本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了結(jié)合分子，特別是結(jié)合至a型和/或b型流感病毒的流感血球凝集素的單域抗體和多域抗體。優(yōu)選地，該結(jié)合分子還能夠中和a型和/或b型流感病毒。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼這些單域抗體和多域抗體的核酸分子，以及包括這些核酸分子的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由a型流感和/或b型流感病毒引起的感染的診斷、預(yù)防和/或治療。

背景技術(shù)：

季節(jié)性a型流感是一個(gè)重要的公共健康問題，每年在全球范圍內(nèi)危害超過250,000人，同時(shí)產(chǎn)生數(shù)百萬的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。大流行性流感在新的病毒出現(xiàn)時(shí)發(fā)生，并感染全球具有很少免疫力或沒有免疫力的人群，甚至對(duì)人類健康構(gòu)成更大的威脅；例如，1918年“西班牙流感”大流行造成了估計(jì)5千萬人死亡。持續(xù)關(guān)注的是高致病性禽流感(hpai)，其在感染的人群中已經(jīng)顯示了高于50％的死亡率。h5以及h7流感病毒在世界某些部分的家禽中流行。目前，這些病毒看起來不能從人與人之間輕易傳播，但針對(duì)禽類h5的最新數(shù)據(jù)表明僅有幾個(gè)氨基酸變化足以使這種病毒能夠在哺乳動(dòng)物體內(nèi)模型系統(tǒng)中通過氣溶膠傳播來擴(kuò)散。

迄今為止，對(duì)b型流感病毒的關(guān)注較少。這可能是由于-主要限于作為宿主的人類-b型流感病毒缺乏出現(xiàn)大流行性a型流感株的關(guān)鍵的大型動(dòng)物儲(chǔ)主。然而，每年流行病的累積影響超過大流行病的累積影響，并且盡管歸因于b型流感的發(fā)病率和死亡率低于例如h3n2病毒的發(fā)病率和死亡率，但是它們通常高于h1n1病毒的發(fā)病率和死亡率。

盡管疫苗是流感病毒感染控制的支柱，但是其及時(shí)的實(shí)施存在若干技術(shù)挑戰(zhàn)。這些包括(i)預(yù)測(cè)哪些病毒株將出現(xiàn)并感染人類群體，(ii)出現(xiàn)新的病毒株與臨床批準(zhǔn)的疫苗的可用性之間的滯后期，(iii)某些患者群體(例如年老的、非常年幼的或免疫受損的)的免疫原性差，以及(iv)世界范圍內(nèi)有限的生產(chǎn)能力。

抗病毒藥物，例如神經(jīng)氨酸酶抑制劑(奧司他韋和扎那米韋)和m2抑制劑(金剛烷胺和金剛烷乙胺)是針對(duì)季節(jié)性和大流行性流感的治療方案庫的重要補(bǔ)充。然而，如果在感染后期給予，這些藥物具有有限的效力，并且廣泛使用可能導(dǎo)致抗性病毒株的出現(xiàn)。此外，奧司他韋在成人中的使用與惡心、嘔吐、精神病學(xué)影響和腎臟事件等不良反應(yīng)有關(guān)。

抗體代表了最早的保護(hù)劑類型之一，并且在以前的流感大流行中成功地使用了來自恢復(fù)期患者的血清的被動(dòng)轉(zhuǎn)移。然而，這種方法具有用于在全球尺度上實(shí)施的有限潛力，因?yàn)?i)適當(dāng)?shù)难宓南拗乒?yīng)，(ii)高風(fēng)險(xiǎn)的毒性，(iii)高的批次間變化，(iv)不確定的劑量，以及(v)給予的困難。

重組單克隆抗體技術(shù)的進(jìn)展使得這一策略值得進(jìn)一步研究，而不是因?yàn)榭梢陨a(chǎn)和儲(chǔ)存無限量的保護(hù)性抗體以便在大流行性緊急情況下提供及時(shí)的保護(hù)。為了使其成為有效策略，需要這樣的抗體具有不同病毒亞型的中和活性。這呈現(xiàn)了一個(gè)重大的挑戰(zhàn)，因?yàn)榱鞲胁《镜牟《就鈿さ鞍?、特別是血球凝集素(ha)是不斷變化的。

血球凝集素或ha是一種三聚體糖蛋白，其被錨定到流感病毒外殼上并具有雙重功能：它負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞表面受體唾液酸的結(jié)合，并且在攝取之后它介導(dǎo)病毒與內(nèi)體膜的融合，導(dǎo)致病毒rna在該細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)中的釋放。ha包括一個(gè)大的且可變的頭部結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)較小的更保守的莖部結(jié)構(gòu)域。大多數(shù)針對(duì)ha的中和抗體識(shí)別在頭部區(qū)的超變區(qū)中的表位，并且因此干擾與宿主細(xì)胞的結(jié)合。然而最近，已經(jīng)鑒定出結(jié)合至ha莖部區(qū)，并且干擾膜融合的新的單克隆抗體(corti等人，2011；dreyfus等人，2012；ekiert等人，2009，ekiert等人，2011和ekiert等人，2012；kashyap等人，2010；krause等人，2012；lee等人，2012；sui等人，2009；tan等人，2012；throsby等人，2008；tsibane等人，2012；wang等人，2010；yoshida等人，2009)。

這些廣泛中和性抗體中的至少一些已經(jīng)顯示出前所未有的交叉反應(yīng)性的廣度，使得它們能夠中和流感病毒的亞型、系統(tǒng)發(fā)育組、或甚至不同組和亞型之間的許多不同流感株。這些抗體的治療和預(yù)防潛力已經(jīng)在小鼠和白鼬模型中得到證實(shí)，并且目前在人類臨床試驗(yàn)中正在對(duì)若干種抗體進(jìn)行評(píng)估。然而，這些單克隆抗體還可能具有某些固有的局限性，這對(duì)于它們?cè)诹鞲蓄A(yù)防和/或治療中的廣泛應(yīng)用是重大的挑戰(zhàn)。這些局限性可能包括(i)腸胃外給予的需要；(ii)高的商品成本；(iii)流行的流感株的不完全覆蓋；(iv)在感染部位的低生物利用度；以及(v)出現(xiàn)抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)。

單域抗體(sdab)是由單個(gè)抗原結(jié)合的可變結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段。這些片段比常規(guī)的單克隆抗體具有若干優(yōu)勢(shì)，這些優(yōu)勢(shì)包括：(i)尺寸小(15kda)，(ii)低成本微生物生產(chǎn)，(iii)簡(jiǎn)單工程化為多特異性形式，(iv)具有支持不可注射的給予途徑的潛力的高穩(wěn)定性，和/或(iv)進(jìn)入隱蔽或隱藏的表位的潛力。這些有利的特性使得sdab成為單克隆抗體的具有吸引力的替代物，特別是在感染性疾病的領(lǐng)域中。對(duì)抗若干種不同病毒的中和sdab已經(jīng)在文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述，這些病毒包括hiv、乙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病毒、fmdv、脊髓灰質(zhì)炎病毒、以及輪狀病毒(vanlandschoot等人，2011)。

能夠中和流感的ha結(jié)合sdab也已經(jīng)在文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述。因此，hultberg等人(2011)鑒定了對(duì)抗多種h5n1病毒的具有中和活性的sdab(infl-c8)。infl-c8二聚體和三聚體顯示了對(duì)抗h5n1病毒的改進(jìn)的和拓寬的活性。然而，沒有觀察到pr8(h1n1)或x47(h3n2)流感病毒的交叉中和。

wo2009/147248披露了在elisa中顯示異源亞型結(jié)合活性的若干種sdab。然而，除了一種sdab之外，這些sdab中沒有一種在病毒中和測(cè)定法中是有活性的。中和sdab的這一種，被稱為iv146，在elisa中顯示出系統(tǒng)發(fā)育組1限制性結(jié)合，并能夠中和2種不同的h5病毒。

tillib等人(2013)描述了對(duì)抗h5n2株a/野鴨(mallardduck)/賓夕法尼亞州/10218/84具有在體外和體內(nèi)中和活性的多種sdab。

hufton等人(2014)鑒定了對(duì)抗h1、h2、h5和/或h9病毒具有交叉亞型中和活性的若干種sdab。然而，這些sdab均不能中和h7n2。這些sdab中一者的二聚化改進(jìn)了其對(duì)h1、h2、h5和h9的活性，但不導(dǎo)致h7n2或h3n2病毒的組間交叉中和。

迄今為止，鑒定出的單體或多聚體sdab均不能中和所有相關(guān)的季節(jié)性(h1n1、h3n2和b)和大流行性(例如，h5n1和h7n9)流感株。鑒于由a型流感和b型流感病毒引起的呼吸系統(tǒng)疾病的嚴(yán)重程度、和季節(jié)性流行病的高的經(jīng)濟(jì)影響、以及針對(duì)大流行病的持續(xù)風(fēng)險(xiǎn)，存在對(duì)抗a型和b型流感病毒具有廣泛活性并且可以作為用于預(yù)防或治療流感感染的藥物使用的新型有效的抑制劑的持續(xù)需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了如下新穎的單域抗體(sdab)：這些新穎的單域抗體能夠特異性結(jié)合至少兩種a型流感病毒株的血球凝集素(ha)，所述至少兩種流感病毒株包括來自系統(tǒng)發(fā)育組2的兩種不同亞型的ha；或能夠特異性結(jié)合來自系統(tǒng)發(fā)育組1的至少一種a型流感株和來自系統(tǒng)發(fā)育組2的至少一種a型流感病毒株；或能夠特異性結(jié)合至少一種b型流感病毒株的血球凝集素(ha)。在某些實(shí)施例中，這些sdab還能夠中和至少兩種來自系統(tǒng)發(fā)育組2的、包括兩種ha不同亞型的、不同的a型流感病毒株；或至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組1的a型流感病毒株和至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組的a型流感病毒株；或至少一種b型流感病毒株。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了所謂的多域抗體，即包括如在此所述的至少兩個(gè)，優(yōu)選地至少三個(gè)，更優(yōu)選地至少四個(gè)，或甚至更優(yōu)選地至少五個(gè)單域抗體的結(jié)合分子。在某些實(shí)施例中，這些多域抗體能夠中和至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組1的a型流感病毒株和至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組2的a型流感病毒株。在某些實(shí)施例中，這些多域抗體能夠中和至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組1的a型流感病毒株和至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組2的a型流感病毒株，以及至少一種b型流感病毒株，優(yōu)選地至少一種來自b/山形(yamagata)譜系的b型流感病毒株和至少一種來自b/維多利亞(victoria)譜系的流感病毒株。在某些實(shí)施例中，這些多域抗體能夠中和含有h1亞型的ha的流感病毒(例如，h1n1流感病毒株)、含有h3亞型的ha的流感病毒(例如，h3n2流感病毒株)、含有h5亞型的ha的流感病毒(例如，h5n1流感病毒株)、和含有h7亞型的ha的流感病毒(例如，h7n9流感病毒株)，以及至少一種b型流感病毒，優(yōu)選地至少一種來自b/山形譜系的b型流感病毒株和至少一種來自b/維多利亞譜系的流感病毒株。

此外，本發(fā)明提供了編碼這些sdab或多域抗體的核酸分子，以及含有所述核酸分子的載體和宿主細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了包含如在此所述的一種或多種sdab、多域抗體、核酸分子和/或載體的(藥物)組合物。

根據(jù)本發(fā)明，提供了新穎的流感血球凝集素結(jié)合分子。這些結(jié)合分子可以是單域抗體或多域抗體。本發(fā)明的至少一些結(jié)合分子是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈冊(cè)谙到y(tǒng)發(fā)育組之間是交叉中和的，即能夠結(jié)合并且中和至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組1的a型流感病毒株和至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組2的a型流感病毒株。在某些實(shí)施例中，這些結(jié)合分子能夠特異性結(jié)合并且中和至少一種b型流感病毒株，優(yōu)選地至少一種來自b/山形譜系的b型流感病毒株和至少一種來自b/維多利亞譜系的流感病毒株。本發(fā)明的結(jié)合分子和核酸序列適合于用作流感感染(甚至不考慮致病流感亞型)的診斷劑、預(yù)防劑和/或治療劑。

附圖說明

圖1顯示了通過elisa對(duì)在美洲駝#3和#4中免疫應(yīng)答的分析。

圖2顯示了sd1016、sd1038和sd1045針對(duì)用a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用0.5mg/kgsdab處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖3顯示了sd1036、sd1046和sd1048針對(duì)用a/香港/1/1968-ma(h3n2)病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用5mg/kg或0.5mg/kgsdab處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖4顯示了sd1083和sd1084針對(duì)用b/佛羅里達(dá)/4/2006病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用5mg/kg或0.5mg/kgsdab處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖5顯示了sd1038、md1211、md1212、或者sd1038和sd1036的1:1混合物針對(duì)用a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用單域或多域抗體處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖6顯示了sd1036、md1211、md1212、或者sd1036和sd1038的1:1混合物針對(duì)用a/香港/1/1968-ma(h3n2)病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用單域或多域抗體處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖7顯示了sd1038和md1212針對(duì)用a/香港/1/1968-ma(h3n2)病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用5mg/kg、1.7mg/kg、0.6mg/kg或0.2mg/kg單域或多域抗體處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖8顯示了md1221、md1222和md1224針對(duì)用b/佛羅里達(dá)/4/2006病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用5mg/kg或0.5mg/kg多域抗體處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖9顯示了md1301、md2601和cr9114針對(duì)用a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用3mg/kg(多域)抗體處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖10顯示了md1301、md2601和cr9114針對(duì)用a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用0.2mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg(多域)抗體處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖11顯示了md2617針對(duì)用a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用md2617鼻內(nèi)(頂部)或靜脈內(nèi)(底部)處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖12顯示了md2617和cr9114針對(duì)用b/佛羅里達(dá)/4/2006(頂部)或a/香港/1/1968-ma(底部)病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用(多域)抗體鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖13顯示了md2407、md3606和cr9114針對(duì)用b/佛羅里達(dá)/4/2006病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用0.02mg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg(多域)抗體處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖14顯示了md3606和cr9114針對(duì)用b/佛羅里達(dá)/4/2006病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg(多域)抗體處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖15顯示了md2407、md3606和cr9114針對(duì)用b/佛羅里達(dá)/4/2006病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用0.02mg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg(多域)抗體處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖16顯示了md3606和cr9114針對(duì)用a/香港/1/1968-ma(h3n2)病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用0.6mg/kg、1.7mg/kg或5mg/kg(多域)抗體處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖17顯示了md2407、md3606和cr9114針對(duì)用a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用0.01mg/kg、0.05mg/kg、或0.25mg/kg(多域)抗體處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

圖18顯示了md3606和cr9114針對(duì)用a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)病毒的致死性激發(fā)的體內(nèi)功效。顯示了在激發(fā)前一天(在第0天)用0.6mg/kg、1.7mg/kg或5mg/kg(單域)抗體處理的小鼠的存活曲線(左圖)和體重減輕(右圖)。

