長牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種長牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3) 重組蛋白的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] C型凝集素是一類重要的模式識別受體，在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。糖類 識別結(jié)構(gòu)域（CRD)是C型凝集素的重要功能區(qū)域，以鈣離子依賴的形式識別并結(jié)合糖蛋白。 典型的CRD通常由大約130個氨基酸組成，呈長形雙環(huán)結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)上部由4個0片層 構(gòu)成，下部則包含兩個a螺旋和四個0片層。四個保守的Cys(Cl-C4)形成環(huán)基部的兩 個二硫鍵。經(jīng)研宄表明，C型凝集素在固有免疫應(yīng)答反應(yīng)中不僅作為模式識別分子參與識 別并結(jié)合入侵病原，同時也可作為效應(yīng)分子在清除病原微生物過程中發(fā)揮重要作用，例如C 型凝集素能抑制微生物生長，破壞微生物細(xì)胞壁，促進(jìn)吞噬、結(jié)節(jié)形成及激活補(bǔ)體。C型凝集 素的抑菌活性首先在小鼠中被發(fā)現(xiàn)，隨后在文昌魚、小龍蝦中也有類似報道。
[0003] 長牡蠣是世界上重要的養(yǎng)殖貝類之一，在我國經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展中占據(jù)重要地位。 長牡蠣常棲息在潮間帶及淺海的巖礁海底，時刻面臨各種病原微生物的侵襲。近年來，頻繁 爆發(fā)的養(yǎng)殖牡蠣大規(guī)模死亡事件造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。作為缺乏獲得性免疫的無脊椎動 物，識別并清除有害非己成分的能力顯得尤為重要。因此，牡蠣C型凝集素功能的研宄可為 養(yǎng)殖牡蠣的病害防治提供支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明在于提供一種長牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] 一種長牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用，長牡蠣C型凝集 素-3 (CgCLec-3)重組蛋白用于制備抑菌劑。
[0007] 所述長牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用制備抑制抗大腸桿菌或金 黃色葡萄球菌的抑菌劑。
[0008] 所述長牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用制備破壞金黃色葡萄球菌 細(xì)胞的制劑。
[0009] 所述長牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白是在CgCLec-3開放閱讀框的兩端 分別設(shè)計含有限制性酶切位點(diǎn)的引物（序列為5' -CGCGGATCCATGGGTGCCAACTCCATTG-3'和 5' -CCCAAGCTITTAITGCGTGITCCTCTCGC-3'），以pET-32a原核表達(dá)載體為重組載體模板，而 后通過PCR擴(kuò)增獲得編碼區(qū)基因，并將其克隆到pET-32a表達(dá)載體中，隨后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大 腸桿菌Transetta(DE3)中實(shí)現(xiàn)原核體外重組表達(dá)。
[0010] 所述重組產(chǎn)物經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠柱純化，透析復(fù)性。
[0011] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：
[0012] 本發(fā)明利用體外重組表達(dá)技術(shù)獲得了長牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)蛋白，所得 長牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)，具有非典型CRD，只包含四個e片層組成，且只有一個二 硫鍵。本發(fā)明重組蛋白對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌有抑制生 長作用且對金黃色葡萄球菌的細(xì)胞有破壞作用，在開發(fā)抗菌類藥物、新型免疫制劑以及飼 料添加劑等方面具有潛在應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的長牡蠣重組蛋白CgCLec-3對大腸桿菌的生長的影響。
[0014] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的長牡蠣重組蛋白CgCLec-3對金黃色葡萄球菌的生長 的影響。
[0015] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的長牡蠣重組蛋白CgCLec-3對金黃色葡萄球菌細(xì)胞的 破壞。
【具體實(shí)施方式】：
[0016] 下面的實(shí)驗例中將對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0017] 實(shí)施例1 :
[0018] 長牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)基因編碼區(qū)的體外原核重組表達(dá)
