.(2007)cytotechnology.55(2-3)：55-60)。例如，tlr5特異性的單克隆抗體可以通過用tlr5注射非人對象(例如小鼠)來獲得。然后可獲得b淋巴細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤，將其克隆。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如，elispot)選擇產(chǎn)生tlr5抗體的陽性克隆。然后培養(yǎng)產(chǎn)生抗原的抗體的克隆，并從雜交瘤培養(yǎng)物中分離分泌的抗體。可以通過多種公知的技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化單克隆抗體，包括但不限于：使用protein-a的親和色譜、尺寸排阻色譜和離子交換色譜。在免疫原的抗體最初產(chǎn)生后，可以對抗體進(jìn)行測序并隨后通過重組技術(shù)來制備。

在產(chǎn)生小鼠單克隆抗體的情況下，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法將此類抗體人源化或嵌合。嵌合抗體是重組蛋白，其中人抗體的可變區(qū)已被例如小鼠抗體的可變區(qū)替代?？梢杂墒褂帽绢I(lǐng)域公知的技術(shù)產(chǎn)生的編碼抗體和嵌合抗體的核酸來克隆鼠免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(參見例如orlandietal.，(1989)pnasusa5：3833-3837；kaluzaetal.(1992)gene122(2)：321-8)。

通過將cdr從小鼠或嵌合抗體的重和輕可變鏈轉(zhuǎn)移到人抗體的相應(yīng)可變結(jié)構(gòu)域中來產(chǎn)生人源化單克隆抗體的技術(shù)也是本領(lǐng)域中公知的(參見例如riechmannetal.，(1988)nature332：323-327；singeretal.，(1993)j.immunol.750：2844-2857)。在一些情況下，可以在人源化抗體的人框架區(qū)中進(jìn)一步修飾以提高親和力(參見例如tempestetal.(1991)biotechnology9：266-271)。

或者，已經(jīng)被基因工程改造以產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物可用于使用標(biāo)準(zhǔn)免疫接種方案產(chǎn)生針對tlr5的抗體(參見例如lonberg等，(1994)nature55：856-859，lonberg(2005)natbiotechnol.23(9)：1117-25)。這樣的小鼠可以商購獲得，例如來自amgen(thousandoaks，ca)的(由greenetal.，(1999)j.immunol.methods231：11-23描述)。

在另一個實(shí)施方案中，tlr5激動劑是適配體。適配體是一類分子，其在分子識別方面代表了抗體的替代物，并且是具有能夠以高親和力和特異性識別幾乎任何類別的靶分子之能力的寡肽序列。肽適配體由平臺蛋白質(zhì)(例如大腸桿菌硫氧還蛋白a)顯示的構(gòu)象約束的抗體可變區(qū)組成，并且選自通過兩種雜交方法的組合文庫。

與gp120具有至少50％序列同一性并且具有至少8個n-糖基化位點(diǎn)的多肽

嵌合蛋白的第二多肽與seqidno：1所示gp120多肽具有至少50％的序列同一性并且具有至少8個n-糖基化位點(diǎn)。在一些實(shí)例中，所述多肽與seqidno：1所示gp120多肽具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性并且具有至少8個n-糖基化位點(diǎn)，例如，8、9、10、11或12個n-糖基化位點(diǎn)。

當(dāng)在可以在n-糖基化位點(diǎn)上進(jìn)行多肽的糖基化的適當(dāng)系統(tǒng)中產(chǎn)生時，第二多肽是重糖基化的糖蛋白，并且可以與抗原呈遞細(xì)胞上的凝集素(例如dc-sign)結(jié)合，如來自hiv-1的野生型gp120所表現(xiàn)的。dc-sign是識別微生物上碳水化合物的c型凝集素，其與很多種細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌上的高甘露糖結(jié)構(gòu)或含巖藻糖的聚糖相互作用(gringhuis&geijtenbeek(2010)methodsenzymol.480：151-64)。最典型地，第二多肽可以與人樹突細(xì)胞上的人dc-sign結(jié)合。第二多肽也可以結(jié)合其他凝集素，例如朗格漢斯細(xì)胞上的langerin、真皮樹突細(xì)胞上的甘露糖受體、多種cd4⁺抗原呈遞細(xì)胞上的半乳凝素-1和樹突細(xì)胞上的dc免疫受體(dcir)，正如來自hiv-1的gp120所表現(xiàn)的(turvilleetal.(2003)jleukocbiol.74(5)：710-8；satoetal.(2012)annnyacadsci.1253：133-48)。

在一個實(shí)例中，第二多肽是gp120多肽。在一個特別的實(shí)施方案中，gp120多肽包含seqidno：1所示序列，并具有12個n-糖基化位點(diǎn)。

嵌合蛋白的生產(chǎn)

可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一種或更多種方法產(chǎn)生嵌合蛋白，包括重組方法、化學(xué)合成方法或其組合。嵌合蛋白可以作為單一多肽產(chǎn)生，或可以通過分別產(chǎn)生第一多肽和第二多肽然后連接它們來產(chǎn)生。在一些特別的實(shí)例中，嵌合蛋白由編碼框內(nèi)第一多肽和第二多肽的單個核酸分子表達(dá)，如seqidno：6所示核酸分子。在另一些實(shí)例中，分別產(chǎn)生第一多肽和第二多肽，并隨后將其連接以形成嵌合蛋白。這種連接可以通過任何手段，例如第一多肽與第二多肽的化學(xué)交聯(lián)。許多化學(xué)交聯(lián)劑是本領(lǐng)域已知的(例如，可從pierce，rockfordill商購)。

第一多肽和第二多肽可以以任何方向連接。例如：在本發(fā)明的嵌合蛋白中，第一多肽的n末端可以與第二多肽的c末端相連接。在另一些實(shí)例中，第二多肽的n末端與第一多肽的c末端相連接。第一多肽和第二多肽可以直接連接(即，一個多肽的n-末端氨基酸與另一個多肽的c-末端氨基酸直接連接并且相鄰)，或者可以通過接頭或間隔物連接，例如肽接頭，其可以降低空間位阻。此外，嵌合蛋白可包含一個或更多個另外的實(shí)體，例如促進(jìn)純化的親和標(biāo)簽(例如，myc表位、gst融合物或組氨酸標(biāo)簽)，或促進(jìn)嵌合蛋白隨后附接于納米顆粒載體上的其他實(shí)體。在一個特別的實(shí)例中，嵌合蛋白包含組氨酸標(biāo)簽，其可促進(jìn)嵌合蛋白的純化，并且還可接枝到納米微粒載體。在另外一些實(shí)施例中，嵌合蛋白可包含一種或更多種抗原，包括一種或更多種細(xì)菌、病毒、真菌或腫瘤抗原。

用于產(chǎn)生重組多肽的方法是本領(lǐng)域中公知的，并且可用于獲得包含在本發(fā)明的嵌合蛋白中的第一和/或第二多肽。編碼第一和/或第二多肽的核酸可以克隆到適合所選表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體中，其可操作地與影響異源核酸分子表達(dá)的調(diào)節(jié)序列相連接。許多表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得并且已知用于多肽表達(dá)的。表達(dá)載體的選擇受宿主表達(dá)系統(tǒng)的選擇的影響。這樣的選擇完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能水平之內(nèi)。通常來說，表達(dá)載體可包含轉(zhuǎn)錄啟動子和任選的增強(qiáng)子、翻譯信號以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體通常具有允許選擇和維持經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記。在一些情況下，可以使用復(fù)制起點(diǎn)來擴(kuò)增細(xì)胞中載體的拷貝數(shù)。

如從上述公開內(nèi)容可以理解，至少第二多肽應(yīng)作為糖蛋白產(chǎn)生。當(dāng)嵌合蛋白作為來自一個轉(zhuǎn)錄物的融合蛋白產(chǎn)生時，融合蛋白通常作為糖蛋白產(chǎn)生。此外，并且如上文中所討論的，產(chǎn)生具有“非自身”聚糖(即不同于施用嵌合蛋白的物種中通常產(chǎn)生的聚糖結(jié)構(gòu)或模式的聚糖結(jié)構(gòu)或模式)的第二多肽或整個嵌合蛋白可以提高第二多肽的佐劑活性。因此，如果嵌合蛋白接枝到納米顆粒載體上并施用于人對象，則可以使用有助于糖基化的非哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生嵌合蛋白(或至少第二多肽)。選擇用于產(chǎn)生嵌合蛋白的最合適的表達(dá)系統(tǒng)完全在技術(shù)熟練的技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。

在一個實(shí)例中，昆蟲和昆蟲細(xì)胞用于表達(dá)具有翻譯后修飾(例如n-連接的糖基化)的多肽，以產(chǎn)生具有昆蟲細(xì)胞糖基化模式或結(jié)構(gòu)的嵌合蛋白。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可以與昆蟲細(xì)胞聯(lián)合使用。桿狀病毒具有限定的宿主范圍，其改善了安全性并降低了真核表達(dá)的調(diào)節(jié)問題。通常來說，表達(dá)載體使用啟動子(例如桿狀病毒的多角體蛋白啟動子)用于高水平表達(dá)。通常使用的桿狀病毒系統(tǒng)包括例如苜蓿銀紋夜蛾(autographacalifornica)核型多角體病毒(acnpv)和家蠶(bombyxmor)核型多角體病毒(bmnpv)的桿狀病毒。示例性的昆蟲細(xì)胞系包括來自于草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)的sf9細(xì)胞系、來自于一星黏蟲(pseudaletiaunipuncta)的a7s細(xì)胞系和來自于黑脈金斑蝶(danausplexippus)的dpn1細(xì)胞系。對于高水平表達(dá)，待表達(dá)的分子的核苷酸序列融合在病毒多角體蛋白起始密碼子的緊鄰的下游(immediatelydownstream)。

酵母(例如，釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)、乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)和巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris))也是糖蛋白的可用的表達(dá)宿主。酵母可用附加型復(fù)制載體轉(zhuǎn)化，或用通過同源重組穩(wěn)定染色體整合轉(zhuǎn)化。通常來說，誘導(dǎo)型啟動子(例如包括gal1、gal7和gal5)可用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)。酵母表達(dá)載體通常包含選擇標(biāo)記(例如leu2、trp1、his3和ura3)，用于選擇和維持經(jīng)轉(zhuǎn)化的dna。

哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)也可用于表達(dá)本文中所述的蛋白質(zhì)和多肽。表達(dá)構(gòu)建體可以通過病毒感染(例如使用腺病毒)或通過直接dna轉(zhuǎn)移(例如使用脂質(zhì)體、磷酸鈣、deae-葡聚糖)和通過物理手段(例如電穿孔和顯微注射)轉(zhuǎn)移到哺乳動物細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體通常包括mrna帽位點(diǎn)、tata盒、翻譯起始序列(kozak共有序列)和聚腺苷酸化元件。這些載體通常包括用于高水平表達(dá)的轉(zhuǎn)錄啟動子-增強(qiáng)子，例如sv40啟動子-增強(qiáng)子、人巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，cmv)啟動子和勞斯肉瘤病毒(roussarcomavirus，rsv)的長末端重復(fù)序列。可用于哺乳動物表達(dá)的示例性細(xì)胞系包括但不限于小鼠、大鼠、人、猴以及雞和倉鼠細(xì)胞，例如bhk、293-f、cho、balb/3t3、hela、mt2、小鼠nso(非分泌型)和其他骨髓瘤細(xì)胞系、雜交瘤和異源雜交瘤細(xì)胞系、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、sp2/0、cos、nih3t3、hek293、293s、293t、2b8和hkb細(xì)胞。

也可以使用固相糖肽合成、天然化學(xué)連接(nativechemicalligation，ncl)和表達(dá)的蛋白質(zhì)連接(expressedproteinligation，epl)來合成糖蛋白。

產(chǎn)生后，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法純化嵌合蛋白或第一多肽和第二多肽(如果分開產(chǎn)生)，包括但不限于sds-page、尺寸分級和尺寸排阻色譜、硫酸銨沉淀、螯合色譜、離子交換色譜和親和色譜。親和純化技術(shù)可用于提高制劑的效率和純度。例如，結(jié)合嵌合蛋白或者第一或第二多肽的抗體、受體和其他分子可用于親和純化。如上文中所討論的，構(gòu)建體可以被工程化以添加親和標(biāo)簽，例如myc表位、gst融合物或his6，并且可以分別用myc抗體、谷胱甘肽樹脂和ni-樹脂進(jìn)行純化。純度可以通過本領(lǐng)域中已知的任何方法進(jìn)行評估，包括凝膠電泳和染色以及分光光度技術(shù)。