定義

下面給出如本發(fā)明中使用的術(shù)語的一些定義。

如在此使用的術(shù)語“結(jié)合分子”是指根據(jù)本發(fā)明的單域抗體(單體結(jié)合分子)和多域抗體(多聚體結(jié)合分子)。

如在此使用的，單域抗體(sdab)是由單個(gè)單體可變抗體結(jié)構(gòu)域組成的結(jié)合分子，該單個(gè)單體可變抗體結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合獨(dú)立于其他v區(qū)或結(jié)構(gòu)域的抗原或表位。單域抗體是本領(lǐng)域已知的，并且是通常源自于天然存在的“僅重鏈”抗體，即不含輕鏈的重鏈抗體。這樣的僅重鏈的抗體可以獲得自駱駝科(camelidae)物種，例如在駱駝、美洲駝、單峰駱駝、或羊駝中(也稱為駱駝科(camelid)抗體)。源自于所述僅重鏈的抗體的可變區(qū)，通常被稱為vhh結(jié)構(gòu)域或單域抗體(sdab)。如在此使用的，單域抗體還指的是來自包含兩條重鏈和兩條輕鏈的常規(guī)免疫球蛋白的分離的單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(vl或vh)。該免疫球蛋白優(yōu)選地是人源的，但還可以包括來自其他哺乳動(dòng)物物種(包括嚙齒類)的免疫球蛋白。

如在此使用的，術(shù)語“多域抗體”是指包含至少兩種直接地或通過連接序列彼此連接的單域抗體的結(jié)合分子。

與a型流感病毒相關(guān)的術(shù)語“流感病毒亞型”是指由血球凝集素(h)和神經(jīng)氨酸酶(n)病毒表面蛋白的各種組合表征的a型流感病毒株。a型流感病毒亞型可以由其h號(hào)表示，例如像“包括h1或h3亞型的ha的流感病毒”、或“h1流感病毒”、“h3流感病毒”，或由h號(hào)和n號(hào)的組合表示，例如像“流感病毒亞型“h3n2”或“h5n1”。術(shù)語流感病毒“亞型”具體包括這樣的亞型中的所有個(gè)體流感病毒“株”，這些“株”通常是由突變引起的并且顯示出不同的致病性譜，并且包括天然分離物以及人造突變體或重配體等。這些株還可以被稱為病毒亞型的各種“分離物”。因此，如在此使用的，術(shù)語“株”和“分離物”可以互換使用。

這些a型流感病毒亞型可以通過參考其系統(tǒng)發(fā)育組進(jìn)一步分類。系統(tǒng)發(fā)育分析表明了將流感血球凝集素細(xì)分為兩個(gè)主要的組：尤其是在系統(tǒng)發(fā)育組1(“組1”流感病毒)中的h1、h2、h5和h9亞型，以及尤其是在系統(tǒng)發(fā)育組2(“組2”流感病毒)中的h3、h4、h7和h10亞型。

在b型流感病毒株中的ha的抗原變異小于在a型株中觀察到的抗原變異。b型流感病毒的兩種遺傳性和抗原性不同的亞型或“譜系”在人體中循環(huán)，以b/山形/16/88(也稱為b/山形)和b/維多利亞/2/87(b/維多利亞)譜系為代表。如在此使用的，b型流感病毒株被稱為源自于“b/山形譜系”或“b/維多利亞譜系”的流感病毒株。

如在此使用的，與本發(fā)明的結(jié)合分子相關(guān)的術(shù)語“中和”是指結(jié)合分子在受試者中體外和/或體內(nèi)抑制流感病毒復(fù)制的結(jié)合分子，而不論通過何種機(jī)制實(shí)現(xiàn)中和。因此，中和可以例如通過抑制病毒與細(xì)胞表面的附著或粘著或通過抑制病毒與細(xì)胞膜在病毒與靶細(xì)胞附著之后的融合，或通過抑制病毒從感染的細(xì)胞中出來等來實(shí)現(xiàn)。如在此使用的，與本發(fā)明的結(jié)合分子相關(guān)的術(shù)語“交叉中和”或“交叉中和作用”是指本發(fā)明的結(jié)合分子中和不同的a型和/或b型流感病毒亞型的能力。

關(guān)于本發(fā)明的結(jié)合分子，術(shù)語“(免疫)特異性結(jié)合”是指結(jié)合至感興趣的蛋白質(zhì)的表位的結(jié)合分子，但不實(shí)質(zhì)性地識(shí)別和結(jié)合在含有抗原生物分子的混合物的樣品中的其他分子。結(jié)合可以由共價(jià)或非共價(jià)相互作用或兩者的組合介導(dǎo)。

如在此使用的，術(shù)語“流感”或“流感病毒疾病”是指由a型或b型流感病毒感染細(xì)胞或受試者而產(chǎn)生的病理狀況。在具體的實(shí)施例中，該術(shù)語是指由a型或b型流感病毒引起的呼吸系統(tǒng)疾病。如在此使用的，術(shù)語“流感病毒感染”意指通過流感病毒在細(xì)胞或受試者中繁殖和/或存在的侵染。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明的第一方面，提供了能夠特異性結(jié)合包含來自系統(tǒng)發(fā)育組2的兩種不同亞型的ha的至少兩種a型流感病毒株的血球凝集素(ha)的新穎的單域抗體(sdab)，即sdab能夠特異性結(jié)合至少兩種不同的a型流感病毒株的血球凝集素(ha)，所述病毒株包含來自系統(tǒng)發(fā)育組2的兩種不同的ha亞型的ha。另外，提供了能夠結(jié)合至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組1的a型流感病毒株的ha以及結(jié)合至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組2的a型流感病毒株的sdab。此外，提供了能夠特異性結(jié)合至少一種b型流感病毒株的ha的sdab。以前沒有對(duì)能夠特異性結(jié)合來自系統(tǒng)發(fā)育組2的a型流感病毒株的兩種不同亞型的ha，或能夠結(jié)合來自系統(tǒng)發(fā)育組1(例如包括h1、h2和/或h5亞型的ha的流感病毒)和系統(tǒng)發(fā)育組2(例如包括h3、h7和/或h10亞型的ha的流感病毒)二者的a型流感病毒株的ha的單域抗體進(jìn)行描述。另外，還沒有對(duì)能夠特異性結(jié)合b型流感病毒的ha的sdab進(jìn)行描述。

本發(fā)明的這些sdab結(jié)合在ha中保守的中和表位。在某些實(shí)施例中，這些sdab結(jié)合在a型或b型流感病毒的ha蛋白的莖部區(qū)中的表位。在其他實(shí)施例中，這些sdab結(jié)合在該ha蛋白的頭部區(qū)中的表位。在某些實(shí)施例中，該sdab結(jié)合在b型流感病毒的ha蛋白的頭部區(qū)中的表位。

在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，這些sdab還能夠中和至少兩種包含來自系統(tǒng)發(fā)育組2的兩種不同亞型的ha的a型流感病毒株。在某些實(shí)施例中，這些sdab能夠中和優(yōu)選地至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組1的a型流感病毒株(例如像含有h1或h5亞型的ha的流感病毒)和至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組2的a型流感病毒株(例如像含有h3或h7亞型的ha的流感病毒)；或至少一種b型流感病毒株，優(yōu)選地至少一種來自b/山形譜系的b型流感病毒株和至少一種來自b/維多利亞譜系的流感病毒株。

在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的單域抗體是駱駝科vhh結(jié)構(gòu)域，即所謂的駱駝科(僅重鏈)抗體的可變結(jié)構(gòu)域。在另外的實(shí)施例中，該單域抗體是人源化駱駝科vhh結(jié)構(gòu)域。駱駝科單域抗體的人源化需要在單個(gè)多肽鏈中引入和誘變有限量的氨基酸。這與scfv、fab、(fab)2和igg的人源化相反，需要在兩條鏈(輕鏈和重鏈)中引入氨基酸變化，并且保留兩條鏈的組裝。用于這些駱駝科vhh結(jié)構(gòu)域的人源化的方法是本領(lǐng)域已知的，例如像在wo2008/020079、wo2008/142164、wo2010/139808中描述的。根據(jù)本發(fā)明，這些sdab的人源化在實(shí)例11中進(jìn)行了描述。

在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的單域抗體包括：

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:227、228和229；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:230、231和232；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:233、234和235；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:236、237和238；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:239、240和241；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:242、243和244；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:245、246和247；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:248、249和250；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:251、252和253；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:254、255和256；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:257、258和259；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:260、261和262；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:263、264和265；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:266、267和268；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:269、270和271；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:272、273和274；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:275、276和277；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:278、279和280；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:281、282和283；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:284、285和286；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:287、288和289；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:290、291和292；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:293、122和123；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:124、125和126；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:127、128和129；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:130、131和132；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:133、134和135；

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:136、137和138；或

一種或多種cdr序列，其選自seqidno:139、140和141。

如在此使用的，術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)”(cdr)意指結(jié)合分子的可變區(qū)內(nèi)的序列，其通常在很大程度上貢獻(xiàn)與在抗原上識(shí)別的表位在形狀和電荷分布上是互補(bǔ)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。cdr區(qū)域可以針對(duì)存在于處于其天然構(gòu)象中的蛋白質(zhì)上，或者在某些情況下，存在于變性的蛋白質(zhì)上(例如通過溶解在sds中)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的線性表位、不連續(xù)表位、或構(gòu)象表位是特異性的。

在某些實(shí)施例中，該單域抗體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：

a)單域抗體，包含seqidno:227的cdr1區(qū)、seqidno:228的cdr2區(qū)、和seqidno:229的cdr3區(qū)；

b)單域抗體，包含seqidno:230的cdr1區(qū)、seqidno:231的cdr2區(qū)、和seqidno:232的cdr3區(qū)；

c)單域抗體，包含seqidno:233的cdr1區(qū)、seqidno:234的cdr2區(qū)、和seqidno:235的cdr3區(qū)；

d)單域抗體，包含seqidno:236的cdr1區(qū)、seqidno:237的cdr2區(qū)、和seqidno:238的cdr3區(qū)；

e)單域抗體，包含seqidno:239的cdr1區(qū)、seqidno:240的cdr2區(qū)、和seqidno:241的cdr3區(qū)；

f)單域抗體，包含seqidno:242的cdr1區(qū)、seqidno:243的cdr2區(qū)、和seqidno:244的cdr3區(qū)；

g)單域抗體，包含seqidno:245的cdr1區(qū)、seqidno:245的cdr2區(qū)、和seqidno:247的cdr3區(qū)；

h)單域抗體，包含seqidno:248的cdr1區(qū)、seqidno:249的cdr2區(qū)、和seqidno:250的cdr3區(qū)；

i)單域抗體，包含seqidno:251的cdr1區(qū)、seqidno:252的cdr2區(qū)、和seqidno:253的cdr3區(qū)；

j)單域抗體，包含seqidno:254的cdr1區(qū)、seqidno:255的cdr2區(qū)、和seqidno:256的cdr3區(qū)；

k)單域抗體，包含seqidno:257的cdr1區(qū)、seqidno:258的cdr2區(qū)、和seqidno:259的cdr3區(qū)；

l)單域抗體，包含seqidno:260的cdr1區(qū)、seqidno:261的cdr2區(qū)、和seqidno:262的cdr3區(qū)；

m)單域抗體，包含seqidno:263的cdr1區(qū)、seqidno:264的cdr2區(qū)、和seqidno:265的cdr3區(qū)；

n)單域抗體，包含seqidno:266的cdr1區(qū)、seqidno:267的cdr2區(qū)、和seqidno:268的cdr3區(qū)；

o)單域抗體，包含seqidno:269的cdr1區(qū)、seqidno:270的cdr2區(qū)、和seqidno:271的cdr3區(qū)；

p)單域抗體，包含seqidno:272的cdr1區(qū)、seqidno:273的cdr2區(qū)、和seqidno:274的cdr3區(qū)；

q)單域抗體，包含seqidno:275的cdr1區(qū)、seqidno:276的cdr2區(qū)、和seqidno:277的cdr3區(qū)；

r)單域抗體，包含seqidno:278的cdr1區(qū)、seqidno:279的cdr2區(qū)、和seqidno:280的cdr3區(qū)；

s)單域抗體，包含seqidno:281的cdr1區(qū)、seqidno:282的cdr2區(qū)、和seqidno:283的cdr3區(qū)；

t)單域抗體，包含seqidno:284的cdr1區(qū)、seqidno:285的cdr2區(qū)、和seqidno:286的cdr3區(qū)；

u)單域抗體，包含seqidno:287的cdr1區(qū)、seqidno:288的cdr2區(qū)、和seqidno:289的cdr3區(qū)；

v)單域抗體，包含seqidno:290的cdr1區(qū)、seqidno:291的cdr2區(qū)、和seqidno:292的cdr3區(qū)；

w)單域抗體，包含seqidno:293的cdr1區(qū)、seqidno:122的cdr2區(qū)、和seqidno:123的cdr3區(qū)；

x)單域抗體，包含seqidno:124的cdr1區(qū)、seqidno:125的cdr2區(qū)、和seqidno:126的cdr3區(qū)；

y)單域抗體，包含seqidno:127的cdr1區(qū)、seqidno:128的cdr2區(qū)、和seqidno:129的cdr3區(qū)；

z)單域抗體，包含seqidno:130的cdr1區(qū)、seqidno:131的cdr2區(qū)、和seqidno:132的cdr3區(qū)；

aa)單域抗體，包含seqidno:133的cdr1區(qū)、seqidno:134的cdr2區(qū)、和seqidno:135的cdr3區(qū)；

bb)單域抗體，包含seqidno:136的cdr1區(qū)、seqidno:137的cdr2區(qū)、和seqidno:138的cdr3區(qū)；以及

cc)單域抗體，包含seqidno:139的cdr1區(qū)、seqidno:140的cdr2區(qū)、和seqidno:141的cdr3區(qū)。

在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，該單域抗體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：

a)單域抗體，包含seqidno:275的cdr1區(qū)、seqidno:276的cdr2區(qū)、和seqidno:277的cdr3區(qū)；

b)單域抗體，包含seqidno:284的cdr1區(qū)、seqidno:285的cdr2區(qū)、和seqidno:286的cdr3區(qū)；

c)單域抗體，包含seqidno:124的cdr1區(qū)、seqidno:125的cdr2區(qū)、和seqidno:126的cdr3區(qū)；

d)單域抗體，包含seqidno:127的cdr1區(qū)、seqidno:128的cdr2區(qū)、和seqidno:129的cdr3區(qū)；

e)單域抗體，包含seqidno:263的cdr1區(qū)、seqidno:264的cdr2區(qū)、和seqidno:265的cdr3區(qū)；以及

f)單域抗體，包含seqidno:133的cdr1區(qū)、seqidno:134的cdr2區(qū)、和seqidno:135的cdr3區(qū)。

根據(jù)另外的實(shí)施例，根據(jù)本發(fā)明的單域抗體包括選自下組的氨基酸序列，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:1-29，或同源氨基酸序列。如在此使用的，本發(fā)明的同源氨基酸序列可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、缺失或取代，這些添加、缺失或取代沒有實(shí)質(zhì)性地改變本發(fā)明的結(jié)合分子的功能特征。在同源序列表示序列一致性的情況下，它表示呈現(xiàn)與親本序列高度序列一致性(大于70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％序列一致性)的序列。

在某些實(shí)施例中，在此描述的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以是突變的，即被另一種氨基酸取代?？梢砸氪祟愅蛔円苑乐狗g后修飾的發(fā)生。最普遍的修飾包括蛋白質(zhì)水解、糖基化作用、甲硫氨酸的氧化、以及天冬酰胺和谷氨酰胺殘基的脫酰胺化。其他修飾包括焦谷氨酸形成、天冬氨酸異構(gòu)化和色氨酸氧化。以下氨基酸殘基和序列基序易受翻譯后修飾的影響，并且可以因此通過以下定點(diǎn)誘變而改變：n-末端谷氨酸或谷氨酰胺、n-糖基化基序asn-xxx-ser/thr、溶劑暴露的甲硫氨酸或色氨酸殘基、蛋白質(zhì)水解切割位點(diǎn)asp-pro、脫酰胺作用基序asn-gly和gln-gly、和/或asp異構(gòu)化基序asp-gly。

在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的sdab是人源化的。因此，在某些實(shí)施例中，這些sdab包括選自下組的氨基酸序列，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:146-226和340。

在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的單域抗體包括選自下組的氨基酸序列，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:13或其人源化變體，該人源化變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:177-187和seqidno:340；seqidno:17或其人源化變體，該人源化變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:146-156；seqidno:20或其人源化變體，該人源化變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:157-176；seqidno:24或其人源化變體，該人源化變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:188-197；seqidno:25或其人源化變體，該人源化變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:198-203；以及seqidno:27或其人源化變體，該人源化變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:204-226。

在某些實(shí)施例中，該單域抗體包括選自下組的氨基酸序列，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:187、seqidno:340、seqidno:155、seqidno:176、seqidno:197、seqidno:203、和seqidno:221。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了所謂的多域抗體，即包含如上所述的至少兩個(gè)單域抗體的結(jié)合分子。例如，第一個(gè)單域抗體的c-末端可以連接至下一個(gè)單域抗體的n-末端以形成二聚體結(jié)合分子。在某些實(shí)施例中，這些多域抗體包括至少三個(gè)、至少四個(gè)、或至少五個(gè)如上所述的單域抗體以形成多聚體，例如三聚體、四聚體、五聚體等。這些連接的sdab可以是相同或可以是不同的sdab，即具有不同的氨基酸序列和表位特異性的sdab。

在某些實(shí)施例中，這些多域抗體是單鏈分子。在某些實(shí)施例中，這些多域抗體是雙鏈分子，即包括至少兩條鏈，每一條鏈包含至少一個(gè)單域抗體。這兩條鏈可以是相同的或可以是不同的。

使用本領(lǐng)域已知的任何方法，可以將這些單域抗體連接以形成在此披露的任何多域抗體。因此，這些單域抗體可以通過化學(xué)鍵連接，或者可以直接地或通過短的多肽接頭連接在一起。這樣的接頭序列可以是天然存在的序列或非天然存在的序列。該接頭序列優(yōu)選為多域抗體提供足夠的靈活性，并且同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)水解是耐受的。

在某些實(shí)施例中，該至少兩個(gè)單域抗體經(jīng)由肽接頭進(jìn)行遺傳融合。因此，通過形成編碼完整多肽構(gòu)建體的多核苷酸構(gòu)建體(或核酸序列)，這些單域抗體在dna水平上進(jìn)行遺傳融合，即該結(jié)合分子包含兩個(gè)或更多個(gè)單域抗體。

在某些實(shí)施例中，該至少兩個(gè)單域抗體通過含有從1至100個(gè)氨基酸，優(yōu)選地從1至80個(gè)氨基酸、或從1至60個(gè)氨基酸、或從10至60個(gè)氨基酸的連接序列進(jìn)行連接。接頭的實(shí)例包括但不限于在表15中的連接序列。因此，在某些實(shí)施例中，該連接序列包含選自seqidno:142-145的氨基酸序列。

在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的這些多域抗體包含至少兩個(gè)sdab。該至少兩個(gè)sdab可以選自表14和/或表40。在某些實(shí)施例中，該至少兩個(gè)sdab選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:1-29和seqidno:146-226。該至少兩個(gè)sdab可以是相同的(同源多聚體)或可以是不同的(異源多聚體)。

在某些實(shí)施例中，這些多域抗體包含至少兩個(gè)，優(yōu)選地至少三個(gè)，更優(yōu)選地至少四個(gè)sdab，該sdab選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：

a)單域抗體，其包含seqidno:275的cdr1區(qū)、seqidno:276的cdr2區(qū)、和seqidno:277的cdr3區(qū)；

b)單域抗體，其包含seqidno:284的cdr1區(qū)、seqidno:285的cdr2區(qū)、和seqidno:286的cdr3區(qū)；

c)單域抗體，其包含seqidno:124的cdr1區(qū)、seqidno:125的cdr2區(qū)、和seqidno:126的cdr3區(qū)；

d)單域抗體，其包含seqidno:127的cdr1區(qū)、seqidno:128的cdr2區(qū)、和seqidno:129的cdr3區(qū)；

e)單域抗體，其包含seqidno:263的cdr1區(qū)、seqidno:264的cdr2區(qū)、和seqidno:265的cdr3區(qū)；以及

f)單域抗體，其包含seqidno:133的cdr1區(qū)、seqidno:134的cdr2區(qū)、和seqidno:135的cdr3區(qū)。

在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的這些多域抗體包含至少兩個(gè)，優(yōu)選地至少三個(gè)，更優(yōu)選地至少四個(gè)sdab，這些sdab選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:13，或其人源化變體，該人源化變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:177-187和seqidno:340；seqidno:17或其人源化變體，該人源化變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:146-156；seqidno:20或其人源化變體，該人源化變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:157-176；seqidno:24或其人源化變體，該人源化變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:188-177；seqidno:25或其人源化變體，該人源化變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:198-203；以及seqidno:27或其人源化變體，該人源化變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:204-226。

在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的這些多域抗體包含選自下組的氨基酸序列，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:30-73。

在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的這些多域抗體能夠中和至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組1的a型流感病毒株(例如像含有h1和/或h5亞型的ha的流感病毒)和至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組2的a型流感病毒株(例如像含有h3和/或h7亞型的ha的流感病毒)。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的這些多域抗體能夠中和至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組1的a型流感病毒株(例如像含有h1和/或h5亞型的ha的流感病毒)和至少一種來自系統(tǒng)發(fā)育組2的a型流感病毒株(例如像含有h3和/或h7亞型的ha的流感病毒)，以及至少一種b型流感病毒株，優(yōu)選地至少一種b/山形譜系的b型流感病毒株和至少一種b/維多利亞譜系的流感病毒株。

在某些實(shí)施例中，這些多域抗體能夠中和含有h1亞型的ha的流感病毒(例如h1n1流感病毒株)、含有h3亞型的ha的流感病毒(例如h3n2流感病毒株)、含有h5亞型的ha的流感病毒(例如h5n1流感病毒株)、含有h7亞型的ha的流感病毒(例如h7n9流感病毒株)，以及至少一種b型流感病毒，優(yōu)選地至少一種來自b/山形譜系的b型流感病毒株和至少一種來自b/維多利亞譜系的流感病毒株。

本發(fā)明的這些多域抗體因此可以合適地用于預(yù)防和/或治療流感感染，甚至不考慮致病流感亞型。

根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)顯示本發(fā)明的交叉中和的多域抗體提供相對(duì)于其他小的和大的抗流感分子的若干優(yōu)點(diǎn)。因此，多域抗體的親和力、效力、以及中和的廣度優(yōu)于所公布的廣泛中和靶向流感ha的ab(bnab)，如例如，cr9114(wo2013/007770)和fi6v3(corti等人，2011)的親和力、效力、以及中和的廣度。另外，通過靶向多個(gè)獨(dú)立中和的表位的這些多域抗體相比cr9114和fi6v3更不易于抗藥性流感株的開發(fā)。

如在此所述的，本發(fā)明因此提供了新穎的流感結(jié)合分子和交叉中和的結(jié)合分子。這些結(jié)合分子可以是單體的(即單域抗體)或多聚體的(即多域抗體)。本發(fā)明的這些結(jié)合分子以高親和力和特異性結(jié)合它們的靶標(biāo)。這與小分子藥物(如抗病毒藥物)形成對(duì)比，這些藥物經(jīng)常顯示脫靶結(jié)合，導(dǎo)致不希望的副作用。另外，本發(fā)明的這些結(jié)合分子結(jié)合多種ha表位，其中一些是常規(guī)抗體達(dá)不到的。流感ha含有在頭部和莖部區(qū)的多個(gè)糖基化位點(diǎn)。附著于這些位點(diǎn)的碳水化合物使得ha分子上的一些部分是常規(guī)抗體達(dá)不到的。本發(fā)明的較小結(jié)合分子仍然能夠靶向這些潛在的功能上重要的表位。另外，本發(fā)明的這些結(jié)合分子在廣泛的極端條件下是穩(wěn)定的。它們通常對(duì)高溫(高達(dá)100℃)、極端ph、變性劑、和蛋白質(zhì)水解是耐受的。這些結(jié)合分子的有利穩(wěn)定性可以產(chǎn)生可以在冷鏈外保存并且比其他蛋白質(zhì)藥物(如單克隆抗體)具有更長(zhǎng)的保存期限的產(chǎn)物。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子全部都是可以在一個(gè)單一過程之后產(chǎn)生和純化的單一蛋白質(zhì)。

典型地，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合組1的a型流感病毒(例如h1n1)、和/或組2的a型流感病毒(例如h3n2)、和/或b型流感病毒的ha、和/或其片段，其中親和力常數(shù)(kd-值)低于1.0x10^-6m、1.0x10^-7m、優(yōu)選地低于1.0x10^-8m、更優(yōu)選地低于1.0x10^-9m?？梢岳缡褂帽砻娴入x子體共振，例如使用biacore系統(tǒng)(瑞典烏普薩拉市法瑪西亞生物傳感器ab公司(pharmaciabiosensorab,uppsala,sweden))，或如在實(shí)例8中所述的測(cè)量親和力常數(shù)。

在某些實(shí)施例中，這些結(jié)合分子展示出針對(duì)a型和/或b型流感病毒的中和活性。在某些實(shí)施例中，相對(duì)于在不存在所述結(jié)合分子的情況下通過a型或b型流感病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染，本發(fā)明的結(jié)合分子防止a型或b型流感病毒感染宿主細(xì)胞至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％、或至少10％。可以例如如本文所述的測(cè)量中和活性。測(cè)量中和活性的替代性試驗(yàn)描述于例如whomanualonanimalinfluenzadiagnosisandsurveillance,geneva:worldhealthorganisation,2005,version2002.5[關(guān)于動(dòng)物流感診斷和監(jiān)視的who手冊(cè)，日內(nèi)瓦：世界衛(wèi)生組織，2005，2002.5版本]中。典型地，如在體外病毒中和測(cè)定(vna)中確定的，例如在實(shí)例中所述，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子具有1000nm或更少，優(yōu)選地100nm或更少，更優(yōu)選地10nm或更少，甚至更優(yōu)選地1nm或更少的中和活性。

在某些實(shí)施例中，這些結(jié)合分子(即，單域抗體或多域抗體)進(jìn)一步包括fc尾部。因此，在某些實(shí)施例中，將如上所述的這些結(jié)合分子連接至抗體(優(yōu)選地人抗體)的fc片段，例如人igg抗體的fc片段，例如igg1、igg2、igg3、igg4或igg4。根據(jù)本發(fā)明，如在此所述的單體或多聚體結(jié)合分子可以直接地或使用接頭與fc片段進(jìn)行遺傳融合。在某些實(shí)施例中，通過包含從1至100個(gè)氨基酸，優(yōu)選地從1至80個(gè)氨基酸，或從1至60個(gè)氨基酸，或從10至60個(gè)氨基酸的連接序列將這些結(jié)合分子連接至fc片段。接頭的實(shí)例包括但不限于在表15中的連接序列。因此，在某些實(shí)施例中，該連接序列包含選自seqidno:142-145的氨基酸序列。在某些實(shí)施例中，將sdab或多域抗體遺傳融合至fc片段的c-末端。在另外的實(shí)施例中，將單域抗體或多域抗體融合至fc片段的n-末端和c-末端。

在某些實(shí)施例中，該fc片段被工程改造成具有最小的效應(yīng)子功能。在本領(lǐng)域中已描述了具有最小的效應(yīng)子功能和保守的半衰期的fc片段，并且包括例如igg2、未糖基化的igg1(igg1agly)、具有s228p/l234a/l235a取代的igg4(igg4proalaala)、具有h268q/309l/a330s/p331s改變的igg2(igg2m4)以及含有v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s取代的igg2的fc變體(被命名為igg2σ)。關(guān)于igg4的突變形式，針對(duì)fcγr的特異性親和力已經(jīng)通過l234a/l245a取代被消除。

在某些實(shí)施例中，該fc片段被工程改造成具有增強(qiáng)的效應(yīng)子功能。本發(fā)明的結(jié)合分子因此可以被工程改造以增強(qiáng)fc-介導(dǎo)的效應(yīng)子功能，其在流感感染的臨床前模型中已顯示有助于藥物效力。本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了與增強(qiáng)的效應(yīng)子功能相關(guān)的人igg1的ch2結(jié)構(gòu)域中的若干個(gè)突變。這些突變包括但不限于在位置333處的丙氨酸突變(其增加adcc和cdc二者)、三突變體(s239d/i332e/a330l)(對(duì)fcγriiia具有較高親和力且對(duì)fcγriib具有較低親和力，導(dǎo)致增強(qiáng)的adcc)、以及另一個(gè)三突變體(s239d/i332e/g236a)(具有改進(jìn)的fcγriiia親和力和介導(dǎo)增強(qiáng)的吞噬作用的fcγriia/fcγriib比率)。影響效應(yīng)子功能性的其他fc突變已經(jīng)描述在文獻(xiàn)(例如strohl，2009)中。在某些實(shí)施例中，該fc片段被工程改造以具有延長(zhǎng)的血清半衰期。具有增加的血清半衰期的若干個(gè)工程改造的fc主鏈在本領(lǐng)域中是已知的。這些fc變體包括但不限于具有m252y/s254t/t256e(yte)突變的higg1fc、攜帶t250q/m428l突變(ql)的higg1或higg2fc、具有n434a突變的higg1fc、具有t307a/e380a/n434a突變(aaa)的higg1fc或具有m428l/n434s(ls)取代的higg1fc(kuo等人，2011)。在另外的實(shí)施例中，將這些結(jié)合分子(即，根據(jù)本發(fā)明的單域抗體或多域抗體)遺傳融合至人血清白蛋白或結(jié)合血清白蛋白的單域抗體上。在其他實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的這些單域抗體或多域抗體化學(xué)共軛至peg。因此，本發(fā)明的這些結(jié)合分子可以被工程改造以具有從例如僅幾個(gè)小時(shí)至若干個(gè)周或甚至幾個(gè)月的血清半衰期范圍。這開啟了流感感染的單劑量治療的可能性，而不是像目前使用的神經(jīng)氨酸酶抑制劑(如奧司他韋和扎那米韋)的2x每日方案。