納米顆粒載體

本發(fā)明的納米顆粒載體包含至少一種上述和本文中所述的嵌合蛋白。因此，納米顆粒載體可包含嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一多肽(其為tlr5激動劑)和第二多肽(其與seqidno：1所示gp120多肽具有至少50％的序列同一性并且至少8個n-糖基化位點(diǎn))。由于上述嵌合蛋白的性質(zhì)，包含嵌合蛋白的納米顆粒載體可與抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞)結(jié)合并被內(nèi)化。

本發(fā)明考慮了可以附接于一個或更多個多肽并且可被抗原呈遞細(xì)胞(特別是樹突細(xì)胞)內(nèi)化的任何納米顆粒載體。示例性納米顆粒載體包括但不限于脂質(zhì)體(包括中性、陰離子型或陽離子型脂質(zhì)體；和醇脂體(ethosome))、病毒微體、病毒樣顆粒(vlp)、古細(xì)菌脂質(zhì)體、質(zhì)膜囊泡(pmv)、非離子表面活性劑囊泡、脂質(zhì)核心肽(lcp)、免疫刺激復(fù)合物(iscom)、基于聚合物的納米顆粒(例如生物可降解納米顆粒，如聚(d，l-乳酸-乙醇酸)共聚物(plga)納米顆粒、聚丙烯硫化物納米顆粒和多羥基化納米顆粒)。很多種納米顆粒載體是本領(lǐng)域中公知的，并已在別處進(jìn)行了廣泛的研究和描述(綜述參見例如joshietal.(2012)jcontrelease161：25-37；altin(2012)liposomesandothernanoparticlesascancervaccinesandimmunotherapeutics.第8章：innovationsinvaccinology：fromdesign，throughtodeliveryandtesting.s.baschieri編輯，springer；gregoryetal.(2013)frontcellinfectmicrobiol.3：13；和zhaoetal.(2014)32(3)：327-337)。

在一些特別的實(shí)例中，本發(fā)明的納米顆粒載體是脂質(zhì)體，其是基于脂質(zhì)的雙層囊泡。脂質(zhì)的顆粒大小和物理參數(shù)的多樣性已經(jīng)導(dǎo)致脂質(zhì)體被廣泛用作藥物、肽、蛋白質(zhì)和核酸分子的載體，用于藥學(xué)、化妝品學(xué)和生物化學(xué)目的。脂質(zhì)體主要由囊泡形成脂質(zhì)構(gòu)成，其可以是天然的、半合成的或完全合成的，中性的、帶負(fù)電荷的或帶正電荷的。示例性的囊泡形成脂質(zhì)包括鞘脂、醚脂、甾醇、磷脂(特別是磷酸甘油酯)和糖脂，例如腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。適用于脂質(zhì)體的脂質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且在多種來源中引用，例如1998mccutcheon′sdetergentsandemulsifiers，1998mccutcheon′sfunctionalmaterials(兩者均由mccutcheonpublishingco.，newjersey出版)，以及avantipolarlipids，inc.catalog。在一些具體實(shí)例中，本發(fā)明的脂質(zhì)體包括以下中的任意一種或更多種1，2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(dopc)、1，2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(鈉鹽)(dopg)、1，2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸-l-絲氨酸(鈉鹽)(dops)、1，2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)、1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(氯化物鹽)(dotap)、1，2-二油?；?3-二甲基銨-丙烷(dodap)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-750](銨鹽)(dspe-peg750)、1-棕櫚?；?2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(popc)或2-(4，4-二氟-5-甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-引達(dá)省-3-十二烷?；?-1-十六烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(bodipy)。生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且已在別處廣泛地描述(綜述參見例如wagner和vorauer-uhl(2011)jdrugdelivery，articleid591325；yuetal.(2009)methodsenzymol.465：129-141，以及l(fā)aouinietal.(2012)jcolloidscibiotech1：147-168)，2012.)。這些方法包括例如薄膜水化、洗滌劑透析、反相蒸發(fā)、乙醇注射、單相溶液的冷凍干燥、微流控流體動力學(xué)聚焦和超臨界流體方法。

可以使用本領(lǐng)域中已知的任何方法將嵌合蛋白附接于納米顆粒載體，只要附接允許嵌合蛋白與抗原呈遞細(xì)胞之間的相互作用以便能夠結(jié)合和內(nèi)化即可。因此，最典型地，附接嵌合蛋白，使得其展示在納米顆粒載體的表面上。用于將蛋白質(zhì)附接于納米顆粒載體的許多方法是眾所周知的，包括共價和非共價方法(參見例如nobsetal.(2004)jpharmsci.93(8)：1980-92；marques-gallego和dekroon(2014)biomedresearchinternational，articleid129458)。蛋白質(zhì)可以在納米顆粒載體形成期間附接于納米顆粒載體上，或者可以附接于預(yù)形成的納米顆粒載體的表面。例如，蛋白質(zhì)可以附接于脂質(zhì)并且將脂質(zhì)-蛋白質(zhì)與其他組分混合以制備納米顆粒載體(參見例如suraceetal.，(2009)molecularpharmaceutics6：1062-1073；banerieeetal.(2004)internationaljournalofcancer112：693-700)?；蛘?，可以通過酰胺綴合、胺-羧基綴合、二硫化物/硫醚綴合或生物素/鏈霉親和素結(jié)合將蛋白質(zhì)連接到納米顆粒載體的表面。在另一些實(shí)例中，可以使用“點(diǎn)擊化學(xué)”，包括銅(i)催化的huisgen1，3-偶極環(huán)加成(cuaac)連接(hassaneetetal.(2006)bioconjugatechemistry17：849-854)、無銅點(diǎn)擊化學(xué)連接(kooetal.(2012)angewandtechemie：internationaledition51：11836-11840)、staudinger連接(zhangetal.(2009)chemicalcommunications21：3032-3034)和需求四嗪/反式環(huán)辛烯逆電子的diels-alder環(huán)加成(iedda)(emmetiereetal.，(2013)bioconjugatechemistry24：1784-1789)。

在一些具體實(shí)例中，嵌合蛋白包含組氨酸標(biāo)簽，并且蛋白質(zhì)通過螯合劑脂質(zhì)接枝至脂質(zhì)體，所述螯合劑脂質(zhì)具有一個或更多個氨三乙酸部分，例如但不限于氨三乙酸(nta)或三氨三乙酸(3nta)，以及金屬離子，例如鎳(ni)離子。通常來說，氨三乙酸部分附接于至少一個脂肪鏈，其可以具有不同長度并且可以是飽和或不飽和的。在一些具體實(shí)例中，氨三乙酸部分附接于8至20個碳的一個或更多個脂肪族鏈。脂肪鏈的非限制性實(shí)例包括二(十四烷基)胺(dtda)鏈、pam2cys((s-(2，3-二棕櫚酰-丙基)半胱氨酸)和pam3cys(n-棕櫚?；?s-[2，3-雙(棕櫚酰氧基)丙基]半胱氨酸)。因此，在一些實(shí)例中，氨三乙酸部分附接于一個或更多個二(十四烷基)胺(dtda)鏈，得到例如氨三乙酸二(十四烷基)胺(nta-dtda)或3(氨三乙酸)-二(十四烷基)胺(3ntadtda)。(altinetal.(2001)biochimbiophysacta1513(2)：131-48；vanbroekhavenetal.(2005)biochimicaetbiophysicaacta-biomembranes1716：104-116)。在另一些實(shí)例中，氨三乙酸部分附接于pam2cys，例如wo2006081631中所述。例如，3nta附接于pam2cysserlys8cys(p2csk8c)產(chǎn)生lipokel(pam2cysserlys8cys-3nta)。因此，本發(fā)明的示例性納米顆粒載體含有nta-dtda、3ntadtda和/或pam2cysserlys8cys-3nta。

本發(fā)明的納米顆粒載體還可包含一種或更多種其他實(shí)體，例如多肽、肽、核酸分子或藥物中的一種或更多種，其可以包封在載體內(nèi)和/或附接于載體表面。特別考慮的是包含抗原的納米顆粒載體，當(dāng)向?qū)ο笫┯眉{米顆粒載體時可以引起針對所述抗原的免疫應(yīng)答。示例性的抗原包括細(xì)菌抗原(例如來自以下的抗原：放線菌屬(actinomyces)、芽孢桿菌屬(bacillus)、擬桿菌(bacteroides)、鮑特菌屬(bordetella)、巴通體屬(bartonella)、疏螺旋體(borrelia)、布魯氏菌屬(brucella)、彎曲菌屬(campylobacter)、二氧化碳嗜纖維菌屬(capnocytophaga)、衣原體屬(chlamydia)、梭菌屬(clostridium)、棒狀桿菌屬(corynebacterium)、柯克斯體屬(coxiella)、嗜皮菌屬(dermatophilus)、腸球菌屬(enterococcus)、埃立克體屬(ehrlichia)、埃希菌屬(escherichia)、弗朗西絲菌屬(francisella)、梭形桿菌屬(fusobacterium)、血巴通體屬(haemobartonella)、螺桿菌(helicobacter)、克雷伯菌屬(klebsiella)、l型細(xì)菌(l-formbacteria)、鉤端螺旋體屬(leptospira)、李斯特菌屬(listeria)、分枝桿菌屬(mycobacteria)、支原體屬(mycoplasma)、新立克次氏體屬(neorickettsia)、諾卡菌屬(nocardia)、巴斯德菌屬(pasteurella)、消化球菌屬(peptococcus)、消化鏈球菌屬(peptostreptococcus)、變形桿菌屬(proteus)、假單胞菌屬(pseudomonas)、立克次體屬(rickettsia)、羅卡利馬體屬(rochalimaea)、沙門菌屬(salmonella)、志賀菌屬(shigella)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)和耶爾森菌屬(yersinia))、病毒抗原(例如來自以下的抗原：腺病毒(adenovirus)、杯狀病毒(calicivirus)、冠狀病毒(coronavirus)、瘟熱病毒(distempervirus)、肝炎病毒(hepatitisvirus)、皰疹病毒(herpesvirus)、免疫缺陷病毒(immunodeficiencyvirus)、感染性腹膜炎病毒(infectiousperitonitisvirus)、白血病病毒(leukemiavirus)、致癌病毒(oncogenicvirus)、乳頭瘤病毒(papillomavirus)、副流感病毒(parainfluenzavirus)、細(xì)小病毒(parvovirus)、狂犬病病毒(rabiesvirus)和呼腸孤病毒(reovirus))、真菌抗原(例如來自以下的抗原：犁頭霉屬(absidia)、枝頂孢屬(acremonium)、鏈格孢屬(alternaria)、曲霉屬(aspergillus)、蛙糞霉屬(basidiobolus)、平臍蠕孢屬(bipolaris)、芽生菌屬(blastomyces)、念珠菌屬(candida)、球孢子菌屬(coccidioides)、耳霉屬(conidiobolus)、隱球菌屬(cryptococcus)、彎孢菌屬(curvalaria)、表皮癬菌屬(epidermophyton)、外瓶霉屬(exophiala)、地絲菌屬(geotrichum)、組織胞漿菌屬(histoplasma)、馬杜拉分支菌屬(madurella)、馬拉色菌屬(malassezia)、小孢子菌屬(microsporum)、叢梗孢屬(moniliella)、被孢霉屬(mortierella)、毛霉菌(mucor)、擬青霉屬(paecilomyces)、青霉屬(penicillium)、單胞瓶霉屬(phialemonium)、瓶霉屬(phialophora)、原壁菌屬(prototheca)、假霉樣真菌屬(pseudallescheria)、假小托菌屬(pseudomicrodochium)、腐霉屬(pythium)、鼻孢子菌屬(rhinosporidium)、根霉屬(rhizopus)、齒梗孢屬(scolecobasidium)、孢子絲菌屬(sporothrix)、匐柄霉屬(stemphylium)、毛蘚菌(trichophyton)、毛孢子菌屬(trichosporon)和木絲霉屬(xylohypha))、原蟲或寄生蟲抗原(例如來自以下的抗原：巴倍蟲屬(babesia)、腸袋蟲屬(balantidium)、貝諾孢子蟲屬(besnoitia)、隱孢子蟲屬(cryptosporidium)、艾美蟲屬(eimeria)、腦胞內(nèi)原蟲屬(encephalitozoon)、內(nèi)阿米巴屬(entamoeba)、賈第蟲屬(giardia)、哈蒙德蟲屬(hammondia)、肝簇蟲屬(hepatozoon)、等孢子球蟲屬(isospora)、利什曼原蟲屬(leishmania)、微孢子蟲屬(microsporidia)、新孢子蟲屬(neospora)、小孢子蟲屬(nosema)、五鞭毛蟲屬(pentatrichomonas)、瘧原蟲屬(plasmodium)、肺孢子蟲屬(pneumocystis)、肉孢子蟲屬(sarcocystis)、血吸蟲屬(schistosoma)、泰勒蟲病(theileria)、弓形蟲屬(toxoplasma)、錐蟲屬(trypanosoma)、棘唇線蟲屬(acanthocheilonema)、貓圓線蟲屬(aelurostrongylus)、鉤口線蟲屬(ancylostoma)、管圓線蟲屬(angiostrongylus)、蛔蟲屬(ascaris)、布魯絲蟲屬(brugia)、仰口線蟲屬(bunostomum)、毛細(xì)線蟲屬(capillaria)、夏柏特線蟲屬(chabertia)、古柏線蟲屬(cooperia)、鋸體線蟲屬(crenosoma)、網(wǎng)尾線蟲屬(dictyocaulus)、膨結(jié)線蟲屬(dioctophyme)、棘唇線蟲屬(dipetalonema)、裂頭絳蟲屬(diphyllobothrium)、復(fù)孔絳蟲屬(diplydium)、惡絲蟲屬(dirofilaria)、龍線蟲屬(dracunculus)、蟯蟲屬(enterobius)、類絲蟲屬(filaroides)、血矛線蟲屬(haemonchus)、兔唇蛔屬(lagochilascaris)、羅阿絲蟲屬(loa)、曼森線蟲屬(mansonella)、繆勒線蟲屬(muellerius)、侏體吸蟲屬(nanophyetus)、板口線蟲屬(necator)、細(xì)頸線蟲屬(nematodirus)、結(jié)節(jié)線蟲屬(oesophagostomum)、盤尾絲蟲屬(onchocerca)、后睪吸蟲屬(opisthorchis)、奧斯特線蟲屬(ostertagia)、副絲蟲屬(parafilaria)、并殖吸蟲屬(paragonimus)、副蛔蟲屬(parascaris)、泡翼線蟲屬(physaloptera)、原圓線蟲屬(protostrongylus)、腹腔絲蟲屬(setaria)、尾旋線蟲屬(spirocerca)、迭宮絳蟲屬(spirometra)、冠絲蟲屬(stephanofilaria)、類圓線蟲屬(strongyloides)、圓線蟲屬(strongylus)、吸吮線蟲屬(thelazia)、弓蛔蟲屬(toxascaris)、弓首蛔蟲屬(toxocara)、旋毛蟲屬(trichinella)、毛圓線蟲屬(trichostrongylus)、鞭蟲屬(trichuris)、彎口屬(uncinaria)和吳策線蟲屬(wuchereria))，以及腫瘤抗原(例如，cea、mhc、ctla-4、gp100、間皮素、pd-l1、trp1、cd40、egfp、her2、tcrα、trp2、tcr、muc1、cdr2、ras、4-1bb、ct26、gitr、ox40、tgf-β.wt1、muc1、lmp2、hpve6e7、egfrviii、her-2/neu、magea3、p53非突變體、ny-eso-1、psma、gd2、melana/mart1、ras突變體、gp100、p53突變體、蛋白酶3(pr1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活蛋白、psa、htert、epha2、pap、ml-iap、afp、epcam、erg(tmprss2ets融合基因)、na17、pax3、alk、雄激素受體、細(xì)胞周期蛋白b1、聚唾液酸、mycn、rhoc、trp-2、gd3、巖藻糖基gm1、間皮素、psca、magea1、sle(a)、cyp1b1、plac1、gm3、boris、tn、globoh、etv6-aml、ny-br-1、rgs5、sart3、stn、碳酸酐酶ix、pax5、oy-tes1、精子蛋白17、lck、hmwmaa、akap-4、ssx2、xage1、b7h3、豆莢蛋白、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-1、fap、pdgfr-β、mad-ct-2和fos相關(guān)抗原1)?？乖梢允嵌嚯幕螂?包括糖蛋白或糖肽)或核酸分子(例如dna或rna)?？乖梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法包封在納米顆粒內(nèi)或附接于納米顆粒的表面。在一些特別的實(shí)例中，抗原附接于納米顆粒載體的表面。本發(fā)明的納米顆粒載體可包含一種或更多種抗原。