在另外的實(shí)施例中，如上所述的單域抗體或多域抗體可以融合至fc尾部，優(yōu)選地是被工程改造以促進(jìn)異二聚體fc分子形成的fc尾部。已經(jīng)在本領(lǐng)域描述了突變促進(jìn)fc-異源二聚體化(klein等人，2012)。在某些實(shí)施例中，如在ep0812357b1和ep0979281b1中所述，促進(jìn)fc-異源二聚體化的突變是突出物入洞(knob-into-holes)突變。

在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的多域抗體包括至少一條鏈，該鏈含有選自下組的氨基酸序列，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:74-107、seqidno:110-121、和seqidno:293-339。

在某些實(shí)施例中，這些多域抗體包括兩條鏈，其中這兩條鏈的氨基酸序列是相同的。在某些實(shí)施例中，這兩條鏈包括選自下組的氨基酸序列，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:74-105和seqidno:293-298。在某些實(shí)施例中，這兩條氨基酸鏈包括seqidno:293-298的氨基酸序列。

在某些實(shí)施例中，這些多域抗體包括兩條不同的氨基酸鏈。在某些實(shí)施例中，這兩條不同的氨基酸鏈選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：

包括seqidno:299的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:300的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:301的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:302的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:303的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:305的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:306的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:307的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:308的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:309的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:310的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:311的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:312的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:313的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:315的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:315的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:316的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:317的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:318的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:319的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:106的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:317的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:320的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:321的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:322的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:323的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:324的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:325的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:326的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:327的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:328的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:329的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:330的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:331的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:332的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:333的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:334的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:335的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:336的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:337的氨基酸序列的一條鏈；以及

包括seqidno:338的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:339的氨基酸序列的一條鏈。

在某些實(shí)施例中，這兩條不同的氨基酸鏈選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：

包括seqidno:301的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:302的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:310的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:311的氨基酸序列的一條鏈；

包括seqidno:322的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:323的氨基酸序列的一條鏈；以及

包括seqidno:330的氨基酸序列的一條鏈和包括seqidno:331的氨基酸序列的一條鏈。

在又另一個(gè)方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼如上所述的單域抗體或多域抗體的核酸分子(也稱為核酸序列)。優(yōu)選地，這些核酸序列編碼含有如上所述的一個(gè)或多個(gè)cdr區(qū)的結(jié)合分子。

在某些實(shí)施例中，這些核酸序列編碼單域抗體，該單域抗體包括選自下組的氨基酸序列，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:1-29，或同源的氨基酸序列。

在某些實(shí)施例中，這些核酸序列編碼單域抗體，該單域抗體包括選自下組的氨基酸序列，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:146-226和seqidno:340，或同源的氨基酸序列。

在某些實(shí)施例中，這些核酸序列編碼多域抗體，該多域抗體包括選自下組的氨基酸序列，該組由以下各項(xiàng)組成：seqidno:30-107、seqidno:110-121和seqidno:293-339，或同源的氨基酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的核酸序列是指核苷酸的聚合體形式，并且包括上述的rna、mrna、cdna、基因組dna和合成形式、以及混合的聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脫氧核苷酸、或核苷酸的兩種類型中任一者的經(jīng)修飾的形式。該術(shù)語還包括dna的單鏈和雙鏈形式。熟練的技術(shù)人員應(yīng)理解，這些核酸分子的功能變體也旨在是本發(fā)明的一部分。功能變體是可以使用標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼來直接翻譯以提供一種與翻譯自母體核酸分子的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，將編碼根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子的核酸分子是密碼子優(yōu)化用于在酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如人細(xì)胞)中表達(dá)。密碼子優(yōu)化的方法已知并且已經(jīng)在先前描述(例如wo96/09378)。如與一個(gè)野生型序列相比，如果至少一個(gè)非優(yōu)選密碼子被更優(yōu)選的密碼子置換，那么認(rèn)為一個(gè)序列是密碼子優(yōu)化的。在此，一個(gè)非優(yōu)選密碼子是在一種生物體中不如另一個(gè)編碼相同氨基酸的密碼子經(jīng)常地使用的一個(gè)密碼子，并且一個(gè)更優(yōu)選的密碼子是在一種生物體中比一個(gè)非優(yōu)選密碼子更經(jīng)常地使用的一個(gè)密碼子。對(duì)于特定生物體的密碼子使用的頻率可見于密碼子頻率表，如在http://www.kazusa.or.jp/codon中。優(yōu)選地多于一個(gè)非優(yōu)選密碼子，優(yōu)選地最多的或所有非優(yōu)選密碼子，被更優(yōu)選的密碼子置換。優(yōu)選地，在一種生物體中最經(jīng)常使用的密碼子用于一種密碼子優(yōu)化的序列。被優(yōu)選的密碼子置換一般引起更高表達(dá)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，許多不同的核酸分子可以編碼相同的多肽。還應(yīng)當(dāng)理解，普通技術(shù)人員可以使用常規(guī)技術(shù)制造不影響由核酸分子編碼的氨基酸序列的核苷酸取代，以反映將表達(dá)多肽的任何具體宿主生物體的密碼子使用。因此，除非另外說明，否則“編碼氨基酸序列的核酸序列”包括彼此呈簡(jiǎn)并形式且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。核酸序列可以使用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)克隆，或通過dna合成重新產(chǎn)生，這可以通過在dna合成和/或分子克隆領(lǐng)域具有業(yè)務(wù)的服務(wù)公司(例如基因藝術(shù)公司(geneart)、金斯瑞公司(genscript)、生命科技公司(lifetechnologies)、歐陸公司(eurofins))使用常規(guī)程序執(zhí)行。

本發(fā)明還提供了含有如上所述的至少一種核酸序列的載體。術(shù)語“載體”是指其中可以插入第二核酸分子用于引入宿主細(xì)胞中并在該宿主細(xì)胞中復(fù)制，并且在某些情況下表達(dá)的核酸分子。換言之，載體能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的核酸分子。通過如在此使用的術(shù)語“載體”考慮克隆載體以及表達(dá)載體。某些載體能夠在其被引入的宿主中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的載體可以在細(xì)菌中復(fù)制)。其他載體可以在引入到宿主細(xì)胞后被整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并且從而隨著宿主基因組一起復(fù)制。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可以輕易地制備根據(jù)本發(fā)明的載體。

在某些實(shí)施例中，提供了根據(jù)本發(fā)明的一種或多種核酸分子，該核酸分子可操作地連接至一種或多種表達(dá)調(diào)節(jié)核酸序列。如在此使用的術(shù)語“表達(dá)調(diào)節(jié)核酸序列”是指在特定宿主生物體中需要和/或影響可操作地連接的編碼序列的表達(dá)的核酸序列。這些表達(dá)調(diào)節(jié)核酸序列，例如尤其適合的轉(zhuǎn)錄起始、終止、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子序列；抑制子或激活子序列；有效的rna加工信號(hào)例如剪接和聚腺苷酸化信號(hào)；穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mrna的序列；增強(qiáng)翻譯效率的序列(例如，核糖體結(jié)合位點(diǎn))；增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；并且當(dāng)需要時(shí)，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分泌的序列可以是在選擇的宿主生物體中顯示活性的任何核酸序列，并且可以源自于編碼與宿主生物體同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。表達(dá)調(diào)節(jié)序列的鑒定和使用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是常規(guī)的。根據(jù)本發(fā)明適合的載體是，例如腺病毒載體，例如像ad26或ad35、腺病毒相關(guān)的載體(aav)、慢病毒、甲病毒、副粘病毒、牛痘病毒、皰疹病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒載體等。

在某些實(shí)施例中，使用用于基因治療目的的載體，如例如由adam等人(2014)、johnson等人(2009)、以及suscovich和alter(2015)所描述的。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括如在此所述的編碼單域抗體或多域抗體的核酸序列的宿主細(xì)胞。如在此使用的“宿主細(xì)胞”是指其中已經(jīng)引入了載體(如克隆載體或表達(dá)載體)的細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞可以是原核的或真核的。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括如上所述的一種或多種單域抗體、多域抗體、核酸分子和/或載體的藥物組合物。本發(fā)明的這些藥物組合物可以進(jìn)一步包括至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。“藥學(xué)上可接受的賦形劑”意指與活性分子(例如根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子)組合用于制備合適的組合物的任何惰性物質(zhì)。藥學(xué)上可接受的賦形劑是一種在所用劑量和濃度下對(duì)接受者無毒并且與配制品的其他成分相容的賦形劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑廣泛適用并且在本領(lǐng)域中是已知的。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包括至少一種其他的治療劑、預(yù)防劑和/或診斷劑。所述另外的治療劑和/或預(yù)防劑可以是例如還能夠預(yù)防和/或治療流感病毒感染的試劑，例如像m2抑制劑(例如，金剛胺、金剛烷乙胺)和/或神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如，扎那米韋、奧司他韋)。這些可以與本發(fā)明的結(jié)合分子組合使用。本文中的“組合”意指作為單獨(dú)的配制品或作為單一組合的配制品同時(shí)地進(jìn)行，或作為單獨(dú)配制品以任何順序按照順序給予方案進(jìn)行。

在另外的方面，本發(fā)明提供了如在此所述的單域抗體、多域抗體、核酸分子和/或載體，用于在流感感染的診斷、預(yù)防和/或治療中使用。此外，本發(fā)明提供了如在此所述的單域抗體、多域抗體、核酸分子和/或載體在制造用于診斷、預(yù)防和/或治療流感感染的藥物中的用途。此類感染可以發(fā)生在小群體中，但還可以在季節(jié)性流行病中，或更嚴(yán)重地在數(shù)百萬個(gè)體處于風(fēng)險(xiǎn)中的全球大流行病中傳播到世界各地。本發(fā)明提供可以中和引起此類季節(jié)性流行病以及潛在的大流行病的流感株感染的結(jié)合分子。重要的是，現(xiàn)在可以使用本發(fā)明的結(jié)合分子來設(shè)想保護(hù)和治療，而不考慮致病性流感病毒，因?yàn)橐呀?jīng)披露了本發(fā)明的結(jié)合分子能夠交叉中和系統(tǒng)發(fā)育組1(涵蓋例如，h1、h2、h5、h6、h8、h9和h11亞型)和系統(tǒng)發(fā)育組2(涵蓋例如h3、h4、h7和h10亞型)二者的各種流感亞型，以及b型流感亞型。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于在受試者中預(yù)防和/或治療流感的方法，該方法包括向?qū)ζ溆行枰氖茉囌呓o予如在此所述的治療有效量的單域抗體、多域抗體、核酸分子和/或載體。術(shù)語“治療有效量”是指如在此定義的結(jié)合分子或核酸分子用于預(yù)防、改善和/或治療由流感病毒感染引起的病癥有效的量。如在此使用的，改善可以是指減少流感感染的可見或可察覺的疾病癥狀、病毒血癥、或任何其他可測(cè)量的表現(xiàn)形式。預(yù)防涵蓋抑制或減少流感病毒的傳播，或抑制或減少一種或多種癥狀的發(fā)作、發(fā)展或進(jìn)展。

預(yù)防和/或治療可以靶向易受流感感染影響的患者群組。這樣的患者群組包括但不限于例如老年人(例如≥50歲、≥60歲并且優(yōu)選地≥65歲)、年幼者(例如≤5歲、≤1歲)、住院的患者、以及已經(jīng)用抗病毒化合物進(jìn)行治療但已經(jīng)顯示出不充分抗病毒應(yīng)答的已被感染的患者。

可以調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳的期望反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。適合的劑量范圍可以是例如0.01-100mg/kg體重、優(yōu)選地0.1-50mg/kg體重、優(yōu)選地0.01-15mg/kg體重。此外，例如，可以給予單次推注，可以隨著時(shí)間給予若干次劑量，或者可以根據(jù)需要按比例減少或增加劑量。

根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子、核酸分子和/或載體，可以例如靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)口吸入、肺、皮下、皮內(nèi)、玻璃體內(nèi)、口服、肌內(nèi)等給予至受試者。最佳的給予途徑將受多種因素的影響，這些因素包括活性分子的物理化學(xué)性質(zhì)、臨床表現(xiàn)的緊急性、以及活性分子的血漿濃度與所希望的治療效果之間的關(guān)系。

本發(fā)明的結(jié)合分子的高穩(wěn)定性開啟了替代性、無針遞送的可能性，例如通過使用鼻滴或鼻噴霧劑或使用噴霧器或干粉吸入器經(jīng)吸入進(jìn)行鼻內(nèi)給予。在某些實(shí)施例中，編碼至少一種根據(jù)本發(fā)明的單域抗體或多域抗體的核酸分子或載體因此是鼻內(nèi)給予的，如例如由limberis等人(2013)所述的。

與常規(guī)抗體和許多其他生物制藥不同，本發(fā)明的結(jié)合分子可以在微生物系統(tǒng)中非常有效地生產(chǎn)。在大規(guī)模制造中使用的微生物宿主細(xì)胞的實(shí)例是例如酵母(巴斯德畢赤酵母(p.pastoris))和大腸桿菌(e.coli)。這些微生物系統(tǒng)被認(rèn)為是生物制藥制造中最具成本效益的選擇。低cog是在流感預(yù)防和治療中廣泛使用抗流感藥物的先決條件。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明因此提供用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子(即，單域抗體或多域抗體)的方法，該方法包括在有助于該結(jié)合分子表達(dá)的條件下培養(yǎng)如本文所述的宿主細(xì)胞，并且任選地回收該表達(dá)的結(jié)合分子。從培養(yǎng)基中回收這些結(jié)合分子的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。

在某些實(shí)施例中，這些宿主細(xì)胞是微生物細(xì)胞，例如但不限于酵母細(xì)胞或大腸桿菌。

在另外的實(shí)施例中，這些宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如但不限于cho細(xì)胞、hek細(xì)胞或per.c6細(xì)胞。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及檢測(cè)樣品中流感病毒的方法，其中該方法包括以下步驟：a)使所述樣品與診斷有效量的根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子接觸，以及b)確定結(jié)合分子是否特異性結(jié)合樣品中的分子。該樣品可以是生物樣品，該生物樣品包括但不限于來自(潛在地)被感染的受試者的血液、血清、組織或其他生物材料。(潛在地)被感染的受試者可以是人類受試者，但是也可以使用本發(fā)明的結(jié)合分子對(duì)被懷疑是流感病毒攜帶者的動(dòng)物測(cè)試流感病毒的存在。優(yōu)選地，在允許可能存在于樣品中的結(jié)合分子和流感病毒或其抗原組分之間形成免疫復(fù)合物的條件下使本發(fā)明的結(jié)合分子與樣品接觸。然后通過適合的方法來檢測(cè)和測(cè)量指示樣品中流感病毒的存在的免疫復(fù)合物的形成(如果有的話)。這樣的方法尤其包括均質(zhì)和異質(zhì)結(jié)合免疫測(cè)定，如放射免疫測(cè)定(ria)、elisa、免疫熒光、免疫組織化學(xué)、facs、biacore以及蛋白質(zhì)印跡分析。在以下非限制性實(shí)例中進(jìn)一步闡明了本發(fā)明。