還考慮了包含一種或更多種其他免疫調(diào)節(jié)劑(包括例如其他tlr激動劑、趨化因子和/或細(xì)胞因子)的納米顆粒載體。tlr激動劑包括天然激動劑，例如pamp(病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecularpattern))或damp(損傷相關(guān)分子模式(damage-associatedmolecularpattern))配體，以及合成的激動劑。用于本發(fā)明目的的tlr激動劑是本領(lǐng)域已知的，并且包括tlr1/2激動劑(例如三?；?、pam3cys)、tlr2激動劑(例如來自革蘭氏陽性菌的肽聚糖、細(xì)菌脂蛋白、脂磷壁酸、脂多糖(lipopolysaccharide，lps)、gpi錨蛋白、奈瑟菌孔蛋白、磷脂甘露聚糖(phospholipomannan)、cfa、malp2、pam2cvs、fsl-1和hib-ompc)、tlr3激動劑(例如單鏈和雙鏈病毒rna、聚i：c、聚a：u)、tlr4激動劑(例如，lps、rsvf蛋白；甘露聚糖、糖肌醇磷脂、rsv和mmtv包膜蛋白、hsp60、hsp70、纖連蛋白結(jié)構(gòu)域a、表面活性蛋白a、透明質(zhì)酸、hmgb-1、agp、mpla、rc-529、mdf2β和cfa)、tlr2/6激動劑(例如，酚可溶性調(diào)控蛋白、二?；?、lta、酵母聚糖、malp-2、pam2cys和fsl-1)、tlr7激動劑(例如，病毒單鏈rna、人rna、鳥苷類似物和咪唑并喹啉(例如，咪喹莫特、r848、)和洛索立賓)、tlr8激動劑(例如，病毒單鏈rna、人rna、咪唑并喹啉、洛索立賓和sspolyu)、tlr9激動劑(dsdna病毒、瘧原蟲色素、未甲基化cpgdna、人dna/染色質(zhì)、ll37-dna和cpg寡核苷酸)和tlr10激動劑。在一些特別的實(shí)例中，納米顆粒載體包含pam2cys。例如，納米顆粒載體可包含lipokel，其包含通過異雙官能接頭分子6-馬來酰亞氨基己酸n-琥珀酰亞胺基酯(mcs)與3nta偶聯(lián)的脂質(zhì)部分p2csk8c(wo2006081631)。

用途和方法

包含本文中所述嵌合蛋白的本發(fā)明納米顆粒載體特別用于內(nèi)化抗原呈遞細(xì)胞中的抗原。可以將包含本發(fā)明嵌合蛋白和一種或更多種抗原的納米顆粒載體與抗原呈遞細(xì)胞接觸，以促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞對納米顆粒載體并因此對抗原的內(nèi)化。在一些特別的實(shí)例中，抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì)胞?？乖蔬f細(xì)胞與納米顆粒載體之間的接觸可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。

包含本文中所述嵌合蛋白的本發(fā)明納米顆粒載體也特別用于引起對由納米顆粒載體攜帶的抗原的免疫應(yīng)答。包含嵌合蛋白和一種或更多種抗原的納米顆粒載體可以以足以引起針對抗原之免疫應(yīng)答的量施用于對象。免疫應(yīng)答可以是細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答，并且包含cd4⁺t細(xì)胞應(yīng)答、cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答、體液應(yīng)答(即，b細(xì)胞)和/或誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和/或趨化因子。在一些特別的情況下，所述方法引起至少cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答。

納米顆粒載體可以以任何常規(guī)方式與一種或更多種生理上可接受的載體或賦形劑一起配制。載體或賦形劑的選擇在施用專業(yè)技術(shù)的范圍內(nèi)，并且可以取決于許多參數(shù)，例如施用方式(即靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或任何其他方式)。本文中提供的納米顆粒載體可以配制成用于直接施用或者可以配制成用于稀釋或其他修改。因此，納米顆粒載體可以配制成單一(或單位)劑量形式或多劑量形式。單劑量形式的實(shí)例包括安瓿和注射器。多劑量形式的實(shí)例包括含有多個單位劑量的小瓶和瓶。

通常來說，鑒于來自管理機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)或者根據(jù)通常認(rèn)可的用于動物和人類的藥典制備用于治療用途的納米顆粒載體。納米顆粒載體可包含載體，例如稀釋劑、賦形劑或載劑。這樣的藥物載體可以是無菌液體，例如水和油。鹽溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液體載體，特別是對于可注射溶液。組合物可與活性成分一起包含：稀釋劑，例如乳糖、蔗糖、磷酸二鈣或羧甲基纖維素；潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣和滑石；以及黏合劑，例如淀粉、天然樹膠(如阿拉伯膠)、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素及其衍生物、聚維酮、交聯(lián)維酮和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的黏合劑。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙二醇(propylene，glycol)、水和乙醇。如果期望的話，疫苗組合物還可含有少量的潤濕劑或乳化劑或ph緩沖劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鈉、環(huán)糊精衍生物、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鈉、油酸三乙醇胺和其他此類試劑。合適的藥物載體的實(shí)例描述于e.w.martin的″remington′spharmaceuticalsciences″中。

向?qū)ο笫┯玫募{米顆粒載體的精確量或劑量取決于負(fù)載于載體上或載體中的抗原的量、抗原的抗原性、tlr5激動劑的類型、施用途徑、施用的劑量數(shù)和其他考慮因素，例如對象的體重、年齡和一般狀態(tài)。特定的劑量和施用方案可以憑經(jīng)驗(yàn)確定或者從例如動物模型中的研究或先前在人中的研究推斷。

納米顆粒載體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為適合的任何方法和途徑來施用，包括但不限于肌內(nèi)、皮內(nèi)、胃腸外、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、經(jīng)口、腹膜內(nèi)或表面施用，以及其任何兩種或更多種的任何組合，以適合于每種施用途徑的方式配制。載體可以向?qū)ο笫┯靡淮位蚨嘤谝淮?，包?、3、4、5次或更多次。如果疫苗施用多于一次，則劑量施用之間的時間可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多周，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個月。選擇最佳疫苗接種方案完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能水平之內(nèi)。

如果期望的話，納米顆粒載體可以存在于包裝中、藥盒中或分配器裝置中，例如具有針的注射器，或具有針的小瓶和注射器，其可包含一個或更多個單位劑量形式。藥盒或分配器裝置可以附帶施用說明書。

已經(jīng)一般性地描述了本發(fā)明，通過參考以下實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，所述實(shí)施例通過舉例說明的方式提供并且不旨在作為限制。

本發(fā)明的實(shí)施例

實(shí)施例1.材料和方法

flic-gp120融合蛋白的產(chǎn)生和純化

通過將來自鼠傷寒沙門菌的flic基因(seqidno：4)框內(nèi)融合在hivgp120基因(seqidno：2)的3′末端來產(chǎn)生flic-gp120嵌合蛋白fg115(seqidno：5；圖1b)。包含具有序列actagt(seqidno：7)的短接頭以分離兩個編碼區(qū)，所述短接頭翻譯成蘇氨酸-絲氨酸二肽接頭。在融合蛋白盒的5′末端(翻譯為融合蛋白的c末端部分)包含編碼凝血酶切割序列(seqidno：9所示核苷酸序列；seqidno：8所示氨基酸序列)和組氨酸標(biāo)簽(6h；seqidno：11所示核苷酸序列；seqidno：10所示氨基酸序列)的核酸。

將所得融合蛋白盒(seqidno：6；圖1a)克隆到pfastbac質(zhì)粒載體中，用于使用sf9或highfive^tm(lifetechnologies)昆蟲細(xì)胞中的桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)生3批fg115。

第一批fg115(2011)重組蛋白在昆士蘭大學(xué)(universityofqueensland)蛋白質(zhì)表達(dá)設(shè)施生產(chǎn)。簡單來說，將感染的sf9細(xì)胞在28℃下在sf900-ii培養(yǎng)基中培養(yǎng)，72小時后收獲。使用固定化金屬離子親和色譜(immobilizedmetalionaffinitychromatography，imac)和離子交換色譜(ionexchangechromatography，iex)利用兩步法從上清液中純化fg115蛋白。imac純化使用5mlhistrapff(ge)柱，結(jié)合/洗滌緩沖液為ph8.5的20mmtris-hcl、200mm氯化鈉、20mm咪唑，洗脫緩沖液為ph8.5的20mmtris-hcl、200mm氯化鈉、500mm咪唑。iex純化使用5mlhitrapqff(ge)柱，結(jié)合/洗滌緩沖液為ph8.5的20mmtris-hcl、10mm氯化鈉，并且洗脫緩沖液為ph8.5的20mmtris-hcl、1m氯化鈉。觀察到兩個峰(a和b)，對于每個峰具有大致相等的產(chǎn)率(峰a級分：0.33mg/ml；峰b級分：0.34mg/ml)。