實(shí)例

實(shí)例1：免疫

為了誘導(dǎo)重鏈抗體依賴性免疫應(yīng)答，根據(jù)在表1中所描述的方案，在弗氏佐劑(freund'sadjuvant)的存在下，使用流感病毒抗原(商業(yè)疫苗和重組蛋白質(zhì))對(duì)四頭美洲駝(大羊駝(lamaglama))進(jìn)行免疫。

表1：美洲駝免疫方案。

在第2次、第3次、第4次和第5次免疫(表1)后的指定時(shí)間點(diǎn)，在檸檬酸鹽抗凝血樣品管中通過靜脈穿刺從美洲駝中收集外周血。

通過比較在免疫之前(第0天)收集的樣品與給予抗原之后(第28天和第112天)收集的血清樣品在haelisa中的抗原特異性血清滴度來分析每只動(dòng)物的同源和異源免疫應(yīng)答。為此，在maxisorp96孔微量滴定板中捕獲重組ha蛋白。阻斷后，添加連續(xù)稀釋的血清樣品，并且通過添加山羊抗美洲駝igg-hrp來檢測(cè)結(jié)合的美洲駝igg。結(jié)果顯示在圖1中。這些數(shù)據(jù)顯示所有免疫的動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)ha的良好的同源和異源的免疫應(yīng)答。

實(shí)例2：噬菌體文庫構(gòu)建

根據(jù)制造商的說明書，使用ficoll-paqueplus(ge醫(yī)療集團(tuán)(gehealthcare))，從新鮮血液中分離外周血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，pbmc)。從pbmc中提取的總rna充當(dāng)用于rt-pcr的起始材料，以擴(kuò)增編碼基因片段的vhh。將這些片段經(jīng)由sfii和noti限制性位點(diǎn)克隆進(jìn)m13噬菌粒載體pdv-lucstuffer(pdv-c06來源的；如在wo02/103012中描述的)中以產(chǎn)生vhh結(jié)構(gòu)域與m13噬菌體的piii蛋白質(zhì)的融合(包括兩種蛋白質(zhì)之間的amber終止密碼子)。將連接的載體轉(zhuǎn)化到tg-1細(xì)菌(安捷倫公司(agilent))中，并且經(jīng)由pcr分析100-150個(gè)單菌落以確定每個(gè)文庫的質(zhì)量。插入的頻率和完整性通常大于95％。構(gòu)建的文庫的特征顯示在表2中。通過使用基本上如(wo02/103012)所述的ct輔助噬菌體制備來自各個(gè)動(dòng)物的噬菌體文庫，將其進(jìn)行無菌過濾，并用于選擇。如本文所示，可以從所有免疫的美洲駝中產(chǎn)生復(fù)雜的噬菌體文庫。

表2：vhh噬菌體文庫的特征。

實(shí)例3：針對(duì)流感ha的單域抗體的選擇

使用以上描述的vhh噬菌體展示文庫、和基本上如在美國(guó)專利號(hào)6,265,150中、在wo98/15833中、以及在t.kuhlman(2001)的“phagedisplay,alaboratorymanual[噬菌體展示：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)]”中(將這些文獻(xiàn)通過引用并入本文)所述的一般噬菌體展示技術(shù)和技術(shù)來選擇抗體片段。此外，在本發(fā)明中使用如在wo02/103012(將其通過引用并入本文)中所述的方法和輔助噬菌體。

使用a型流感(h1a/加利福尼亞/07/2009、h1a/新喀里多尼亞/20/1999、h2a/日本/305/1957、h3a/布里斯班/10/2007、h7a/荷蘭/219/2003)和/或b型流感(維多利亞分枝b/布里斯班/60/2008、山形分枝b/佛羅里達(dá)/04/2006)的血球凝集素(ha)作為靶蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合蛋白的選擇。靶蛋白來源是昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白(美國(guó)康涅狄格州蛋白質(zhì)科學(xué)公司(proteinsciences,connecticut,usa))或在流感感染并且固定(3％低聚甲醛)的mdck細(xì)胞表面上表達(dá)的ha。使用各種選擇條件并將其總結(jié)在表3中?！皊d”是指單域抗體。如果沒有另外提及，否則在ph7.4下、且用5μg/mlha蛋白進(jìn)行選擇。cr8033和cr8071是結(jié)合至b型流感ha的頭部和頸部的單克隆抗體(igg)(dreyfus等人，2012)。

表3：噬菌體展示選擇條件

對(duì)于第一輪選擇，將免疫管用ha(5.0μg/ml，在pbs中稀釋)包被過夜，并用阻斷緩沖液(在pbs中2％脫脂奶粉(elk))洗滌。將這些噬菌體展示文庫的等分試樣(5-10μl)用2ml阻斷緩沖液(5％非熱滅活的胎牛血清(fbs)、1％小鼠血清、和在pbs中的2％elk)阻斷，并且將其添加至免疫管中。在室溫(rt)下孵育2h后，將管子洗滌(用在pbs中的0.05％吐溫(tween)-20洗滌5至15次，并且用pbs洗滌3至5次)。將結(jié)合的噬菌體用三乙胺(100mm)洗脫10min，并且將ph調(diào)節(jié)至7.5。在37℃下，將大腸桿菌xl1-blue用經(jīng)洗脫的噬菌體感染、涂板、并且孵育過夜。對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)(在1e+04cfu和1e+06cfu之間)，并將其從這些板上刮下以制備富集的噬菌體文庫(如在wo02/103012中所述)。

使用從第一輪挽救的噬菌體，并遵循基本上相同的方案(除了改變的抗原、ph、和/或添加表位阻斷的單克隆抗體)進(jìn)行第二輪選擇。應(yīng)用變體淘選策略，目的是選擇特異性靶向ha的保守莖區(qū)的強(qiáng)結(jié)合蛋白。為了選擇交叉反應(yīng)性單域克隆，還使用與第一輪選擇相比較少量的不同ha抗原。在該方案中引入低ph洗滌步驟以增加選擇可結(jié)合至莖部上并且阻斷在ph5.0下發(fā)生的ha的構(gòu)象變化的噬菌體的機(jī)會(huì)(brandenburg等人，2013)。對(duì)此將ha包被的免疫管與5倍稀釋的trypleselect(重組胰蛋白酶；英杰公司(invitrogen))孵育10min，以切割包被的ha0(為ha1-ha2)，隨后進(jìn)行洗滌和阻斷步驟。在與噬菌體孵育后，如前所述洗滌管子，隨后在ph5.1的檸檬酸磷酸鈉緩沖液中孵育20分鐘。在三次pbs洗滌步驟之后，如上所述繼續(xù)進(jìn)行噬菌體洗脫。在選擇期間添加igg1抗體(10μg/ml)阻斷在ha頭部或頸部的免疫優(yōu)勢(shì)表位，并且還可以增加選擇與ha的莖部結(jié)合的單域噬菌體的機(jī)會(huì)。在ha包被的免疫管的封閉期間以及在與這些噬菌體文庫孵育期間，添加抗體cr8033和cr8071(dreyfus等人，2012)。

在各個(gè)sdab分離之前進(jìn)行了連續(xù)兩輪至三輪的選擇。針對(duì)富集因子進(jìn)行每個(gè)選擇輸出的序列分析，并且挑選最佳的選擇用于進(jìn)一步分析。挑取各個(gè)大腸桿菌菌落以制備含有粗制的單克隆sdab的周質(zhì)提取物。簡(jiǎn)言之，使用經(jīng)洗脫的噬菌體感染大腸桿菌菌株sf110'培養(yǎng)物(2yt培養(yǎng)基，10μg/ml四環(huán)素，4％葡萄糖)，挑取各個(gè)菌落并在96孔深孔板(1ml2yt-atg培養(yǎng)基)中生長(zhǎng)。通過添加iptg(1mm)誘導(dǎo)vhh結(jié)構(gòu)域表達(dá)。通過在冰上將細(xì)菌球粒溶解在150μltes緩沖液(100mmtris-hcl、1mmedta、500mm蔗糖，ph8.0)中30min制備周質(zhì)提取物。滲透休克釋放周質(zhì)部分，并將澄清的且無菌過濾的含sdab的上清液用于功能篩選(參見實(shí)例4)。

根據(jù)制造商的說明書，通過使用ni-nta96孔旋轉(zhuǎn)板來純化并且濃縮來自小規(guī)模生產(chǎn)(96孔深孔板中的1ml)的sdab。

與周質(zhì)提取物的產(chǎn)生同時(shí)發(fā)生，使用各個(gè)克隆的剩余培養(yǎng)物產(chǎn)生甘油儲(chǔ)液，并分離質(zhì)粒dna用于vhh基因的測(cè)序。進(jìn)一步測(cè)試獨(dú)特序列。

使用來自組1、組2、或b型流感的ha蛋白的交叉選擇以及在低ph下的嚴(yán)格洗滌步驟允許廣泛的ha結(jié)合噬菌體的分離。小規(guī)模大腸桿菌生產(chǎn)的周質(zhì)提取物產(chǎn)生適用于功能篩選的可重復(fù)的蛋白質(zhì)水平。

實(shí)例4：流感病毒中和單域抗體的功能篩選

在病毒中和測(cè)定(vna)中分析含sdab的周質(zhì)提取物的預(yù)防流感病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力。為此，將mdck細(xì)胞(atcc，目錄#ccl-34)接種在96孔板(4e+04細(xì)胞/孔)中，并且4h后，與流感病毒(100tcid50/孔)和無菌過濾的周質(zhì)提取物(15μl/孔或其稀釋液)的混合物一起孵育。在37℃和10％co2下孵育3天后，通過在v底板中1％火雞紅細(xì)胞(trbc)的血細(xì)胞凝集來評(píng)估在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中新產(chǎn)生的病毒的量(中和sdab降低在上清液中的病毒載量，從而防止trbc的血細(xì)胞凝集)。由于sdab輸入濃度對(duì)于周質(zhì)提取物是未知的，所以樣品對(duì)病毒中和僅評(píng)分為陽性或陰性。平行測(cè)試多種流感株，以選擇優(yōu)選地廣泛中和的sdab(參見表3a)。

總之，功能篩選導(dǎo)致可被分類為中和a型組1、a型組2、a型組1和組2、或b型流感病毒的sdab。

表3a：功能篩選流感中和單域抗體(‘+’代表中和，‘-’代表沒有中和，ag1是指a型流感組1，ag2是指a型流感組2，b是指b型流感；空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)

實(shí)例5：單域抗體表達(dá)和純化

將相關(guān)的sdab序列克隆到適合用于expi293懸浮細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)真核表達(dá)載體中。將生產(chǎn)運(yùn)行進(jìn)行5-6天。表達(dá)的sdab分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。在從培養(yǎng)基中完全消耗葡萄糖之前，將培養(yǎng)物上清液收獲，離心并無菌過濾。使用含有鎳離子的抗his樹脂(完全his-tag柱；羅氏公司(roche)，目錄#06781543001)純化sdab，并使用高濃度的咪唑(300mm)洗脫。使用脫鹽柱(hiprep26/10脫鹽柱，gehc目錄#17-5087)將該洗脫物的緩沖液更換為其最終、配制緩沖液(20mmnaac75mmnacl、5％蔗糖，ph5.5)，并使用amiconultra3k旋轉(zhuǎn)過濾器(密理博公司(millipore)，目錄#ufc900324)進(jìn)行濃縮。在確定濃度之后，通過sds-page、hpsec、sec-mals、和內(nèi)毒素測(cè)定進(jìn)一步表征純的sdab等分試樣。針對(duì)所有構(gòu)建體，獲得600ml轉(zhuǎn)染體積中5mg純化的sdab的最小產(chǎn)率。僅具有超過95％的單體含量和正確的分子量的sdab批次用于進(jìn)一步表征。

對(duì)于所選擇的應(yīng)用，需要沒有標(biāo)記(例如his標(biāo)簽)的sdab。將非標(biāo)記的sdab經(jīng)由多步驟離子交換色譜(iex)進(jìn)行純化。將澄清的且過濾的上清液在dh2o中稀釋兩倍以降低電導(dǎo)率，將ph設(shè)定為8.0，并且將樣品加載到帶正電的captoqimpress樹脂(gehc，目錄#17-5470-02)上。將不帶電的sdab保留在流出物中，然后將其調(diào)節(jié)至ph3.5。現(xiàn)在，將帶正電荷的sdab在帶負(fù)電荷的hitrapcaptospimpres柱(gehc，目錄#17-5468-55)上捕獲，并且使用高濃度的氯化鈉進(jìn)行洗脫。sdab的pi可以變化很大，并且將該方法用于在ph8下具有負(fù)電荷至+1.0電荷，并且在ph3至5的范圍內(nèi)具有至少為+10以上的電荷的分子。如上所述進(jìn)一步處理洗脫的sdab。

如本文所示，基于his標(biāo)簽以及對(duì)于無標(biāo)簽的構(gòu)建體基于離子交換的expi293細(xì)胞表達(dá)和純化策略的產(chǎn)生高數(shù)量和質(zhì)量的單體sdab構(gòu)建體。

實(shí)例6：單域抗體的特征

流感病毒中和的廣度

使用如實(shí)例4中所述的病毒中和測(cè)定，通過在一大組流感病毒株中測(cè)試一系列的濃度來評(píng)估純化的sdab的中和效價(jià)。將效價(jià)報(bào)告于表4-7中?；谄浠钚?，sdab可以被細(xì)分為a型流感組1(涵蓋h1、h5、h2、h6、h11、h9、h8和h12病毒)中和分子、a型流感組2(涵蓋h3、h4、h14、h7和h10病毒)中和分子、以及b型流感(涵蓋山形、維多利亞、和祖先/古老(predecessor/old)病毒)中和分子。有趣的是，一些sdab能夠中和來自組1和組2二者的a型流感病毒(表6)。

表4.針對(duì)a型組1分類的單域抗體的平均中和效價(jià)(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

表5.針對(duì)a型組2分類的單域抗體的平均中和效價(jià)(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

表6.針對(duì)a型組1和組2分類的單域抗體的平均中和效價(jià)(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)

表7.針對(duì)b型分類的單域抗體的平均中和效價(jià)(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

結(jié)合ha的廣度

生物膜層干涉技術(shù)平臺(tái)octetred384(fortébio公司，pall)用于在特定傳感器表面上的快速浸漬和讀取方法中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的無標(biāo)簽實(shí)時(shí)結(jié)合分析。在功能化傳感器的尖端檢測(cè)的質(zhì)量的變化允許研究sdab與重組ha的結(jié)合。當(dāng)在一系列的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行時(shí)，不僅確定了sdab的一般結(jié)合，而且還確定了sdab的kd。

在抗his傳感器(加載階段，抗-五-his傳感器，fortébio公司，目錄#18-0020)上捕獲具有c-末端his標(biāo)簽的經(jīng)純化的sdab。隨后將sdab加載的傳感器與不同的ha亞型(20μg/ml)一起孵育以測(cè)試結(jié)合(締合相)。測(cè)定的最后一步是將傳感器在動(dòng)力學(xué)緩沖液中孵育，以確定ha-sdab復(fù)合物的解離速率。將測(cè)試的sdab的結(jié)合能力列于表8中。通常，sdab結(jié)合比其能夠中和的更多的菌株的ha。更廣泛的結(jié)合譜與其對(duì)ha的各自的親和力有關(guān)(還參見表9的kd值)。

表8.sdab與ha結(jié)合的無標(biāo)記檢測(cè)(‘+’表示與ha的結(jié)合，‘-’表示無結(jié)合，ag1是指a型流感組1，ag2是指a型流感組2，b是指b型流感；空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

還使用無標(biāo)記生物膜層干涉技術(shù)來確定平衡解離常數(shù)(kd值)作為不同流感株的sdab和重組ha分子之間的結(jié)合效力的測(cè)量。通過擬合在穩(wěn)定狀態(tài)下的sdab濃度范圍的結(jié)合反應(yīng)(在締合相中在平臺(tái)測(cè)量的最后10秒的平均結(jié)合反應(yīng)))來確定kd值，以獲得在50％飽和度下的濃度，該濃度反映了kd值(r＝rmax*[sdab]/(kd+[sdab]))。以一式兩份測(cè)量連續(xù)稀釋，并且將幾何平均kd值報(bào)告于表9中。

表9.所選擇的sdab的親和力。sdab與ha結(jié)合的幾何平均kd值(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)

單域抗體與其他ha結(jié)合蛋白的競(jìng)爭(zhēng)

設(shè)計(jì)結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)研究以篩選sdab在其自身與其他ha結(jié)合蛋白(包括在ha上具有已知表位的良好表征的單克隆抗體(igg))之間的競(jìng)爭(zhēng)。如果觀察到競(jìng)爭(zhēng)，則假定兩個(gè)分子在ha的表面上結(jié)合相似的或至少重疊的表位。

對(duì)此建立了alphalisa競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定(珀金埃爾默公司(perkinelmer))，其依賴于被igg或his標(biāo)記的sdab(珀金埃爾默公司，10μl，在50μl中0.3nm的終濃度)結(jié)合的生物素化的ha(蛋白質(zhì)科學(xué)公司(proteinsciences)，10μl，在50μl中0.5nm的終濃度)。在rt下孵育1h后，使用兩個(gè)珠(使用了識(shí)別ha的鏈霉親和素供體珠(10μl，10μg/ml)和識(shí)別igg或sdab的抗fc或抗his受體珠(10μg/ml))檢測(cè)ha和結(jié)合蛋白之間的相互作用。如果在孵育另外一個(gè)小時(shí)后，激發(fā)的供體珠(680nm)和受體珠緊密相鄰，則可以測(cè)量作為受體珠發(fā)光信號(hào)的能量轉(zhuǎn)移(單線態(tài)氧)。處于這種均質(zhì)測(cè)定形式的信號(hào)強(qiáng)度直接與兩種結(jié)合配偶體之間的結(jié)合強(qiáng)度(親和力/親合力)成比例。取決于其親和力和濃度(通常在從100nm至0.5pm的范圍內(nèi)測(cè)試)，競(jìng)爭(zhēng)者可以破壞alphalisa信號(hào)，導(dǎo)致在spss中用標(biāo)準(zhǔn)的四參數(shù)邏輯非線性回歸模型擬合的sigmoidal抑制劑曲線。將計(jì)算的pic50值的平均值顯示于表10和表11中。

表10和表11顯示了alphalisapic50值的平均值(半數(shù)最大抑制濃度的負(fù)對(duì)數(shù)，較高值表示指數(shù)較大的效力)?！甴1_cal_ha’是指h1n1a/加利福尼亞/07/2009；‘h1_nca_ha’是指h1n1a/新喀里多尼亞/20/1999的ha；‘h5_vie_ha’是指h5n1a/越南/1203/2004的ha；‘h3_bri_ha’是指h3n2a/布里斯班/10/2007的ha；‘h3_wis_ha’是指a/威斯康辛/67/2005的ha；‘h7_net_ha’是指h7n7a/荷蘭/219/2003的ha；‘b_bri_ha’是指b/布里斯班/60/2008的ha；‘b_flo_ha’是指b/佛羅里達(dá)/04/2006的ha；‘cr8033’、‘cr8071’和‘cr9114’是結(jié)合由dreyfus等人(2012)表征的igg的ha?！?d1’是指結(jié)合ha的受體結(jié)合位點(diǎn)、由xu等人(2010)表征的igg。‘cr8020’是結(jié)合ha的莖部、由ekiert等人(2011)表征的igg?！?9.29’是結(jié)合ha的莖部的、在wo2014078268中被表征的igg。除了指定的‘無標(biāo)記的’版本，所有sdxxxx都具有用于檢測(cè)的his標(biāo)簽?？諉卧癖硎尽唇?jīng)測(cè)試的’。

表10：sdab競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合a型流感ha。

表11：sdab競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合b型流感ha。

受體結(jié)合的阻斷-血凝抑制

使用血凝抑制測(cè)定(ha測(cè)定的常見變化)來測(cè)試sdab在ha頭部區(qū)的頂部附近結(jié)合并物理阻斷與靶細(xì)胞(這里是紅細(xì)胞)上的唾液酸受體的相互作用的能力。如果在足夠濃度下的sdab阻斷與唾液酸的相互作用，那么“凝集”(紅細(xì)胞聚集在一起)被抑制。在pbs(25μl/孔)中制備sdab的系列稀釋，并添加和混合25μl的8hau/50μl病毒稀釋液。在37℃下孵育1h后，添加和混合50μl的1％火雞紅細(xì)胞(trbc)。在rt下孵育30至60min后，將凝集模式進(jìn)行目測(cè)評(píng)分(撕裂形成)。除了一式四份的樣品和陽性對(duì)照抗體之外，還采取輸入病毒的反向滴定。使用公式計(jì)算血凝抑制效價(jià)，即在trbc上病毒與唾液酸受體的所有相互作用被阻斷的最小濃度。

結(jié)果顯示于表12中。所有a型流感結(jié)合的sdab均為陰性(即，具有hi效價(jià)>50μg/ml)。

表12.單域抗體的血凝抑制效價(jià)(μg/ml)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

結(jié)合其結(jié)合與中和的特征曲線，sd1084被證明是一種有效的ha頭部結(jié)合蛋白，并防止與唾液酸受體的結(jié)合。

抑制由莖部結(jié)合的sdab引起的ha的構(gòu)象變化

為了證明莖部結(jié)合的sdab，與其競(jìng)爭(zhēng)的抗體相似，防止ha的構(gòu)象變化，從而阻斷病毒融合和隨后的感染，已經(jīng)開發(fā)了一種測(cè)定，該測(cè)定測(cè)量在低ph處理后的ha頭部(ha1)的存在以及在ha1和ha2之間連接的二硫鍵的還原(brandenburg等人，2013)。

構(gòu)象變化測(cè)定是基于無標(biāo)記檢測(cè)，并且使用生物膜層干涉技術(shù)平臺(tái)octetred384(fortébio公司，pall)進(jìn)行。首先將一批c-末端生物素化的重組ha切割(在37℃下將250μg的ha與10μl的0.05％胰蛋白酶-edta孵育20min，然后添加30μldti以終止胰蛋白酶活性)。然后在octet中的鏈霉親和素傳感器(fortébio公司，目錄#18-5020)上捕獲ha(2μg/ml)，隨后將其與結(jié)合配偶體(sdab，在高達(dá)50nm的陽性和陰性對(duì)照抗體)一起孵育。在該孵育步驟之后，傳感器將暴露于一系列ph范圍(ph6.5至5.0，以0.2ph的步幅)。如果該結(jié)合配偶體不穩(wěn)定并且扣留ha，它將經(jīng)歷構(gòu)象變化；ha1頭部結(jié)構(gòu)域離開，而涵蓋融合機(jī)器的ha2結(jié)構(gòu)域重折疊并使融合肽向外突出?，F(xiàn)在ha1只能經(jīng)由二硫鍵連接到ha2，該二硫鍵可以在最后的測(cè)定步驟中通過dtt暴露(pbs中的50mmdtt)被還原。然后ha1將從生物素化的ha2結(jié)構(gòu)域解離，導(dǎo)致在檢測(cè)器上檢測(cè)到顯著的質(zhì)量損失。結(jié)果匯總在表13中。

表13.防止由單域抗體引起的ha的構(gòu)象變化。‘++’是指ha的構(gòu)象變化的強(qiáng)抑制，并且‘+’是指ha的構(gòu)象變化的中等抑制。‘-’是指沒有抑制。空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’。

結(jié)果表明，ha莖部結(jié)合的sdab能夠根據(jù)它們的中和特征曲線防止ha的構(gòu)象變化。這種能力需要sdab在低ph值下(與晚期內(nèi)體的條件相似)保持結(jié)合。構(gòu)象變化的阻斷水平與它們?cè)诟髯粤鞲兄晟系闹泻托r(jià)呈正相關(guān)。

單域抗體序列

將根據(jù)本發(fā)明的所選擇的和表征的sdab的序列列于表14中。將cdr區(qū)的序列列于表14a中。

表14.根據(jù)本發(fā)明的單域抗體的序列。

表14a.根據(jù)本發(fā)明的單域抗體的cdr區(qū)的序列

總之，用純化的、單體sdab構(gòu)建體進(jìn)行的病毒中和測(cè)定確認(rèn)了四種不同的sdab分類：a型流感組1、a型流感組2、a型流感組1和組2、或b型流感中和sdab。然而，結(jié)合研究表明，許多a型組1或a型組2中和sdab還可以結(jié)合屬于其不能中和的組的ha。這導(dǎo)致顯著更多數(shù)量的a型組1和a型組2結(jié)合sdab。未發(fā)現(xiàn)可以中和或至少結(jié)合a型流感和b型流感的sdab。選擇能夠廣泛結(jié)合與中和的sdab用于進(jìn)一步表征(包括sd1038、sd1036、sd1083和sd1084)。對(duì)ha的親和力的確定顯示在所選擇的sdab的結(jié)合強(qiáng)度與中和效價(jià)之間呈正相關(guān)。用已知的ha結(jié)合分子經(jīng)由競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定的表位作圖顯示除sd1084之外的所有sdab結(jié)合ha的保守莖部。競(jìng)爭(zhēng)發(fā)生的濃度與中和效價(jià)呈正相關(guān)，意味著較強(qiáng)的結(jié)合和競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致較低的中和效價(jià)。另一方面，sd1084在ha頭部的唾液酸結(jié)合位點(diǎn)附近或該位點(diǎn)處結(jié)合，如在血凝抑制測(cè)定中所證實(shí)的，并且sd1084可以通過阻斷受體結(jié)合來防止流感病毒進(jìn)入細(xì)胞。所有其他所選擇的sdab可以結(jié)合在ha的莖部中的ha1和ha2，并且如在構(gòu)象變化測(cè)定中所證實(shí)的在融合過程期間防止ha的構(gòu)象變化。

實(shí)例7：sdab同源二聚體和異源二聚體的產(chǎn)生和特征

sdab同源二聚體和異源二聚體的產(chǎn)生

為了產(chǎn)生sdab同源二聚體和異源二聚體，將sdab編碼序列克隆在一起一起，抑或直接合成全長(zhǎng)基因(金斯瑞公司(genscript))并將其連接到真核表達(dá)載體中。在sdab二聚體構(gòu)建體中，第一個(gè)sdab(前)的c-末端連接到第二個(gè)sdab的n-末端(后)。不同長(zhǎng)度(10個(gè)、15個(gè)、35個(gè)和57個(gè)氨基酸)的接頭序列由氨基酸甘氨酸(g)和絲氨酸(s)組成。當(dāng)克隆在一起時(shí)，直接在第一個(gè)sdab后面的限制性位點(diǎn)(noti)導(dǎo)致三個(gè)另外的丙氨酸(a)殘基。接頭序列顯示在表15中，并且sdab二聚體的完整氨基酸序列顯示在表16(靶向a型流感的構(gòu)建體)和表17(靶向b型流感的構(gòu)建體)中。sdab在構(gòu)建體中的位置(前或后)是變化的，以允許最佳組合。如在實(shí)例5中所述進(jìn)行表達(dá)和純化。

表15.用于產(chǎn)生多域抗體構(gòu)建體的接頭序列。

表16.sd1036和sd1038同源二聚體和異源二聚體的序列。

表17.sd1083和sd1084同源和異源二聚體的序列。

由sdab同源二聚體和異源二聚體引起的流感中和

如在實(shí)例6中所述的在流感病毒中和測(cè)定中測(cè)試純化的sdab同源二聚體和異源二聚體，并且這些二聚體當(dāng)與sdab結(jié)構(gòu)單元相比時(shí)顯示了改進(jìn)的效力和廣度。對(duì)于a型流感中和二聚體的結(jié)果顯示在表18中，并且對(duì)于b型流感中和二聚體的結(jié)果顯示在表19中。

表18.sd1036和sd1038同源二聚體和異源二聚體的流感中和效價(jià)(還列出sdabsd1036和sd1038的效價(jià)用于比較，空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

表19.sd1083和sd1084同源二聚體和異源二聚體的流感中和效價(jià)(還列出sdabsd1083和sd1084的效價(jià)用于比較，空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

ha結(jié)合sdab同源二聚體和異源二聚體

如在實(shí)例6中所述的，在結(jié)合測(cè)定中測(cè)試純化的sdab同源二聚體和異源二聚體，并且當(dāng)與sdab結(jié)構(gòu)單元相比時(shí)顯示了改進(jìn)的結(jié)合強(qiáng)度(親合力)。對(duì)于a型流感中和二聚體的結(jié)果顯示在表20中。

表20.sd1036和sd1038同源二聚體和異源二聚體的幾何平均kd值(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

實(shí)例8：多域抗體構(gòu)建體的產(chǎn)生和特征

sdab多聚體的產(chǎn)生

為了產(chǎn)生sdab多聚體(三聚體、四聚體和五聚體)，將sdab編碼序列克隆在一起，抑或直接合成全長(zhǎng)基因(金斯瑞公司(genscript))并將其連接到真核表達(dá)載體中。不同長(zhǎng)度(10個(gè)或35個(gè)氨基酸)的接頭序列由氨基酸甘氨酸(g)和絲氨酸(s)組成。當(dāng)克隆在一起時(shí)，直接在第一個(gè)sdab后面的限制性位點(diǎn)(noti)導(dǎo)致三個(gè)另外的丙氨酸(a)氨基酸和直接在第二個(gè)sdab后面的2個(gè)連續(xù)的限制性位點(diǎn)(paci和xhoi)導(dǎo)致5個(gè)另外的氨基酸(linle)。接頭序列顯示在表15中，并且sdab三聚體的完整氨基酸序列顯示在表23中并且sdab四聚體和五聚體的完整氨基酸序列顯示在表24中。sdab在構(gòu)建體中的位置是變化的，以允許最佳組合。如在實(shí)例5中所述進(jìn)行表達(dá)和純化。