第二批fg115(05/2014)通過感染highfive^tm細(xì)胞，然后將其在27℃下在sf900-ii培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在48小時后收獲來產(chǎn)生。使用imac和尺寸排阻色譜(sec)利用兩步法從上清液中純化fg115蛋白。imac純化使用5mlhistrapff(ge)柱，結(jié)合/洗滌緩沖液為ph7.0的20mmnap、500mmnacl、60mm咪唑，且洗脫緩沖液為ph7.0的20mmnap、500mmnacl、500mm咪唑。sec純化使用具有pbs緩沖液的hiload26/600superdex200(gehealthcare)柱。觀察到兩個峰(a和b)，峰a的產(chǎn)率為0.30mg/ml，且峰b為0.58mg/ml。

第三批fg115(07/2014)也通過感染highfive^tm細(xì)胞，然后在27℃下將其在sf900-ii培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在66小時后收獲來產(chǎn)生。在使用imac和sec的兩步法純化fg115蛋白之前，首先使用50kdamwcohydrosart超濾盒(sartoriuscrossflowsystems)濃縮上清液。imac純化使用5mlhistrapff(ge)柱，結(jié)合/洗滌緩沖液為ph7.0的20mmnap、500mm氯化鈉、80mm咪唑，且洗脫緩沖液為ph7.0的20mmnap、500mmnacl、700mm咪唑。sec純化使用具有pbs緩沖液的hiload26/600superdex200(gehealthcare)柱。觀察到兩個峰(a和b)，峰a的產(chǎn)量為0..88mg/ml，且峰b為0.1.16mg/ml。

圖1c是fg115嵌合蛋白的示意圖，示出了gp120多肽中的12個潛在n-糖基化位點(diǎn)。嵌合蛋白的預(yù)期分子量(通過序列)為約110kda。通過在昆蟲細(xì)胞表達(dá)過程中糖基化，fg115蛋白具有高得多的表觀分子量(圖1d)。

脂質(zhì)體的制備

對于下述研究，制備了5種類型的脂質(zhì)體：沒有內(nèi)部貨物的儲備脂質(zhì)體，用于分析fg115接枝；用熒光示蹤劑500/510c12-hpc制備的熒光脂質(zhì)體，用于結(jié)合/靶向和內(nèi)化研究；用nt-fitc肽(這是攜帶熒光標(biāo)記fitc的合成神經(jīng)降壓肽)貨物制備的脂質(zhì)體；用siinfekl肽內(nèi)部貨物制備的脂質(zhì)體；用雞卵清蛋白(卵清蛋白或ova)蛋白內(nèi)部貨物制備的脂質(zhì)體。

脂質(zhì)購自avantipolarlipids，且包括1，2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(dopc)、1，2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(鈉鹽)(dopg)、1，2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸-l-絲氨酸(鈉鹽)(dops)、1，2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)、1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷(氯化物鹽)(dotap)、1，2-二油?；?3-二甲基銨-丙烷(dodap)、1，2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-750](銨鹽)(dspe-peg750)、1-棕櫚?；?2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(popc)或2-(4，4-二氟-5-甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-引達(dá)省-3-十二?；?-1-十六?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(bodipy)。

在一些脂質(zhì)體制備中還使用tlr4激動劑單磷酰脂質(zhì)a(合成)(phad)(mpla(phad))(avantipolarlipids)和tlr2激動劑lipokel(pam2cys-3nta)(內(nèi)部試劑)。

制備用于擠出的手動搖動的48mm脂質(zhì)囊泡

通常如下制備脂質(zhì)體。在揮發(fā)性溶劑(氯仿或乙醇)中制備組分脂質(zhì)的儲備溶液，并在適當(dāng)體積的圓底燒瓶中以正確的比例和體積混合，然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥成薄膜。將薄膜在鹽水或pbs的溶液中，或者含有如下所述的貨物蛋白質(zhì)或肽的這些溶液的任一種中再水化。通過輕輕用手搖動將膜再水化，產(chǎn)生不同大小的多層囊泡(mlv)的混懸液。使用簡單的手動注射器驅(qū)動的擠出機(jī)(例如avantipolarlipids“miniextruder”)或通過氮?dú)怛?qū)動的擠出系統(tǒng)(例如，northernlipids“l(fā)ipex”擠出機(jī))基本上根據(jù)制造商的說明，通過經(jīng)具有限定尺寸(通常0.2μm)的孔的聚碳酸酯膜擠出來調(diào)整mlv的大小。

具體地，通過用0.5％e-toxaclean溶液(sigma)處理至少2小時(優(yōu)選過夜)來除去內(nèi)毒素和任何痕量的殘余脂質(zhì)來準(zhǔn)備1000ml燒瓶。棄去e-toxaclean溶液，并用大量自來水然后用5體積的milliq水沖洗燒瓶。最后，將燒瓶用約50ml乙醇沖洗，然后風(fēng)干。

為了制備干燥的脂質(zhì)膜，將合適的脂質(zhì)從儲存器中取出并在室溫(rt)下靜置30分鐘。根據(jù)需要，將正確量的dopc(avantipolarlipids)溶解在干凈的20ml琥珀色玻璃小瓶中的5ml氯仿中；將正確量的dopg(avantipolarlipids)溶解在干凈的20ml琥珀色玻璃小瓶中的15ml氯仿中；將正確數(shù)量的dspe-peg750(avantipolarlipids)溶解在干凈的20ml琥珀色玻璃小瓶中的15ml氯仿中；并且將正確體積的3nta-dtda儲液(乙醇中7.1mg/ml)添加至處理過的1000ml燒瓶。然后將脂質(zhì)添加至含有3nta-dtda的1000ml燒瓶，并且將所有琥珀色玻璃小瓶用約2ml氯仿漂洗3次，并將該氯仿也添加至該1000ml燒瓶。

然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，水浴設(shè)定在42℃，并調(diào)節(jié)至400-600mmhg的真空，直到干燥脂質(zhì)的薄膜沉積在燒瓶的壁上。如果脂質(zhì)膜不均勻或含有大量氣泡，則將膜再溶解在5-10ml氯仿中，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上再次干燥。當(dāng)燒瓶中不再有可見的溶劑時，將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空度提高到最大(～600mmhg)10分鐘，將燒瓶從旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中取出并轉(zhuǎn)移到設(shè)置在42℃的真空烘箱中至少2小時(優(yōu)選過夜)以除去所有殘留痕量的氯仿。

為了重構(gòu)干燥的脂質(zhì)膜，將pbs和niso4儲液添加到50ml管中并加熱至37℃。將pbs/niso4溶液添加至含有干燥脂質(zhì)的燒瓶，并輕輕旋動30分鐘以使脂質(zhì)再水化。如果在30分鐘后燒瓶壁上仍然有可見的脂質(zhì)，則繼續(xù)旋轉(zhuǎn)其直至溶解。然后基本上根據(jù)制造商的說明書，使用具有加熱至52℃的10ml熱料筒(thermobarrel)的northernlipids“l(fā)ipex”擠出機(jī)將脂質(zhì)體通過0.4μmpc膜擠出5次，然后通過0.2μmpc膜擠出10次。對于體內(nèi)使用的材料，使用無菌的0.2μm過濾器和無菌注射器進(jìn)行額外的過濾步驟。

含肽脂質(zhì)體的制備

為了產(chǎn)生攜帶肽貨物(例如nt-fitc或siinfekl)貨物的脂質(zhì)體，通過將氯仿/乙醇中的脂質(zhì)儲料添加至圓底燒瓶(10-50ml體積)制備薄脂質(zhì)膜，并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑。通過輕輕用手搖動，將薄脂質(zhì)膜在肽的pbs溶液中再水化，產(chǎn)生不同大小的mlv的混懸液。使用avantipolarlipids“miniextruder”或northernlipids“l(fā)ipex”擠出機(jī)，通過經(jīng)具有限定尺寸(通常為0.2μm)的孔的聚碳酸酯膜擠出來調(diào)整mlv的大小。然后使用300kdamwco管道透析經(jīng)調(diào)整大小的脂質(zhì)體以除去任何未包封的肽。使用nanodrop儀器通過樣品的hplc和/或熒光分析測定經(jīng)透析的脂質(zhì)體的肽含量。

具體地，如上所述制備干燥的脂質(zhì)膜。根據(jù)需要使用ph7.5-8的肽溶液(siinfekl或nt-fitc)。將適當(dāng)體積的肽添加至含有干燥脂質(zhì)的燒瓶，并將燒瓶輕輕旋動30分鐘以使脂質(zhì)再水化。如果在30分鐘后燒瓶壁上仍然有可見的脂質(zhì)，則繼續(xù)旋動直至其溶解。

然后基本上根據(jù)制造商的說明書，使用具有加熱至52℃的10ml熱料筒的northernlipids“l(fā)ipex”擠出機(jī)將脂質(zhì)體通過0.2μmpc膜擠出5次。將擠出的脂質(zhì)體負(fù)載到長度為300kda的mwco管中，末端用“通用”尼龍透析封閉物固定，并且在至少100體積的鹽水中透析2小時，然后在清新的鹽水中在4℃下過夜。通過與肽標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，通過hplc測定脂質(zhì)體中存在的肽的量。通常來說，使用c18分析柱(graceeverest300ac185μm100mmx2.1mm)和水/乙腈梯度，兩種溶劑都含有0.1％三氟乙酸(tfa)。

ova脂質(zhì)體的制備

為了產(chǎn)生攜帶ova貨物的脂質(zhì)體，如上所述制備薄脂質(zhì)膜，之后將其在1.5mg/mlova的pbs溶液中通過輕輕用手搖動30分鐘再水化，產(chǎn)生不同大小的mlv的混懸液?；旧细鶕?jù)制造商的說明書，使用具有加熱至52℃的10ml熱料筒的northernlipids“l(fā)ipex”擠出機(jī)通過0.2μmpc膜擠出5次來對mlv調(diào)整大小。將擠出的脂質(zhì)體負(fù)載到長度為300kda的mwco管中，末端用“通用”尼龍透析封閉物固定，并且在至少100體積的鹽水中透析2小時，然后在清新的鹽水中在4℃下過夜。通過銀染sds-page凝膠確定ova含量，使用quantit凝膠分析軟件將經(jīng)透析脂質(zhì)體的ova含量與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。

脂質(zhì)體接枝

根據(jù)需要，用組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)(例如，fg115、flic-6his或gp120-6his)接枝如上所述制備的脂質(zhì)體。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定可接枝的蛋白質(zhì)的量。一個重要的假設(shè)是，最多只有50％的3nta-dtda分子能夠與his標(biāo)記的分子復(fù)合(因?yàn)榱硗?0％將朝向脂質(zhì)體的內(nèi)部水性區(qū)室)。簡言之，將所需量的擠出的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到干凈的管中，然后添加適量的組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。如果需要，用pbs將制劑補(bǔ)充至期望體積。通過反轉(zhuǎn)混合制劑，并在室溫(對于含bodipy的制劑在黑暗中)或4℃下孵育過夜。

實(shí)施例2.fg115接枝的脂質(zhì)體靶向人單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞

如上實(shí)施例1中所述，通過facs評估fg115-接枝的脂質(zhì)體與人單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞(modc)的結(jié)合。簡單來說，在具有0.25％3ntadtda和熒光示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc(0.2％)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體，脂質(zhì)骨架為dopc、dopg(30％)和dspe-peg750(2.5％)。將脂質(zhì)體用100μg/mlfg115蛋白、10μg/mlflgt肽(seqidno：12；鞭毛蛋白衍生肽-auspepptyltd)、50μg/mldc-sign特異性抗體dms5000(domantisltd)接枝或留著未接枝。接枝脂質(zhì)體的最終脂質(zhì)含量為3.6mm。

將10μl脂質(zhì)體添加至50,000個modc，并將混合物在冰上避光孵育30分鐘至1小時。用pbs輕輕洗滌細(xì)胞，然后通過facs分析脂質(zhì)體與細(xì)胞的結(jié)合(圖2)，并基于平均熒光強(qiáng)度(mfi)值評估脂質(zhì)體的靶向。觀察到與未接枝脂質(zhì)體(mfi為9.7)相比，fg115接枝的脂質(zhì)體以更高效率(mfi為27.7)與modc結(jié)合。用相關(guān)的flgt肽接枝的脂質(zhì)體不表現(xiàn)這種增強(qiáng)的結(jié)合(mfi為16.3)，而用dms5000接枝的脂質(zhì)體表現(xiàn)出強(qiáng)結(jié)合(mfi為143)。