表23.三聚體多域抗體構(gòu)建體的序列。

表24.四聚體和五聚體多域抗體構(gòu)建體的序列。

由多域抗體引起的流感中和

如在實(shí)例6中所述的在流感病毒中和測(cè)定中測(cè)試純化的多域抗體，并且當(dāng)與sdab結(jié)構(gòu)單元相比時(shí)顯示了改進(jìn)的效力和廣度。對(duì)于流感中和三聚體的結(jié)果顯示在表25中，并且對(duì)于四聚體和五聚體的結(jié)果顯示在表26中。

表25.三聚體多域抗體構(gòu)建體的平均中和效價(jià)(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

表26.四聚體和五聚體多域抗體構(gòu)建體的平均中和效價(jià)(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

多域抗體與ha結(jié)合

在ph7.4下，還使用無標(biāo)記生物膜層干涉技術(shù)來確定平衡解離常數(shù)(kd值)作為不同流感株的多域抗體和重組ha分子之間的結(jié)合效力的測(cè)量。通過擬合在穩(wěn)定狀態(tài)下的md濃度范圍的結(jié)合反應(yīng)(在締合相的平臺(tái)上測(cè)量的最后10秒的平均結(jié)合反應(yīng)))來確定kd值，以獲得在50％飽和度下的濃度，該濃度反映了kd值(r＝rmax*[sdab]/(kd+[sdab]))。以一式兩份測(cè)量連續(xù)稀釋，并且將幾何平均kd值報(bào)告于表27中。

表27.在ph7.4下多域抗體構(gòu)建體與ha結(jié)合的幾何平均kd值(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

抑制由莖部結(jié)合的sdab引起的ha的構(gòu)象變化

為了證明含有ha莖部結(jié)合sdab結(jié)構(gòu)單元的多域抗體與其競(jìng)爭(zhēng)的抗體類似，防止ha的構(gòu)象變化，從而阻斷病毒融合和隨后的感染，如在實(shí)例6中所述的進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果匯總在表29中。

表29.防止由多域抗體引起的ha的構(gòu)象變化。‘++’是指ha的構(gòu)象變化的強(qiáng)抑制，并且‘+’是指ha的構(gòu)象變化的中等抑制?！?’是指沒有抑制?？諉卧癖硎尽唇?jīng)測(cè)試的’。

與單個(gè)結(jié)構(gòu)單元相比，將3個(gè)或更多個(gè)sdab連接在一起可以顯著提高中和的效力和廣度。因此，不能被sdab中任一者單獨(dú)中和的流感株能可靠地被相同sdab的多聚體構(gòu)建體中和。中和a型流感組1、a型流感組2或b型流感的sdab的組合產(chǎn)生能夠中和幾乎所有測(cè)試株的多結(jié)構(gòu)域。中和的廣度的增加與使用的sdab的潛在結(jié)合廣度有關(guān)。除了與構(gòu)建體的二價(jià)性質(zhì)相關(guān)的可能的其他中和機(jī)制之外，對(duì)ha的親合力的增加被認(rèn)為是所描述的改進(jìn)的原因。病毒融合的阻斷被證實(shí)為所測(cè)試的二聚體和多結(jié)構(gòu)域的病毒中和機(jī)制。

實(shí)例9：fc-融合構(gòu)建體的產(chǎn)生和特征

fc融合構(gòu)建體的產(chǎn)生

sdab和sdab多聚體可以與抗體的fc區(qū)融合。該fc區(qū)被定義為抗體(例如人igg1分子)的一部分，其含有在ch2和ch3區(qū)后面的鉸鏈區(qū)。已經(jīng)產(chǎn)生了不同的fc融合構(gòu)建體，并且關(guān)于ha結(jié)合、體外中和以及體內(nèi)功效，將其與sdab多聚體和單克隆抗體進(jìn)行比較。

在如表15中所示的另外的接頭存在或不存在的情況下，將sdab或sdab多聚體融合至fc片段的c-末端和/或n-末端。fc融合構(gòu)建體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，并作為二聚體fc分子分泌到培養(yǎng)基中。fc融合構(gòu)建體的完整氨基酸序列顯示在表30中。sdab或sdab多聚體在構(gòu)建體中的位置是變化的，以允許最佳組合。產(chǎn)生同源二聚體以及異源二聚體的fc-融合分子。如由labrijn等人(2013)所描述的，通過在ch3結(jié)構(gòu)域中引入單點(diǎn)突變產(chǎn)生異源二聚體的fc融合。這些突變是k409r和f405l，并且含有這些突變的fc鏈分別被稱為fcga和fcgb。

fc融合構(gòu)建體在懸浮的expi293細(xì)胞中表達(dá)。將包含具有k409r或f405l突變的異源二聚體fc構(gòu)建體的序列的dna構(gòu)建體作為包含兩個(gè)連續(xù)開放閱讀框的單一載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和表達(dá)根據(jù)供應(yīng)商的說明書進(jìn)行，并且與以前報(bào)道的用于生產(chǎn)人igg構(gòu)建體的條件相似(dreyfus等人，2012)。通過制備型凝膠過濾(superdex75pg或superdex200pg柱，ge醫(yī)療集團(tuán)(gehealthcare))除去可能的聚合物和雜質(zhì)。在sds-page上分析樣品，并且將對(duì)應(yīng)于期望分子量的級(jí)分合并并使用amiconultra30k離心過濾器進(jìn)行濃縮。所有的生產(chǎn)運(yùn)行產(chǎn)生在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵穩(wěn)定地連接的二聚體的fc融合分子。如由labrijn等人(2013)所述的，在fcga和fcgb二者被轉(zhuǎn)染到相同細(xì)胞中的情況下，使純化的fc融合蛋白在體外經(jīng)受控制的還原條件，該控制的還原條件將fc-融合物分離成半分子并允許重組和再氧化以形成純的異源二聚體的fc融合分子。

表30.fc融合構(gòu)建體的序列。

由含有fc的多域抗體引起的流感中和

如在實(shí)例6中所述的，在流感病毒中和測(cè)定中測(cè)試經(jīng)純化的含有fc的單域抗體和多域抗體構(gòu)建體，并且這些構(gòu)建體當(dāng)與sdab結(jié)構(gòu)單元相比時(shí)顯示了改進(jìn)的效力和廣度。對(duì)于流感中和fc融合構(gòu)建體的結(jié)果顯示在表31-37中。

表31.sdabfc融合構(gòu)建體的平均中和效價(jià)(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

表32.sdab二聚體fc融合構(gòu)建體的平均中和效價(jià)(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

表33.sdab二聚體fc融合構(gòu)建體的平均中和效價(jià)(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

表34.sdab三聚體fc融合構(gòu)建體的平均中和效價(jià)(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

表35.sdab四聚體fc融合構(gòu)建體的平均中和效價(jià)(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

表36.sdab五聚體fc融合構(gòu)建體的平均中和效價(jià)(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

表37.異源二聚體fc融合構(gòu)建體的平均中和效價(jià)(nm)(空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’)。

功能性fc受體結(jié)合(抗體依賴性細(xì)胞毒性)

使用adcc(抗體依賴性細(xì)胞毒性)報(bào)告生物測(cè)定(普洛麥格公司(promega))測(cè)量與細(xì)胞表達(dá)的人fcγriiia(cd16a)的功能性結(jié)合。使用lipofectamine2000(英杰公司(invitrogen))在opti-memi(吉博科公司(gibco))中，用b/布里斯班/60/2008或b/佛羅里達(dá)/04/2006感染靶a549細(xì)胞，或用編碼h3n2a/威斯康辛/67/2005ha的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染靶a549細(xì)胞。24小時(shí)后，將表達(dá)ha的靶細(xì)胞接種到白色96孔板中，并用fc融合構(gòu)建體或igg對(duì)照抗體的連續(xù)稀釋液孵育30min。使用在fc片段中攜帶lala點(diǎn)突變的構(gòu)建體作為另外的陰性對(duì)照。這些lala點(diǎn)突變(如由hessel等人(2007)所述的l234a、l235a)顯示了顯著降低的與人fcγ受體的結(jié)合和adcc的誘導(dǎo)。最后，將jurkat效應(yīng)子t細(xì)胞(穩(wěn)定表達(dá)fcγriiiav158和nfat-re熒光素酶)添加至靶細(xì)胞中并孵育6h。將bio-glo熒光素酶測(cè)定底物溶液(普洛麥格公司(promega))添加至孔中，并用發(fā)光板讀數(shù)器(珀金埃爾默公司(perkinelmer))測(cè)量發(fā)光(以rlu計(jì))。在spss中使用標(biāo)準(zhǔn)四參數(shù)對(duì)數(shù)非線性回歸模型來擬合rlu數(shù)據(jù)。

所有sd/mdfc融合構(gòu)建體(lala版本除外)顯示強(qiáng)烈的adcc誘導(dǎo)，表明與在細(xì)胞表面的流感ha上的莖部表位的結(jié)合允許與表達(dá)fcγriiia受體的細(xì)胞的生產(chǎn)性相互作用。結(jié)果匯總在表38中。

表38.功能性fc受體結(jié)合(adcc誘導(dǎo))?！?+”是指ec50<0.1μg/ml；“+”是指ec50<0.5μg/ml；“-”是指ec50>0.5μg/ml；空單元格表示‘未經(jīng)測(cè)試的’。

將sdab或sdab多聚體融合到人igg1的fc片段導(dǎo)致ha結(jié)合分子，該ha結(jié)合分子保留所使用的單個(gè)sdab或多域結(jié)構(gòu)單元的中和的效力和廣度。sdab結(jié)構(gòu)單元可以融合到fc片段的n-末端和c-末端。在表達(dá)過程中，兩個(gè)fc鏈形成二價(jià)抗體樣分子。因此，也可能在相同的細(xì)胞中表達(dá)在其sdab或多結(jié)構(gòu)域部分方面有差異的兩種不同的fc鏈構(gòu)建體并產(chǎn)生雙特異性抗體樣分子。已經(jīng)成功地產(chǎn)生了與fc片段的n-末端和/或c-末端附接的具有sdab和/或多結(jié)構(gòu)域的同源二聚體和異源二聚體fc融合構(gòu)建體，并且證明了其跨越a型流感和b型流感的中和的廣度。除了通過sdab或多結(jié)構(gòu)域部分的直接中和之外，當(dāng)在感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面上結(jié)合ha時(shí)，融合構(gòu)建體的fc部分可以促進(jìn)與效應(yīng)細(xì)胞表面上的fcγriiia(cd16a)受體的生產(chǎn)性相互作用。這可以在體內(nèi)導(dǎo)致nk細(xì)胞的激活，并且隨后誘導(dǎo)adcc。在效應(yīng)子功能的誘導(dǎo)之后，該fc部分還可以與新生的fc受體相互作用，導(dǎo)致延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。

實(shí)例10：單域抗體和多域抗體的體內(nèi)功效

a型流感組1單域抗體的體內(nèi)功效

選擇示例性a型流感組1單域抗體sd1016、sd1038和sd1045用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用sd1016、sd1038或sd1045以0.5mg/kg的單次劑量進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。與運(yùn)載體對(duì)照組相比，sd1038和sd1016二者的給予導(dǎo)致在存活比例上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的改善，然而sd1045的給予僅導(dǎo)致在存活時(shí)間上的改善(參見圖2)。

a型流感組2單域抗體的體內(nèi)功效

選擇示例性a型流感組2單域抗體sd1036、sd1046和sd1048用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用sd1046或sd1048以5mg/kg的劑量或用sd1036以2個(gè)劑量(0.5mg/kg或5mg/kg)進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株a/香港/1/1968-ma(h3n2)對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。本研究顯示，sd1036、sd1046或sd1048的鼻內(nèi)給藥提供了針對(duì)a/香港/1/1968-ma病毒的致死性激發(fā)的全面保護(hù)(參見圖3)。

b型流感單域抗體的體內(nèi)功效

選擇示例性b型流感單域抗體sd1083和sd1084用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用sd1084以5mg/kg的單次劑量或用sd1083以2個(gè)劑量(0.5mg/kg或5mg/kg)進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株b/佛羅里達(dá)/4/2006對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。本研究顯示sdabsd1084提供了針對(duì)用b/佛羅里達(dá)/4/2006的致死性激發(fā)的100％保護(hù)，然而sd1083僅提供了在5mg/kg的最高劑量下的部分保護(hù)。較低劑量的sd1083僅導(dǎo)致在存活時(shí)間上的改善(圖4)。

在h1n1模型中a型流感單域抗體和多域抗體的體內(nèi)功效

選擇示例性a型流感sdabsd1038和示例性a型流感多域抗體md1211和md1212用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用md1211或md1212以1mg/kg的劑量或用sd1038(0.5mg/kg)(單獨(dú)或與sd1036以1:1混合(總劑量＝1mg/kg))進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。本研究顯示sd1038、md1211、md1212或者sd1038與sd1036的1:1混合物的鼻內(nèi)給予提供了針對(duì)a/波多黎各/8/1934-ma病毒的致死性激發(fā)的全面保護(hù)。體重曲線表明md1211和md1212的功效優(yōu)于sdab(混合物)的功效(圖5)。

在h3n2模型中a型流感單域抗體和多域抗體的體內(nèi)功效

選擇示例性a型流感sdabsd1036和示例性a型流感多域抗體md1211和md1212用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用md1211或md1212以5mg/kg的劑量或用sd1036(2.5mg/kg)(單獨(dú)或與sd1038以1:1混合(總劑量＝5mg/kg))進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株a/香港/1/1968-ma(h3n2)對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。本研究顯示sd1036、md1211、md1212或者sd1036與sd1038的1:1混合物的鼻內(nèi)給予提供了針對(duì)a/香港/1/1968-ma病毒的致死性激發(fā)的全面保護(hù)。體重曲線表明md1211和md1212的功效優(yōu)于sdab(混合物)的功效(圖6)。

在h3n2模型中sd1038單體和二聚體的體內(nèi)功效的比較

選擇示例性a型流感單域抗體sd1038和示例性a型流感多域抗體md1212用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用sd1038或md1212以4個(gè)劑量(5mg/kg、1.7mg/kg、0.6mg/kg或0.2mg/kg)進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株a/香港/1/1968-ma(h3n2)對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。本研究顯示sd1038僅提供針對(duì)a/香港/1/1968-ma病毒的致死性激發(fā)的部分保護(hù)，并且該保護(hù)水平是劑量依賴性的。與此相反，二聚體sd1038(md1212)在所有4個(gè)劑量組中提供100％保護(hù)(圖7)。

b型流感多域抗體的體內(nèi)功效

選擇示例性b型流感多域抗體md1221、md1222和md1224用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用md1221或md1224以5mg/kg的單次劑量或用md1222以2個(gè)劑量(0.5mg/kg或5mg/kg)進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株b/佛羅里達(dá)/4/2006對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。本研究顯示所有3種多域抗體提供針對(duì)用b/佛羅里達(dá)/4/2006的致死性激發(fā)的100％保護(hù)(圖8)。