實(shí)施例3.fg115接枝脂質(zhì)體的內(nèi)化

如上述實(shí)施例1中所述，通過facs評估fg115接枝脂質(zhì)體在體外人modc細(xì)胞中的內(nèi)化。簡單地說，在具有0.25％3ntadtda和熒光示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc(0.2％)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。脂質(zhì)體使用的脂質(zhì)骨架為dopc、dopg(30％)和dspe-peg750(2.5％)。將脂質(zhì)體用100μg/mlfg115蛋白、50μg/mldms5000接枝或留著未接枝。將脂質(zhì)體添加至預(yù)冷的modc(預(yù)期最小內(nèi)化)或維持在37℃的modc(20μl接枝脂質(zhì)體與50,000個細(xì)胞混合)并將混合物分別在4℃或37℃下避光孵育2小時。然后用pbs或pbs/咪唑洗滌細(xì)胞-脂質(zhì)體混合物，并通過facs進(jìn)行分析。pbs洗滌使得能夠評估細(xì)胞締合(即，表面締合的或內(nèi)化的)脂質(zhì)體，而pbs/咪唑洗掉表面締合脂質(zhì)體，使得這些細(xì)胞的mfi僅反映內(nèi)化脂質(zhì)體。如來自使用不同供體的modc的兩個單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的fac分析的mfi值所示(圖3a和3b)，如預(yù)期的那樣，在4℃下，未接枝脂質(zhì)體具有可忽略的締合和最小內(nèi)化。當(dāng)fg115接枝到脂質(zhì)體表面上時，在4℃檢測到脂質(zhì)體與modc的提高的結(jié)合(提高約3倍)?？梢詫⑦@些脂質(zhì)體從維持在4℃的細(xì)胞中除去，如用pbs/咪唑洗滌的fg115-脂質(zhì)體-細(xì)胞混合物的mfi所示。在37℃下，發(fā)現(xiàn)更高水平的熒光與所有細(xì)胞相關(guān)，其中大部分看來是內(nèi)化的結(jié)果。這些結(jié)果清楚地表明，與未接枝脂質(zhì)體相比，fg115接枝脂質(zhì)體的內(nèi)化增強(qiáng)。

實(shí)施例4.fg115密度對fg115接枝脂質(zhì)體在人modc細(xì)胞中內(nèi)化的影響

用100μg/ml或50μg/mlfg115蛋白質(zhì)接枝脂質(zhì)體以評估fg115密度對內(nèi)化的影響。簡單地說，在具有0.25％3ntadtda和熒光示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc(0.2％)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。脂質(zhì)骨架為dopc(67.05％)、dopg(30％)和dspe-peg750(2.5％)。將脂質(zhì)體用100μg/ml或50μg/mlfg115蛋白，25μg/ml、50μg/ml或75μg/mldms5000接枝，或者留著未接枝。最終脂質(zhì)含量為3.6mm。然后將脂質(zhì)體添加至來自兩個供體的modc(20μl接枝脂質(zhì)體與50,000個細(xì)胞混合)。modc預(yù)冷卻或保持在37℃，并將混合物在相關(guān)溫度下避光孵育2小時。然后用pbs或pbs/咪唑洗滌細(xì)胞-脂質(zhì)體混合物，并通過facs進(jìn)行分析。

使用從多個供體制備的modc觀察到與未接枝脂質(zhì)體相比，fg115接枝脂質(zhì)體的內(nèi)化提高，在相同條件下，fg115接枝脂質(zhì)體的mfi值為未接枝脂質(zhì)體的約兩倍(數(shù)據(jù)未示出)。此外，與50μg/ml相比，當(dāng)用100μg/mlfg115接枝脂質(zhì)體時，內(nèi)化增強(qiáng)約25-40％，表明脂質(zhì)體表面提高的fg115密度提高了與modc結(jié)合的脂質(zhì)體并增強(qiáng)脂質(zhì)體內(nèi)化。

實(shí)施例5.用不同級分的fg115接枝脂質(zhì)體接枝的脂質(zhì)體的結(jié)合

當(dāng)如實(shí)施例1所述純化fg115時，通常檢測到兩個峰(標(biāo)記為a和b)。在highfive昆蟲細(xì)胞中表達(dá)后，分離來自峰a和b的fg115，并分別評估其增強(qiáng)接枝脂質(zhì)內(nèi)化的能力。簡單地說，在具有0.25％3ntadtda和熒光示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc(0.2％)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。脂質(zhì)骨架為dopc(67.05％)、dopg(30％)和dspe-peg750(2.5％)。以10至90mg/ml的最終濃度用fg115蛋白接枝脂質(zhì)體(或者未接枝)以產(chǎn)生下表1中所示制劑。

將20μl脂質(zhì)體添加至來自兩個供體之一的50,000個modc，并將混合物在冰上避光孵育。通過facs結(jié)合分析脂質(zhì)體與細(xì)胞的結(jié)合，并確定mfi值。觀察到與來自峰a的fg115相比，來自峰b的fg115看來促進(jìn)改善的結(jié)合(表1)。也證實(shí)了在劑量范圍內(nèi)的劑量效應(yīng)。

表1

實(shí)施例6.峰bfg115接枝脂質(zhì)體與cd11c⁺細(xì)胞的結(jié)合

使用峰bfg115評估fg115接枝脂質(zhì)體與來自c57/bl6dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠的cd11c⁺細(xì)胞的結(jié)合。簡單地說，在具有0.25％3ntadtda和熒光示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc(0.2％)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。脂質(zhì)骨架為dopc(67.05％)、dopg(30％)和dspe-peg750(2.5％)。將脂質(zhì)體用最終濃度為10至90μg/ml的由highfive細(xì)胞表達(dá)的fg115蛋白或者0.75或75μg/ml的dms5000接枝，以產(chǎn)生如下表2所示脂質(zhì)體制劑。

表2

將脂質(zhì)體添加至從c57bl/6dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠的脾中純化的cd11c⁺細(xì)胞(20μl脂質(zhì)體與50,000個細(xì)胞混合)，將混合物在冰上避光孵育1小時。通過facs分析脂質(zhì)體與細(xì)胞的結(jié)合。觀察到fg115接枝改善了脂質(zhì)體與cd11c⁺細(xì)胞的結(jié)合(數(shù)據(jù)未示出)。即使在0.75μg/ml的低接枝水平下，dms5000接枝也改善結(jié)合。

實(shí)施例7.人modc細(xì)胞對峰bfg115接枝脂質(zhì)體的內(nèi)化

使用人modc評估用來自峰bfg115接枝的脂質(zhì)體的內(nèi)化。簡單地說，在具有0.25％3ntadtda和熒光示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc(0.2％)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。脂質(zhì)骨架為dopc(67.05％)、dopg(30％)和dspe-peg750(2.5％)。用來自在highfive細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的峰b的fg115蛋白或者dms5000以0.75或75μg/ml接枝脂質(zhì)體，以產(chǎn)生下表3所示脂質(zhì)體制劑。

表3

將20μl脂質(zhì)體添加至來自兩個供體(供體1或供體2)之一的50,000個modc，其中細(xì)胞預(yù)冷卻或保持在37℃，并將混合物在相關(guān)溫度下避光孵育20分鐘。然后用pbs或pbs/咪唑洗滌細(xì)胞-脂質(zhì)體混合物，并通過facs進(jìn)行分析。代表供體1和供體2modc中內(nèi)化的脂質(zhì)體的mfi值在表4中示出。數(shù)據(jù)表明，根據(jù)供體細(xì)胞，以測試的最高fg115密度(90μg/ml)用峰bfg115接枝使脂質(zhì)體內(nèi)化提高至多10倍。盡管通過dms5000將脂質(zhì)體靶向modc是非常高效的，但是用fg115接枝脂質(zhì)體觀察到更高水平的內(nèi)化。

表4

實(shí)施例8.熒光fg115接枝脂質(zhì)體的內(nèi)化

使用具有作為內(nèi)部含水貨物的一部分而不是脂質(zhì)雙層的作為熒光示蹤劑的nt-fitc的脂質(zhì)體評估fg115接枝脂質(zhì)體的內(nèi)化。簡單地說，在具有0.25％3ntadtda和熒光示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc(0.2％)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。脂質(zhì)骨架為dopc(67.05％)、dopg(30％)和dspe-peg750(2.5％)。還制備了具有nt-fitc而沒有β-bodipy500/510c12-hpc的類似的脂質(zhì)體。用fg115蛋白質(zhì)接枝脂質(zhì)體以產(chǎn)生下表5和6所示脂質(zhì)體制劑。

表5

表6

將20μl脂質(zhì)體添加至來自兩個供體(供體3或供體2)之一的50,000個modc，其中細(xì)胞預(yù)冷卻或保持在37℃，并將混合物在相關(guān)溫度下避光孵育20分鐘。然后用pbs或pbs/咪唑洗滌細(xì)胞-脂質(zhì)體混合物，并通過facs進(jìn)行分析。代表內(nèi)化脂質(zhì)體的mfi值在表7中示出。利用fg115接枝的nt-fitc脂質(zhì)體(表8)，證實(shí)了用fg115接枝的bodipy脂質(zhì)體觀察的增強(qiáng)的內(nèi)化(表7)。dms5000接枝脂質(zhì)體盡管以更高效率靶向modc，但是表現(xiàn)出比fg115接枝脂質(zhì)體低的內(nèi)化。

表7

表8

實(shí)施例9.人modc細(xì)胞對fg115混合脂質(zhì)體的內(nèi)化

通過將fg115與不含3ntadtda的脂質(zhì)體(即非螯合脂質(zhì)體)混合并且將這些脂質(zhì)體的內(nèi)化與fg115接枝脂質(zhì)體進(jìn)行比較來評估與脂質(zhì)體混合的fg115的效果。簡單地說，在具有0.25％3ntadtda和熒光示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc(0.2％)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。脂質(zhì)骨架為dopc(67.05％)、dopg(30％)和dspe-peg750(2.5％)。還制備不含3ntadtda的非螯合脂質(zhì)體。然后將螯合脂質(zhì)體和非螯合脂質(zhì)體與fg115蛋白質(zhì)混合以產(chǎn)生表9所示脂質(zhì)體制劑。

將脂質(zhì)體添加至預(yù)冷的modc或保持在37℃的modc(20μl脂質(zhì)體與50,000個細(xì)胞混合)，并將混合物在相關(guān)溫度下避光孵育20分鐘。然后用pbs或pbs/咪唑洗滌細(xì)胞-脂質(zhì)體混合物，并通過facs進(jìn)行分析。如表9所示mfi值證明的，與fg115混合的脂質(zhì)體的內(nèi)化不大于或僅稍微大于(根據(jù)fg115的濃度)未接枝(無fg115)脂質(zhì)體，表明脂質(zhì)體內(nèi)化的提高依賴于通過3ntadtda將fg115附接于脂質(zhì)體。

表9

實(shí)施例10.人modc對峰a或bfg115混合的脂質(zhì)體的內(nèi)化

評估來自峰a或峰b的fg115與脂質(zhì)體混合的效果。簡單地說，在具有0.25％3ntadtda和熒光示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc(0.2％)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。脂質(zhì)骨架為dopc(67.05％)、dopg(30％)和dspe-peg750(2.5％)。然后在存在或不存在niso4的情況下將脂質(zhì)體與來自峰a的fg115蛋白或來自峰b的fg115蛋白混合以分別產(chǎn)生表10所示接枝或混合的脂質(zhì)體。

將脂質(zhì)體添加至預(yù)冷的modc或保持在37℃的modc(20μl脂質(zhì)體與50,000個細(xì)胞混合)，并將混合物在相關(guān)溫度下避光孵育20分鐘。然后用pbs或pbs/咪唑洗滌細(xì)胞-脂質(zhì)體混合物，并通過facs進(jìn)行分析。如表10所示mfi值證明的，與峰a或峰bfg115混合的脂質(zhì)體表現(xiàn)出與未接枝脂質(zhì)體類似的在modc中的內(nèi)化，并且僅fg115接枝脂質(zhì)體表現(xiàn)出增強(qiáng)的內(nèi)化。

表10

實(shí)施例11.人modc對用fg115或fg115組分接枝的脂質(zhì)體的內(nèi)化

使用人modc，評估用嵌合fg115蛋白或fg115蛋白組分接枝的脂質(zhì)體的內(nèi)化。簡單地說，在具有0.25％3ntadtda和熒光示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc(0.2％)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。脂質(zhì)骨架為dopc(67.05％)、dopg(30％)和dspe-peg750(2.5％)。然后將總體積為50μl的脂質(zhì)體用fg115、組氨酸標(biāo)記的flic(flic-6his)、組氨酸標(biāo)記的gp120(gp120-6his)或flic-6his和gp120-6his蛋白接枝，以產(chǎn)生表11中所示脂質(zhì)體制劑。在大腸桿菌中產(chǎn)生flic-6his，并在sf9細(xì)胞中產(chǎn)生gp120-6his。

將脂質(zhì)體添加至保持在37℃的modc(20μl脂質(zhì)體與50,000個細(xì)胞混合)，并將混合物避光孵育20分鐘。然后用pbs或pbs/咪唑洗滌細(xì)胞-脂質(zhì)體混合物，并通過facs進(jìn)行分析。如通過mfi值(表11)所示，僅在用fg115嵌合蛋白接枝脂質(zhì)體時，才看到改善的脂質(zhì)體內(nèi)化，而當(dāng)脂質(zhì)體用flic或gp120或兩者接枝時，沒有改善的內(nèi)化。

表11

實(shí)施例12.cd11c⁺細(xì)胞對用fg115或fg115組分接枝的脂質(zhì)體的內(nèi)化

使用來自野生型小鼠或dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠的cd11c⁺細(xì)胞評估用嵌合fg115蛋白或fg115蛋白的組分接枝的脂質(zhì)體的內(nèi)化。簡單地說，在具有0.25％3ntadtda和熒光示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc(0.2％)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。脂質(zhì)骨架為dopc(67.05％)、dopg(30％)和dspe-peg750(2.5％)。然后用fg115、flic-6his、gp120-6his、或者flic-6his和gp120-6hi接枝脂質(zhì)體以產(chǎn)生表12所示脂質(zhì)體制劑。在大腸桿菌中產(chǎn)生flic，并在sf9細(xì)胞中產(chǎn)生gp120。

表12

將脂質(zhì)體添加至從野生型或dc-sign轉(zhuǎn)基因c57/b16小鼠的脾制備的cd11c⁺細(xì)胞。將細(xì)胞保持在37℃，并將20μl脂質(zhì)體與50,000個細(xì)胞混合。然后將混合物避光孵育20分鐘。然后用pbs或pbs/咪唑洗滌細(xì)胞-脂質(zhì)體混合物，并通過facs進(jìn)行分析。僅當(dāng)使用dc-sign轉(zhuǎn)基因cd11c⁺細(xì)胞時，fg115接枝脂質(zhì)體的改善的內(nèi)化才明顯，而使用不展示人dc-sign的野生型小鼠細(xì)胞時未見(表13)。其他蛋白質(zhì)(flic和gp120)的接枝沒有相同的增強(qiáng)的內(nèi)化效果。

表13

實(shí)施例13.tlr5受體的活化

使用hek-blue^tmmtlr5細(xì)胞系(invitrogen)確認(rèn)fg115活化tlr5。hek-blue^tmmtlr5細(xì)胞是在與5個nf-κb和ap-1結(jié)合位點(diǎn)融合的il-12p40最小啟動子的控制下穩(wěn)定表達(dá)seap(分泌型胚胎堿性磷酸酶)報道基因的hek293細(xì)胞。用tlr5配體刺激活化nf-κb和ap-1，其誘導(dǎo)seap的產(chǎn)生。通過hek-blue^tm檢測介質(zhì)的顏色變化來使tlr活化可視化。使用不同批次的fg115證實(shí)fg115接枝脂質(zhì)體的tlr5活化(數(shù)據(jù)未示出)。使用flic接枝脂質(zhì)體和鞭毛蛋白的商業(yè)制劑(biofarma)以及與eah(由兩種tb抗原的融合物組成的重組蛋白)和fg115或flic共接枝脂質(zhì)體也觀察到tlr5活化。使用未接枝脂質(zhì)體、單獨(dú)eah接枝的脂質(zhì)體或pam2csk4(tlr2激動劑)未觀察到tlr5活化。

實(shí)施例14.用不同批次的fg115接枝并使用不同的脂質(zhì)體骨架的脂質(zhì)體的內(nèi)化

評估不同批次的fg115(批次05/2014和批次07/2014)以及使用不同的脂質(zhì)體骨架之間的一致性。簡單地說，在具有0.1％3ntadtda和熒光示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc(0.2％)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。第一個脂質(zhì)骨架為dopc(67.2％)、dopg(30％)和dspe-peg750(2.5％)(簡稱“dopc/dopg”)，并且第二種脂質(zhì)骨架為dopc(97.4％)和dspe-peg750(2.5％)(簡稱“dopc”)。此外，制備攜帶內(nèi)部熒光肽貨物(nt-fitc)而不是脂質(zhì)雙層示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc的dopc/dopg脂質(zhì)體(與bodipy脂質(zhì)體相比，這些脂質(zhì)體中dopc的百分比提高了2％)。用總體積為50μl的fg115蛋白質(zhì)來接枝脂質(zhì)體以產(chǎn)生表14所示制劑(5mm總脂質(zhì))。

將脂質(zhì)體添加至保持在37℃的modc(20μl脂質(zhì)體與50,000個細(xì)胞混合)，并將混合物在相關(guān)溫度下避光孵育20分鐘。然后用pbs或pbs/咪唑洗滌細(xì)胞-脂質(zhì)體混合物，并通過facs進(jìn)行分析。如表14所示，利用兩種脂質(zhì)體類型，觀察到通過fg115接枝體改善的內(nèi)化，與未接枝脂質(zhì)體相比，用fg115接枝的兩種類型的脂質(zhì)體骨架的內(nèi)化提高約5倍。此外，不同批次的fg115提供了內(nèi)化的可比較的增強(qiáng)。

表14

實(shí)施例15.人modc細(xì)胞對fg115接枝的dopc/dopg和popc/dope脂質(zhì)體的內(nèi)化

進(jìn)行研究以測試用兩種不同的脂質(zhì)體骨架dopc/dopg和popc/dopg制備的nt-fitc脂質(zhì)體的內(nèi)化，其各自含有0.05％或0.25％的3ntadtda、30％的dopg和余量百分比的dopc或popc。簡單地說，在具有0.05％或0.25％3ntadtda和內(nèi)部熒光肽nt-fitc(以1mg/ml進(jìn)行nt-fitc包封)的48mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。用f115蛋白以100μl的總體積來接枝脂質(zhì)體以產(chǎn)生表15中所示脂質(zhì)體制劑，最終總脂質(zhì)含量為5mm。

將脂質(zhì)體添加至保持在37℃的modc(20μl脂質(zhì)體與50,000個細(xì)胞混合)，并將混合物避光孵育60分鐘。然后用pbs或pbs/咪唑洗滌細(xì)胞-脂質(zhì)體混合物，并通過facs進(jìn)行分析。表15中所示mfi值表明，對于通過使用dopc/dopg骨架制備的脂質(zhì)體，通過fg115接枝的脂質(zhì)體內(nèi)化的增強(qiáng)比popc/dopg骨架更顯著，表明脂質(zhì)體組成可影響內(nèi)化。表15中所示結(jié)果還表明，與具有0.25％3ntadtda的fg115接枝脂質(zhì)體觀察到的相比，具有0.05％的較低3ntadtda含量的脂質(zhì)體上fg115的接枝降低了內(nèi)化的增強(qiáng)。因此，脂質(zhì)體骨架和3ntadtda含量兩者都可以影響脂質(zhì)體向modc中內(nèi)化增強(qiáng)的程度。

表15

實(shí)施例16.人modc細(xì)胞對fg115接枝的dopc/dopg和popc/dope脂質(zhì)體的內(nèi)化

進(jìn)行另一項(xiàng)研究來測試用不同脂質(zhì)體骨架制備的nt-fitc脂質(zhì)體的內(nèi)化：dopc/dopg(″dopc/pg″)；popc/dopg(″popc/pg″)；popc；dopc；dopc/dope；dopc/dotap；dopc/dops和dopc/mpla。簡單地說，在具有0.25％3ntadtda和內(nèi)部熒光肽nt-fitc(以1mg/ml進(jìn)行nt-fitc包封)的48mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。用25或80μg/mlf115蛋白來接枝脂質(zhì)體以產(chǎn)生表16中所述的脂質(zhì)體制劑。

表16

將脂質(zhì)體添加至保持在37℃的來自兩個供體(供體1或2)之一的modc(20μl脂質(zhì)體與50,000個細(xì)胞混合)，并將混合物避光孵育60分鐘。然后用pbs或pbs/咪唑洗滌細(xì)胞-脂質(zhì)體混合物，并通過facs進(jìn)行分析。與上述結(jié)果一致，fg115接枝增強(qiáng)脂質(zhì)體內(nèi)化(數(shù)據(jù)未示出)。該研究的結(jié)果也表明，利用dopc制備的脂質(zhì)體，通過fg115接枝增強(qiáng)脂質(zhì)體內(nèi)化趨于更顯著。

實(shí)施例17.甘露聚糖對fg115接枝脂質(zhì)體的結(jié)合的抑制

制備脂質(zhì)體制劑以測試酵母衍生多糖甘露聚糖(sigmaaldrich)對fg115接枝脂質(zhì)體與體外人modc細(xì)胞的結(jié)合的影響。簡單地說，在具有0.25％3ntadtda和熒光示蹤劑β-bodipy500/510c12-hpc(0.2％)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。脂質(zhì)骨架為dopc(67.05％)、dopg(30％)和dspe-peg750(2.5％)。用fg115或dms5000以25μg/ml的最終濃度和5mm的最終脂質(zhì)含量來接枝脂質(zhì)體。還制備未接枝脂質(zhì)體。用10mg/ml的甘露聚糖預(yù)孵育modc，之后添加脂質(zhì)體(20μl脂質(zhì)體與50,000個細(xì)胞混合)并且將混合物在4℃下避光孵育60分鐘。然后通過fac分析脂質(zhì)體與modc的結(jié)合，并定量mfi值。甘露聚糖對fg115接枝脂質(zhì)體與modc的結(jié)合的抑制(mfi從未處理細(xì)胞中的52.4降低至甘露聚糖處理的細(xì)胞中的18)表明，fg115接枝脂質(zhì)體通過多肽骨架上的糖與modc結(jié)合。使用dms5000接枝脂質(zhì)體觀察到了類似的結(jié)合的抑制(mfi從未處理的細(xì)胞中的787降低到在甘露聚糖處理的細(xì)胞中的517)，但是在未接枝脂質(zhì)體中未觀察到(mfi從未處理的細(xì)胞中的19.8降低到在甘露聚糖處理的細(xì)胞中的17.7中)。

實(shí)施例18.甘露聚糖對具有不同量的3ntadtda的fg115接枝脂質(zhì)體的內(nèi)化的抑制

評估了不同量的3ntadtda對甘露聚糖抑制內(nèi)化的影響。簡單地說，在具有dopc/dopg/dspe-peg750骨架和0.05％或0.25％3ntadtda(即，2.5％dspe-peg750、30％dopg和67.05％或67.25％dopc或popc)的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。用內(nèi)部熒光肽nt-fitc制備脂質(zhì)體，以2mg/ml進(jìn)行包封。用fg115接枝脂質(zhì)體以產(chǎn)生表17所示制劑(最終體積為100μl，最終總脂質(zhì)含量為5mm)。

用10mg/ml的甘露聚糖預(yù)孵育modc，之后添加接枝脂質(zhì)體(20μl脂質(zhì)體與50,000個細(xì)胞混合)并且將混合物在4℃下避光孵育60分鐘。然后用pbs或pbs/咪唑洗滌細(xì)胞-脂質(zhì)體混合物，并通過facs進(jìn)行分析。定量mfi值，結(jié)果在表17中示出。甘露聚糖對具有0.05％3ntadtda的fg115接枝脂質(zhì)體的內(nèi)化的抑制程度大于對于具有0.25％3ntadtda的fg115接枝脂質(zhì)體觀察到的程度，進(jìn)一步證明了fg115接枝脂質(zhì)體通過多肽骨架上的糖與modc結(jié)合。

表17

實(shí)施例19.dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠中使用fg115接枝脂質(zhì)體的mhci類復(fù)合物對siinfekl肽的交叉呈遞

使用fg115接枝脂質(zhì)體評估包封的siinfekl肽的交叉呈遞。簡單地說，在具有由dopc/dopg/dspe-peg750(67.25％dopc、30％dopg和2.5％dspe-peg750)組成的骨架的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。包含0.25％的3ntadtda。制備攜帶“高”或“低”siinfekl貨物的脂質(zhì)體。通過將脂質(zhì)體(24mm)用0.5mg/mlsiinfekl再水化制備“高”siinfekl脂質(zhì)體，且通過將相同脂質(zhì)用0.050mg/mlsiinfekl再水化制備“低”siinfekl脂質(zhì)體。將所有脂質(zhì)體通過0.2μm膜擠出，并通過透析(300kdamwco)除去未包封的siinfekl。這導(dǎo)致脂質(zhì)體的siinfekl含量具有約4倍的差異(表18)。然后將這些脂質(zhì)體用總體積為50μl的fg115接枝，產(chǎn)生表19所示脂質(zhì)體制劑，其最終脂質(zhì)含量為5mm。