在靜脈內(nèi)給予后a型流感和b型流感多域抗體對(duì)抗h1n1的體內(nèi)功效

選擇示例性a型流感和b型流感多域抗體md1301和md2601用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用md1301或md2601以3mg/kg的單次劑量進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。將cr9114作為陽性對(duì)照。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。本研究顯示含有fc的多域抗體md2601在靜脈內(nèi)給予后提供全面保護(hù)，然而不含有fc的md1301對(duì)存活期沒有影響。對(duì)照抗體cr9114僅提供針對(duì)用a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)的致死性激發(fā)的部分保護(hù)(圖9)。

在鼻內(nèi)給予后a型流感和b型流感多域抗體對(duì)抗h1n1的體內(nèi)功效

選擇示例性a型流感和b型流感多域抗體md1301和md2601以及參比抗體cr914用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用md1301、md2601或參比抗體cr9114以3個(gè)劑量(0.2mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg)進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。本研究顯示最小有效劑量(被定義為提供100％保護(hù)的最小劑量)對(duì)于含有fc的抗體md2601和cr9114是0.05mg/kg，并且對(duì)于不含fc的md1301是0.2mg/kg。接受0.05mg/kgcr9114的小鼠與接受相同劑量的md2601的小鼠相比，顯示出更大的體重下降(圖10)。

a型流感和b型流感多域抗體md2617對(duì)抗h1n1的體內(nèi)功效

選擇示例性多域抗體md2617用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用md2617以0.2mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg進(jìn)行鼻內(nèi)給藥，或以3mg/kg、1mg/kg或0.3mg/kg進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。與運(yùn)載體對(duì)照組相比，將md2617以0.2mg/kg的劑量鼻內(nèi)給予或以3mg/kg靜脈內(nèi)給予導(dǎo)致在存活比例上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的改善(圖11)。

a型流感和b型流感多域抗體md2617對(duì)抗h3n2和b型佛羅里達(dá)的體內(nèi)功效

選擇示例性多域抗體md2617用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用md2617以0.5mg/kg進(jìn)行鼻內(nèi)給藥或以2mg/kg進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。將以2mg/kg靜脈內(nèi)給藥的cr9114作為陽性對(duì)照。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的a/香港/1/1968-ma(h3n2)或b/佛羅里達(dá)/4/2006對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。與運(yùn)載體對(duì)照組相比，md2617的鼻內(nèi)給予和靜脈內(nèi)給予導(dǎo)致在存活比例上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的改善。

在鼻內(nèi)給予后a型流感和b型流感多域抗體md2407和md3606對(duì)抗b型佛羅里達(dá)的體內(nèi)功效

選擇示例性多域抗體md2407和md3606以及參比抗體cr9114用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用md2407、md3606或cr9114以3個(gè)劑量(0.02mg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg)進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株b/佛羅里達(dá)/4/2006對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。與運(yùn)載體對(duì)照組相比，0.02mg/kg、0.1mg/kg和0.5mg/kg的md2407和md3606的給予導(dǎo)致在存活比例上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的改善，然而以0.1mg/kg和0.5mg/kg的cr9114的給予僅導(dǎo)致在存活比例上的改善(圖13)。

在靜脈內(nèi)給予后a型流感和b型流感多域抗體md3606對(duì)抗b型佛羅里達(dá)的體內(nèi)功效

選擇示例性多域抗體md3606和參比抗體cr9114用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用md3606或cr9114以3個(gè)劑量(0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg)進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株b/佛羅里達(dá)/4/2006對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。本研究顯示md3606在低至1mg/kg的劑量提供針對(duì)b/佛羅里達(dá)/4/2006的全面保護(hù)。與此相反，參比抗體cr9114在5mg/kg的最高劑量處僅提供部分保護(hù)(圖14)。

在鼻內(nèi)給予后a型流感和b型流感多域抗體md2407和md3606對(duì)抗h3n2的體內(nèi)功效

選擇示例性多域抗體md2407、md3606和參比抗體cr9114用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用md2407、md3606和cr9114以3個(gè)劑量(0.02mg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg)進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株a/香港/1/1968-ma(h3n2)對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。本研究顯示md2407和cr9114分別在低至0.1mg/kg和0.5mg/kg的劑量提供針對(duì)a/香港/1/1968-ma的全面保護(hù)。md3606甚至在0.02mg/kg的最低劑量處提供全面保護(hù)(圖15)。

在靜脈內(nèi)給予后a型流感和b型流感多域抗體md3606對(duì)抗h3n2的體內(nèi)功效

選擇示例性多域抗體md3606和參比抗體cr9114用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用md3606或cr9114以3個(gè)劑量(0.6mg/kg、1.7mg/kg或5mg/kg)進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株a/香港/1/1968-ma(h3n2)對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。與運(yùn)載體對(duì)照組相比，在低至1.7mg/kg的劑量的md3606和cr9114的給予導(dǎo)致在存活比例上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的改善。用5mg/kg或1.7mg/kgmd3606處理的小鼠比用相同劑量的cr9114處理的小鼠顯示出更小的體重下降(圖16)。

在鼻內(nèi)給予后a型流感和b型流感多域抗體md2407和md3606對(duì)抗h1n1的體內(nèi)功效

選擇示例性多域抗體md2407、md3606和參比抗體cr9114用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用md2407、md3606或cr9114以3個(gè)劑量(0.02mg/kg、0.1mg/kg或0.5mg/kg)進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。與運(yùn)載體對(duì)照組相比，0.25mg/kg和0.05mg/kg的md2407或cr9114的給予導(dǎo)致在存活比例上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的改善，然而對(duì)于md3606在低至0.01mg/kg的最低劑量處該改善是顯著的(圖17)。

在靜脈內(nèi)給予后a型流感和b型流感多域抗體md3606對(duì)抗h1n1的體內(nèi)功效

選擇示例性多域抗體md3606和參比抗體cr9114用于使用balb/c小鼠的體內(nèi)流感中和研究。簡(jiǎn)言之，對(duì)6-8周齡的雌性balb/c小鼠(n＝8)用md3606或cr9114以3個(gè)劑量(0.6mg/kg、1.7mg/kg或5mg/kg)進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。僅接受緩沖溶液的另一組8只小鼠充當(dāng)運(yùn)載體對(duì)照組。給予后一天，用25xld50的流感株a/波多黎各/8/1934-ma(h1n1)對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)激發(fā)。感染后對(duì)存活率和體重監(jiān)測(cè)21天。與運(yùn)載體對(duì)照組相比，1.7mg/kg和5mg/kgmd3606以及5mg/kgcr9114的給予導(dǎo)致在存活比例上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的改善(圖18)。

實(shí)例11：sdab人源化

將sdabsd1036、sd1038、sd1046、sd1083、sd1084和sd1087的蛋白質(zhì)序列針對(duì)imgt人v基因數(shù)據(jù)庫(http://www.imgt.org)進(jìn)行檢索。隨后將每個(gè)sdab與最同源的人v基因序列進(jìn)行比對(duì)。將每個(gè)sdab的fr4序列與人j共有序列wgqgtlvtvss進(jìn)行比對(duì)。相對(duì)于比對(duì)的人v和j序列，sdab框架區(qū)(fr)中的氨基酸差異顯示在表39中。

表39.相對(duì)于最接近的人v基因序列和共有j序列在框架區(qū)中的氨基酸差異

隨后制備了多個(gè)系列的sdab變體，其中非人fr殘基的不同組合被其人源等同物置換。fr2中的殘基37、44、45和47以及fr4中的殘基103保留在所有變體中。兩個(gè)met殘基(一個(gè)位于sd1087的cdr2中，另一個(gè)位于sd1038的cdr3中)也被突變，目的是去除潛在的met氧化位點(diǎn)。sdabsd1036、sd1038、sd1046、sd1083、sd1084和sd1087的所有變體的氨基酸序列在表40中列出。分析人源化sdab變體的溫度穩(wěn)定性、表達(dá)水平(在hek293細(xì)胞中)、和體外中和活性。使用dsc通過測(cè)量其解鏈溫度來評(píng)估所選擇的sdab的溫度穩(wěn)定性。在標(biāo)準(zhǔn)的3天vna中，使用mdck細(xì)胞和流感病毒的近似100tcid50確定體外中和活性。將ic50值、解鏈溫度和表達(dá)水平在表41-43中列出。相對(duì)于比對(duì)的人v和j序列以及所計(jì)算的％fr一致性，還列出了在sdab框架區(qū)(fr)中氨基酸差異的數(shù)目。

表40.本發(fā)明的人源化結(jié)合分子的序列

表41.人源化b型流感sdab的平均中和效價(jià)(nm)、hek293表達(dá)水平、溫度穩(wěn)定性、和序列的特征(空單元格表示‘未確定的’)

表42.人源化a型流感sdabsd1036和sd1046的平均中和效價(jià)(nm)、hek293表達(dá)水平、溫度穩(wěn)定性和序列特征(空單元格表示‘未確定的’)

表43.人源化a型流感sdabsd1038的平均中和效價(jià)(nm)、hek293表達(dá)水平、溫度穩(wěn)定性和序列特征(空單元格表示‘未確定的’)

sd1036的人源化：

對(duì)于sd1036制備了11種人源化變體。相比親本sdab，這些變體中的若干種顯示出相等或在某些情況下甚至更好的中和活性。在表達(dá)水平中沒有觀察到主要差異，然而對(duì)于大多數(shù)sd1036變體，解鏈的起始溫度增加了。選擇變體sd3097作為最終人源化變體，因?yàn)槠渚哂凶畹蛿?shù)量的相對(duì)于人類種系的fr突變、高tm起始值，并且另外顯示對(duì)所測(cè)試的所有組2流感株的有效中和。

sd1038的人源化：

對(duì)于sd1038制備了21種人源化變體。除了sd3031-33之外，所有變體顯示出與親本sdab相似的針對(duì)4個(gè)組1株的中和活性。對(duì)于大多數(shù)的sd1038變體，針對(duì)h3株a/布里斯班/10/07和a/香港/1/68的ic50值略高。選擇變體sd3119作為最終人源化變體，因?yàn)槠渚哂凶畹蛿?shù)量的相對(duì)于人類種系的fr突變、高tm起始值，并且顯示對(duì)所測(cè)試的所有流感株的有效中和。在該變體中，cdr3中的met被ile置換。

sd1046的人源化：

對(duì)于sd1046制備了11種人源化變體。與親本sdab相比，第一系列變體顯示出強(qiáng)烈降低的中和活性。制備了第二系列變體，其在vna中顯示出與sd1046非常相似的活性。在這些變體中，選擇sd3099作為最終人源化變體，因?yàn)槠渚哂凶畹蛿?shù)量的相對(duì)于人類種系的fr突變，并且顯示出高的溫度穩(wěn)定性。

sd1083的人源化：

對(duì)于sd1083制備了10種人源化變體。這些變體中的若干種在hek293細(xì)胞中顯示出低的表達(dá)水平，并且其中有2種變體根本沒有表達(dá)。在表達(dá)良好的3種變體中，選擇sd3087作為最終人源化變體。該sdab在vna中比親本sd1083更有效力，并且具有實(shí)質(zhì)更高的tm起始值。

sd1084的人源化：

對(duì)于sd1084制備了6種人源化變體。這些變體中的四種在vna中顯示出與親本sdab相似的中和活性。在這些變體中，選擇sd3085作為最終的人源化變體，因?yàn)樗哂凶罡叩膖m起始值和僅2個(gè)相對(duì)于人類種系的fr突變。

sd1087的人源化：

對(duì)于sd1087制備了23種人源化變體。第一系列的8種變體在vna中沒有顯示出針對(duì)2種b型流感株的可測(cè)量的活性。制備了第二系列的sdab，其包括顯示與sd1087類似的ic50值的許多變體。這些變體的溫度穩(wěn)定性低于親本分子。在vna中，在cdr2中含有met的取代的變體均不顯示活性。選擇sd3093作為最終的人源化變體，因?yàn)樗鼉H顯示適度的tm起始值的降低，并且其在vna中的活性等于sd1087的活性。

實(shí)例12：人源化sdab多聚體fc融合構(gòu)建體的產(chǎn)生和特征

fc融合構(gòu)建體的產(chǎn)生

將在實(shí)例11中所描述的人源化sdab變體用于產(chǎn)生多聚體fc融合構(gòu)建體。將這些人源化多聚體結(jié)合分子(即包括至少兩個(gè)人源化sdab的多聚體結(jié)合分子)直接與fc區(qū)的n-末端融合。fc融合構(gòu)建體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，并作為二聚體fc分子分泌到培養(yǎng)基中。fc融合構(gòu)建體的完整氨基酸序列顯示在表44中。產(chǎn)生同源二聚體以及異源二聚體的fc融合分子。如由labrijn等人(2013)所述通過在2條fc鏈的ch3結(jié)構(gòu)域中引入單點(diǎn)突變(k409r和f405l)，或如在ep0812357b1和ep0979281b1中所述通過引入突出物入洞(knob-into-holes)突變產(chǎn)生異源二聚體fc融合。

將編碼人源化sdab多聚體fc融合蛋白的基因構(gòu)建體進(jìn)行密碼子優(yōu)化用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，并且接合到lonzapee12.4載體中。將這些表達(dá)載體(其利用cd4hc信號(hào)肽)進(jìn)行擴(kuò)增、純化、并在無菌水中濃縮至終濃度>5mg/ml，用于使用電穿孔的cho細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染。通過將等量的編碼2條單獨(dú)的鏈的載體共轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生異源二聚體fc融合蛋白。使用如上所述的單一載體構(gòu)建體產(chǎn)生同源二聚體fc融合蛋白。使用標(biāo)準(zhǔn)的懸浮相搖瓶方法使細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)。將過濾的培養(yǎng)物上清液應(yīng)用至hitrapmabselectsure柱上，用pbs洗滌，用0.1m乙酸鈉(ph3.5)洗脫，用2.5mtrisph7.2中和，并在dpbs中透析。

表44.人源化sdab多聚體fc融合構(gòu)建體的氨基酸序列

由人源化sdab多聚體fc融合蛋白引起的流感中和

如在實(shí)例6中所述的在流感病毒中和測(cè)定中測(cè)試純化的fc融合蛋白，并且這些fc融合蛋白當(dāng)與對(duì)應(yīng)的野生型版本相比時(shí)顯示了相似的效力和廣度。將對(duì)不同流感株的平均中和效價(jià)匯總在表45中。

表45.人源化sdab多聚體fc融合構(gòu)建體的平均中和效價(jià)(nm)

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