表18

使用抗cd11c微珠通過磁性macs分離(miltenybiotec)從小鼠c57/b16dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠(上圖)或野生型c57b1/6小鼠(下圖)制備cd11c⁺細(xì)胞。將細(xì)胞用表19中所列siinfekl脂質(zhì)體脈沖(20分鐘)或共培養(yǎng)(16小時)。通過用mab25-d1.16(ebioscience)染色來評估siinfekl呈遞，所述mab25-d1.16與同mhci類h-2kb結(jié)合的來自于卵清蛋白的肽siinfekl反應(yīng)，但是不與未結(jié)合的h-2kb或同與不相關(guān)肽結(jié)合的h-2kb反應(yīng)。然后通過facs分析細(xì)胞。通過比較mfi值來評估脂質(zhì)體骨架和fg115接枝對siinfekl交叉呈遞的影響(表19)。用fg115接枝的脂質(zhì)體能夠改善siinfekl肽的交叉呈遞。當(dāng)用80μg/ml的fg115含量來接枝脂質(zhì)體時，利用野生型和dc-sign轉(zhuǎn)基因細(xì)胞觀察到改善的交叉呈遞。

表19

實(shí)施例20.脂質(zhì)體骨架對野生型小鼠中使用fg115接枝脂質(zhì)體的siinfekl交叉呈遞的影響

使用具有不同脂質(zhì)體骨架的fg115接枝脂質(zhì)體來評估包封的siinfekl肽的交叉呈遞。簡單地說，在具有包封的siinfekl肽具有表18中所示脂質(zhì)體骨架的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。包含0.05％3ntadtda。通過將脂質(zhì)體(24mm)用0.5mg/mlsiinfekl再水化制備具有“高”siinfekl貨物的脂質(zhì)體。將所有脂質(zhì)體通過0.2μm膜擠出，并通過透析(300kdamwco)除去未包封的siinfekl。這導(dǎo)致脂質(zhì)體的siinfekl含量約4倍的差異(表20)。在100μl中用25μg/mlfg115或20μg/mlflic來接枝脂質(zhì)體以產(chǎn)生表21中所示用于測試的質(zhì)體制劑(各自的最終總脂質(zhì)含量為5mm)。

表20

使用抗cd11c微珠通過磁性macs分離(miltenybiotec)從小鼠c57/b16野生型小鼠制備cd11c⁺細(xì)胞。然后將細(xì)胞用脂質(zhì)體脈沖20分鐘，通過用mab25-d1.16染色并通過facs分析來評估siinfekl呈遞。通過比較mfi值來評估脂質(zhì)體骨架和fg115接枝對siinfekl交叉呈遞的影響(表21)。當(dāng)用上述實(shí)施例19中的80μg/ml的fg115含量來接枝脂質(zhì)體時，用野生型和dc-sign轉(zhuǎn)基因細(xì)胞觀察到的改善的交叉呈遞，當(dāng)用25μg/ml的較低劑量來接枝脂質(zhì)體時，在野生型細(xì)胞中一般未觀察到。

表21

實(shí)施例21.fg115接枝脂質(zhì)體在體外誘導(dǎo)cb8⁺t細(xì)胞應(yīng)答的能力

使用負(fù)載卵清蛋白的脂質(zhì)體評估fg115接枝脂質(zhì)體在體外誘導(dǎo)cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答的能力。簡單地說，在具有67.25％dopc、30％dopg和2.5％dspe-peg750骨架并具有0.25％3ntadtda的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生具有包封卵清蛋白(ova)的螯合脂質(zhì)體。通過將脂質(zhì)體用1.5mg/mlova再水化制備負(fù)載有ova的脂質(zhì)體(lipova)，然后將脂質(zhì)體通過0.2μm膜擠出并透析(300kdamwco)。所得lipova制劑含有29.7mm脂質(zhì)和476μg/mlova。當(dāng)將lipova制劑稀釋至215μg/mlova時，ova：脂質(zhì)比為19.85μgova/mg脂質(zhì)。然后將該稀釋的lipova制劑用于用100μg/mlfg115接枝以產(chǎn)生總脂質(zhì)含量為13mm的lipova-fg115脂質(zhì)體，或用74μg/ml對照分子(his標(biāo)記的對照結(jié)構(gòu)域抗體；domantisltd)接枝以產(chǎn)生總脂質(zhì)含量為13mm的lipova-對照脂質(zhì)體。

使用抗cd11c微珠通過磁性macs分離(miltenybiotec)從小鼠c57/b16dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠制備cd11c⁺細(xì)胞。然后將cd11c⁺細(xì)胞以1.2×10⁶細(xì)胞/ml的密度和5次重復(fù)在u底的96孔板的孔中用脂質(zhì)體制劑在37℃培養(yǎng)18小時(每個孔為10μg/ml的最終ova)。然后收獲細(xì)胞并用于刺激ova特異性cd8⁺t細(xì)胞(ot-1細(xì)胞)，其通過使用附接于微珠(miltenybiotec)的抗b220/抗ter119抗體通過磁性mac分離(miltenybiotec)從ot-itcr轉(zhuǎn)基因小鼠中陰性選擇來純化。將ot-it細(xì)胞與cd11c⁺樹突細(xì)胞以約5-20∶1的比例在u底96孔板的孔中在37℃下培養(yǎng)18小時。然后通過使用抗體和流式細(xì)胞術(shù)確定通過cd69和cd44上調(diào)的cd8⁺t細(xì)胞活化(即利用cd69hicd44hicd8t細(xì)胞群作為t細(xì)胞活化的指標(biāo))來評估脂質(zhì)體免疫原性。本研究中還包括單獨(dú)t細(xì)胞，或用鹽水或ova孵育的t細(xì)胞的對照。與對照分子接枝的脂質(zhì)體相比，dopc/dopg脂質(zhì)體表面上接枝fg115使cd8⁺t細(xì)胞的活化提高幾乎3倍(數(shù)據(jù)未示出)。

實(shí)施例22.fg115接枝和fg115混合的脂質(zhì)體誘導(dǎo)cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答的能力

在另外的研究中驗(yàn)證fg115接枝脂質(zhì)體誘導(dǎo)cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答的能力。簡單地說，在具有67.25％dopc、30％dopg和2.5％dspe-peg750的骨架并具有0.25％3ntadtda的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體，并用1.5mg/mlova再水化。然后將lipova脂質(zhì)體用100μg/mlfg115接枝，使最終脂質(zhì)含量為7.48mm和215μg/mlova，或留著未接枝。

使用抗cd11c微珠通過磁性macs分離(miltenybiotec)從小鼠c57/b16dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠制備cd11c⁺細(xì)胞。然后將cd11c⁺細(xì)胞以1.2×10⁶細(xì)胞/ml的密度和5次重復(fù)在u底的96孔板的孔中用脂質(zhì)體制劑在37℃培養(yǎng)18小時。然后收獲細(xì)胞并用于刺激ova特異性cd8⁺t細(xì)胞(ot-1細(xì)胞)，其通過使用附接于微珠(miltenybiotec)的抗b220/抗ter119抗體通過磁性mac分離(miltenybiotec)從ot-itcr轉(zhuǎn)基因小鼠中陰性選擇來純化。將ot-it細(xì)胞與cd11c⁺樹突細(xì)胞以約5-20∶1的比例在u底96孔板的孔中在37℃下培養(yǎng)18小時。然后通過使用抗體和流式細(xì)胞術(shù)確定通過cd69和cd44上調(diào)的cd8⁺t細(xì)胞活化，即利用cd69hicd44hicd8t細(xì)胞群作為t細(xì)胞活化的指標(biāo)，來評估脂質(zhì)體免疫原性。本研究中還包括單獨(dú)t細(xì)胞，或用cd11c⁺和鹽水、fg115、voa或ova+fg115孵育的t細(xì)胞的對照。脂質(zhì)體的fg115接枝與未接枝脂質(zhì)體相比(使用fg115接枝脂質(zhì)體的約55％的活化ot-icd8t細(xì)胞相比于使用未接枝脂質(zhì)體的約35％)以及與可溶性ova+fg115(約30％的活化ot-icd8t細(xì)胞)相比改善了cd8⁺t細(xì)胞的活化。如預(yù)期的，用陰性對照觀察到可忽略的cd8+t細(xì)胞活化。

實(shí)施例23.fg115接枝和fg115混合的脂質(zhì)體誘導(dǎo)cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答的能力

評估了用高濃度和低濃度的fg115接枝或與fg115混合的脂質(zhì)體誘導(dǎo)cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答的能力。簡單地說，在具有67.25％dopc、30％dopg和2.5％dspe-peg750的骨架并具有0.25％3ntadtda的24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體，并且用1.5mg/mlova再水化。然后將lipova脂質(zhì)體用5或50μg/mlfg115接枝，使最終脂質(zhì)含量為10mm和215μg/mlova，或留著未接枝。還通過在不存在niso4下將lipova脂質(zhì)體與fg115混合來制備與fg115混合的lipova脂質(zhì)體。

使用抗cd11c微珠通過磁性macs分離(miltenybiotec)從小鼠c57/b16dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠制備cd11c⁺細(xì)胞。然后將cd11c⁺細(xì)胞以1.2×10⁶細(xì)胞/ml的密度和5次重復(fù)在u底的96孔板的孔中用脂質(zhì)體制劑在37℃培養(yǎng)18小時(每個孔為10μg/ml的最終ova)。然后收獲細(xì)胞并用于刺激ova特異性cd8⁺t細(xì)胞(ot-1細(xì)胞)，其通過使用附接于微珠(miltenybiotec)的抗b220/抗ter119抗體通過磁性mac分離(miltenybiotec)從ot-itcr轉(zhuǎn)基因小鼠中陰性選擇來純化。將ot-it細(xì)胞與cd11c⁺樹突細(xì)胞以約5-20∶1的比例在u底96孔板的孔中在37℃下培養(yǎng)18小時。然后通過測量作為t細(xì)胞活化的指標(biāo)的cd69hicd44hicd8t細(xì)胞群來評估脂質(zhì)體免疫原性。本研究中還包括單獨(dú)t細(xì)胞，或用cd11c⁺和鹽水、fg115、voa或ova+fg115培養(yǎng)的t細(xì)胞的對照。

與未接枝的脂質(zhì)體相比以及與可溶性ova+fg115相比，脂質(zhì)體的fg115接枝提高了cd8⁺t細(xì)胞的活化，與實(shí)施例22的結(jié)果相一致。還觀察到與可溶性ova+fg115或未接枝的脂質(zhì)體相比，fg115與脂質(zhì)體的混合提高了cd8⁺t細(xì)胞活化(數(shù)據(jù)未示出)。

實(shí)施例24.包封的ova水平對fg115接枝脂質(zhì)體誘導(dǎo)cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答的能力的影響

評估了包封的ova水平對fg115接枝脂質(zhì)體誘導(dǎo)cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答能力的影響。簡單地說，產(chǎn)生具有高水平ova(lipova(高)：436μg/mlova)或低高水平ova(lipova(低)：129μg/mlova)的螯合脂質(zhì)體(表22和23)。然后在13mm的總脂質(zhì)下用fg115、gp120或flic來接枝脂質(zhì)體，或者留著未接枝，以產(chǎn)生表24中的脂質(zhì)制劑。

表22

表23

表24

使用抗cd11c微珠通過磁性macs分離(miltenybiotec)從小鼠c57/b16dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠制備cd11c⁺細(xì)胞。然后將cd11c⁺細(xì)胞以1.2×10⁶細(xì)胞/ml的密度和5次重復(fù)在u底的96孔板的孔中用脂質(zhì)體制劑在37℃培養(yǎng)18小時(每個孔為10μg/ml的最終ova)。然后收獲細(xì)胞并用于刺激ova特異性cd8⁺t細(xì)胞(ot-1細(xì)胞)，其通過使用附接于微珠(miltenybiotec)的抗b220/抗ter119抗體通過磁性mac分離(miltenybiotec)從ot-itcr轉(zhuǎn)基因小鼠中陰性選擇來純化。將ot-it細(xì)胞與cd11c⁺樹突細(xì)胞以約5-20：1的比例在u底96孔板的孔中在37℃下培養(yǎng)18小時。然后通過測量作為t細(xì)胞活化的指標(biāo)的cd69hicd44hicd8t細(xì)胞群來評估脂質(zhì)體免疫原性。本研究中還包括單獨(dú)t細(xì)胞，或用cd11c⁺和鹽水或ova培養(yǎng)的t細(xì)胞，或者用野生型樹突細(xì)胞和鹽水或ova培養(yǎng)的t細(xì)胞的對照。如圖4所示，包封的ova的水平影響脂質(zhì)體誘導(dǎo)cd8活化的能力，lipova(高)脂質(zhì)體誘導(dǎo)更高水平的cd8⁺t細(xì)胞活化。

實(shí)施例25.不同脂質(zhì)體背景對fg115接枝脂質(zhì)體cd8⁺t細(xì)胞活化的影響。

制備具有多種骨架的負(fù)載ova的脂質(zhì)體以評估不同脂質(zhì)體背景對fg115接枝脂質(zhì)體活化cd8⁺t細(xì)胞的能力的影響。簡單地說，將具有0.25％3ntadtda和多種脂質(zhì)體骨架的螯合脂質(zhì)體用1.5mg/mlova再水化以產(chǎn)生表25所示負(fù)載ova的脂質(zhì)體。將所有脂質(zhì)體通過0.2μm膜擠出，并通過過夜透析(300kdamwco)除去未包封的ova。將lipova脂質(zhì)體用表26所示多種濃度的fg115和總脂質(zhì)來接枝。

表25

dopg、dope、dotap、dops、mpla和lipokel含有30％的總脂質(zhì)。dspe-peg750含有2.5％的總脂質(zhì)。

表26

從小鼠c57/b16野生型小鼠制備cd11c⁺細(xì)胞。將細(xì)胞用脂質(zhì)體培養(yǎng)過夜，如上所述評估cd11c⁺細(xì)胞對ot-1cd8t細(xì)胞的活化。如圖5所示，脂質(zhì)體骨架組成影響cd8⁺t細(xì)胞活化水平，用popc/dope、popc/dopg和dopc/dopg骨架觀察到最佳活化。

實(shí)施例26.fg115接枝脂質(zhì)體在體內(nèi)誘導(dǎo)cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答的能力

評估了fg115接枝脂質(zhì)體在體內(nèi)誘導(dǎo)cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答的能力。在24mm總脂質(zhì)下產(chǎn)生螯合脂質(zhì)體。簡單來說，如上所述，用ova和具有0.25％3ntadtda的67.25％dopc、30％dopg和2.5％dpse-peg750的骨架制備脂質(zhì)體(表27)。將lipova脂質(zhì)體用17.38mm總脂質(zhì)下的100μg/mlfg115接枝，最終ova濃度為500μg/ml。用表28中的lipova-fg115或未接枝的lipova脂質(zhì)體制劑對小鼠免疫接種。

表27

表28

通過使用附接于微珠(miltenybiotec)的抗b220/抗ter119抗體通過磁性macs分離(miltenybiotec)從ot-itcr轉(zhuǎn)基因小鼠中陰性選擇來純化ova特異性cd8⁺t細(xì)胞。細(xì)胞還用活體染料cfse標(biāo)記，以允許通過染料稀釋來評估細(xì)胞分裂。通過靜脈內(nèi)注射到側(cè)尾靜脈中來將cd8⁺t細(xì)胞(10⁶個細(xì)胞)過繼轉(zhuǎn)移到c57bl/6j宿主小鼠中。24小時后，利用肌內(nèi)注射鹽水的50μl推注中的多種脂質(zhì)體制劑通過每組5只小鼠的重復(fù)對宿主小鼠進(jìn)行免疫接種。6天后，使用來自cd45.1⁺c57bl/6j小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生熒光靶標(biāo)陣列(fluorescenttargetarray，fta)，并且包含用不同濃度的多種變體ovamhc-1結(jié)合肽脈沖的靶細(xì)胞。通過側(cè)尾靜脈將1-5×10⁶個fta細(xì)胞靜脈內(nèi)注射到宿主小鼠中。在宿主動物中18小時后，使用抗體和hoechst33258(以評估細(xì)胞存活力)標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)評估從處死的宿主小鼠中分離的脾細(xì)胞中fta細(xì)胞的死亡。使用以下公式評估fta細(xì)胞的特異性殺傷％，

另外，在用10μg/mlsiinfekl肽和golgistop(bdbioscience)體外培養(yǎng)6小時后，使用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(intracellularcytokinestaining，ics)以及抗體和流式細(xì)胞術(shù)在從處死的宿主小鼠分離的脾細(xì)胞中評估ifn-γcd8⁺t細(xì)胞％。

圖6所示結(jié)果表明fg115接枝脂質(zhì)體在體內(nèi)誘導(dǎo)cd8⁺t細(xì)胞的增殖(分裂通過cfse稀釋評估)。fg115接枝脂質(zhì)體誘導(dǎo)對ova肽siinfekl和相關(guān)肽n6(siinfnkl)、g4(siigfekl)和e1(eiinfekl)特異性的效應(yīng)t細(xì)胞的殺傷，但是對照肽np68不是這樣，但是在該蛋白質(zhì)貨物水平，未接枝脂質(zhì)體在誘導(dǎo)殺傷中非常有效(數(shù)據(jù)未示出)。

實(shí)施例27.fg115接枝脂質(zhì)體在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性t細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷的能力。

為了評估fg115接枝脂質(zhì)體在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性t細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷的能力，如上所述制備fg115接枝和未接枝的lipova脂質(zhì)體，并示于表29和30中。

表29

表30

在免疫接種前24小時將ot-1cd8t細(xì)胞轉(zhuǎn)移到小鼠中。用上述制劑以每只小鼠2.5μg對小鼠進(jìn)行免疫接種(肌內(nèi)每50μgl推注0.673mm脂質(zhì))。

通過使用附接于微珠(miltenybiotec)的抗b220/抗ter119抗體通過磁性mac分離(miltenybiotec)從ot-itcr轉(zhuǎn)基因小鼠中陰性選擇來純化ova特異性cd8⁺t細(xì)胞。通過i.v.注射到側(cè)尾靜脈中來將cd8⁺t細(xì)胞(10⁶個細(xì)胞)過繼轉(zhuǎn)移到c57bl/6j宿主小鼠中。24小時后，i.m.注射鹽水的50μl推注中的攜帶作為抗原的ova、危險信號和/或多種靶向基序的多種脂質(zhì)體制劑通過每組5只小鼠的重復(fù)對宿主小鼠進(jìn)行免疫接種。6天后，使用來自cd45.1⁺c57bl/6j小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生熒光靶標(biāo)陣列(fta)，并且包含用不同濃度的數(shù)種變體ovamhc-1結(jié)合肽脈沖的靶細(xì)胞；通過側(cè)尾靜脈將1-5×10⁶個fta細(xì)胞i.v.注射到宿主小鼠中。在宿主動物中18小時后，使用抗體和hoechst33258(以評估細(xì)胞存活力)標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)評估從處死的宿主小鼠中分離的脾細(xì)胞中fta細(xì)胞的死亡。如上所述評估fta細(xì)胞的特異性殺傷％。

觀察到fg115接枝脂質(zhì)體在體內(nèi)有效誘導(dǎo)抗原特異性t細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷(數(shù)據(jù)未示出)。

實(shí)施例28.在用fg115接枝的脂質(zhì)體免疫接種后，ova水平對體內(nèi)ova特異性殺傷的影響

制備具有不同水平的包封ova的lipova制劑以評估ova水平對體內(nèi)ova特異性殺傷的影響。簡單地說，制備如表31所示lipova脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體用fg115接枝或留著未接枝以產(chǎn)生表32所示制劑。

表31

表32

如上所述用脂質(zhì)體制劑對小鼠進(jìn)行免疫接種，并且評估靶標(biāo)特異性殺傷。接枝脂質(zhì)體能夠誘導(dǎo)改善的細(xì)胞增殖，特別是在1.19μgova的劑量下(圖7)。當(dāng)評估使用多種ova劑量的卵清蛋白肽siinfekl脈沖靶細(xì)胞(使用野生型小鼠的細(xì)胞)后的特異性殺傷時，當(dāng)包封在脂質(zhì)體中的卵清蛋白量降低時，觀察到與未接枝脂質(zhì)體相比，fg115接枝脂質(zhì)體的ova特異性殺傷的明顯提高(數(shù)據(jù)未示出)。當(dāng)向小鼠施用0.57μgova時，fg155接枝的優(yōu)點(diǎn)特別明顯，與用fg115接枝脂質(zhì)體觀察到的強(qiáng)抗原特異性殺傷相比，使用未接枝脂質(zhì)體觀察到的抗原特異性殺傷可忽略。

除野生型小鼠之外，還用表32中列出的fg115接枝的ova脂質(zhì)體制劑對dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠組進(jìn)行免疫接種。與在較低劑量(0.57μg劑量；數(shù)據(jù)未示出)下的野生型小鼠相比，在dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到了更高水平的抗原特異性殺傷(用卵清蛋白肽siinfekl以0.57或2μgova劑量脈沖靶細(xì)胞之后，使用來自dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠或野生型小鼠的cd11c⁺細(xì)胞)。在更高劑量下，dc-sign轉(zhuǎn)基因小鼠的這種提高的殺傷效果不明顯。這表明雖然dc-sign靶向可以增強(qiáng)fg115介導(dǎo)的應(yīng)答，但是在較低的抗原劑量下優(yōu)點(diǎn)最明顯。

實(shí)施例29.fg115接枝脂質(zhì)體引起的多克隆應(yīng)答

為了評估多克隆應(yīng)答，如上所述制備負(fù)載有voa并且用110μg/mlfg115或55μg/mlflic接枝的具有0.05％3ntadtda的67.25％popc、30％dopg和2.5％dspe-peg750的背景上的脂質(zhì)體，以產(chǎn)生具有130μg/mlova(22mm，劑量1)或300μg/ml(22mm劑量2)的lipova脂質(zhì)體。如上所述用脂質(zhì)體制劑免疫接種小鼠(c57/b16野生型小鼠)，并且評估靶標(biāo)特異性殺傷。還使用抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)基于用mhc-ii結(jié)合肽表位脈沖的fta(熒光靶標(biāo)陣列)b細(xì)胞上的cd69上調(diào)評估了輔助性t應(yīng)答。在處死之前，將小鼠通過其框后靜脈竇采血，并分離血清用于通過elisa測量循環(huán)細(xì)胞因子和抗原特異性ig。另外，在用10μg/ml抗原肽和golgistop(bdbioscience)體外培養(yǎng)6小時后，使用抗體和標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)使用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ics)評估從處死的宿主小鼠分離的脾細(xì)胞中的ifn-γcd8⁺t細(xì)胞％。

僅在接受了用fg115或flic接枝ova脂質(zhì)體的致敏和加強(qiáng)的動物中檢測到ova特異性殺傷(siin和n6肽)(圖8a)。當(dāng)用未接枝ova脂質(zhì)體對動物進(jìn)行免疫接種時，檢測到最小的殺傷。當(dāng)僅使用fg115接枝第一劑量時，觀察到最小的殺傷。當(dāng)用fg115或flic接枝的ova脂質(zhì)體對動物免疫接種時，檢測到提高數(shù)量的產(chǎn)生抗原特異性ifnγ的cd8⁺t細(xì)胞(圖8b)。另一方面，當(dāng)用flic接枝ova脂質(zhì)體時，產(chǎn)生抗原特異性ifnγ的cd4⁺t細(xì)胞的頻率最高。通過在體內(nèi)18小時后測量ftab細(xì)胞活化來評估體內(nèi)輔助性t應(yīng)答，指示能夠與抗原特異性b細(xì)胞同種相互作用的輔助性t細(xì)胞的產(chǎn)生。接受lipova-fg115/lipova-fg115、lipova-fg115/lipova-uneng和lipova-flic/lipova-flic疫苗方案的小鼠產(chǎn)生能夠活化ova-肽特異性b細(xì)胞應(yīng)答的輔助性cd4t細(xì)胞。然而，與其他疫苗相比，lipova-flic/lipova-flic總體產(chǎn)生顯著更好的輔助性cd4t應(yīng)答。通過測量各劑量響應(yīng)曲線下面積(auc)很好地總結(jié)這些趨勢，如圖8c中所示。

序列表

<110>利普泰克有限公司和澳大利亞國立大學(xué)

<120>嵌合蛋白

<130>35240593wjp/tku

<150>2014904028

<151>2015-10-09

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>509

<212>prt

<213>hiv

<400>1

metargvallysglulystyrglnhisleutrpargtrpglytrplys

151015

trpglythrmetleuleuglyileleumetilecysseralathrglu

202530

lysleutrpvalthrvaltyrtyrglyvalprovaltrplysgluala

354045

thrthrthrleuphecysalaseraspalalysalatyraspthrglu

505560

valhisasnvaltrpalathrhisalacysvalprothraspproasn

65707580

proglngluvalvalleugluasnvalthrgluasnpheasnmettrp

859095

lysasnasnmetvalgluglnmethisgluaspileileserleutrp

100105110

aspglnserleulysprocysvallysleuthrproleucysvalthr

115120125

leuasncysthraspleuargasnvalthrasnileasnasnserser

130135140

gluglymetargglygluilelysasncysserpheasnilethrthr

145150155160

serileargasplysvallyslysasptyralaleuphetyrargleu

165170175

aspvalvalproileaspasnaspasnthrsertyrargleuileasn

180185190

cysasnthrserthrilethrglnalacysprolysvalserpheglu

195200205

proileproilehistyrcysthrproalaglyphealaileleulys

210215220

cyslysasplyslyspheasnglythrglyprocyslysasnvalser

225230235240

thrvalglncysthrhisglyileargprovalvalserthrglnleu

245250255

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