[0019] 1、重組載體的構(gòu)建
[0020] 本發(fā)明以pET_32a原核表達(dá)載體為重組載體模板。通過PCR技術(shù)，采用5'末端分 別添加了BamHI和HindIII特定酶切位點(diǎn)的基因特異性引物：
[0021] Pl(5, -CGCGGATCCATGGGTGCCAACTCCATTG-3,）：
[0022] P2(5'-CCCAAGCTTTTATTGCGTGTTCCTCTCGC-3'），
[0023] 反應(yīng)條件為：首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)：94°C變性30秒，55°C退 火30秒，72°C延伸45秒，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。將擴(kuò)增片段純化回收， 與PMD19-T載體連接。轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒；使用BamHI和HindIII兩個酶酶切 質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒（大連寶生物工程有限公司）對酶切產(chǎn)生的目的片段純化回收； 回收目的片段與經(jīng)BamHI和HindIII兩個酶酶切的表達(dá)載體pET-32a連接，完成載體的構(gòu) 建。上述實(shí)驗操作的具體方法請參照《分子克隆第三版》。
[0024] 2、重組蛋白的表達(dá)
[0025] 將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌大腸桿菌Transetta(DE3)中，并篩選陽性 克隆，測序確認(rèn)表達(dá)框的正確性。挑取單克隆，接種于200mL的LB液體培養(yǎng)基中，220rpm， 37°C培養(yǎng)至OD600 = 0. 4-0. 8。加入IPTG，使終濃度達(dá)到lmmolL'繼續(xù)培養(yǎng)4小時。4°C， 5000rpm，離心10分鐘，收集菌體，于-20°C凍存?zhèn)溆?。取ImL菌液離心，棄去上清后，加入 80yL水和20yL的5倍的蛋白上樣緩沖液，100°C煮沸10分鐘，稍離心，利用SDS-PAGE檢 測表達(dá)產(chǎn)物。
[0026] 3、重組蛋白CgCLec-3的純化與復(fù)性
[0027] 本發(fā)明中重組蛋白采用鎳瓊脂糖凝膠FF柱純化，獲得的變性重組蛋白采用透析 緩沖液透析復(fù)性。具體操作步驟如下：
[0028] (1)鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱（I. 6X20cm)，柱床體積為IOmL;
[0029] (2)用緩沖液I(50mmolL-1Tris-Hcl緩沖液，pH= 7. 4, 50mmolL-1NaCl, 8molI71 尿素）平衡2-5個床體積，流速為2mLmirT1;
[0030] (3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞，用緩沖液I重懸，150瓦超聲破碎30分鐘，12000轉(zhuǎn)， 4°C離心30分鐘，上清液用0. 45ym濾膜過濾后，過柱，流速為ImLmirT1;
[0031] (4)用緩沖液1再洗2-5個床體積，流速為2mLmirT1;
[0032] (5)用有50mmolT1咪唑的緩沖液I再洗2-5個柱床體積，流速為2mLmin
[0033] (6)用400mmolI71咪唑的緩沖液I洗脫目的蛋白，收集。
[0034] (7)用SDS-PAGE檢測獲得的蛋白分子量和純度；
[0035] (8)變性純化產(chǎn)物采用不同濃度尿素的透析液進(jìn)行復(fù)性（透析液含2mM還原谷胱 甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽、ImMEDTA、50mMTris-HClUOOmMNaCl、10%甘油、1%甘氨酸， 口117.5~8.0，尿素濃度從起始的611逐漸替換到411、311、211、說、(^最后一次透析1^8緩沖 液中（50mMTris-HCl，IOOmMNaCl，pH7. 5 ~8. 0)。每次在 4°C透析 12h，用SDS-PAGE檢測 復(fù)性后蛋白分子量和純度，確認(rèn)得到長牡蠣CgCLec-3基因重組蛋白。
[0036] 實(shí)施例2 :
[0037] 長牡蠣CgCLec-3重組蛋白的抑菌活性檢測
[0038] 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別用LB培養(yǎng)基37°C，220rpm，培養(yǎng)至對數(shù)生長期， 所得菌體分別經(jīng)離心收集后用TBS(50mMTris-Hcl，IOOmMNaCl，pH= 8. 0)進(jìn)行洗滌并重 懸至濃度l〇4CFU。
[0039] 將上述或得到的50yL的長牡嫩重組蛋白CgCLec-3 (2mgml/1或者4mg與等 體積的大腸桿菌或金黃色葡萄球菌重懸液在CaCl2終濃度IOmM的條件下室溫孵育2h。取 20yL上述混合物于平底96孔板（Costar，F(xiàn)isher)中，每孔加入200yLLB液體培養(yǎng)基， 于酶標(biāo)儀中37°C振蕩培養(yǎng)，每隔Ih分別檢測記錄各孔0D600值。另設(shè)rTrx蛋白對照組和 TBS空白對照組。每個樣品設(shè)三個重復(fù)，根據(jù)3次測定結(jié)果取平均值作圖（參見圖1和圖 2)。實(shí)驗表明濃度為4mgml/1的重組CgCLec-3蛋白能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌 的生長；CgCLec-3蛋白濃度為2mgml/1時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長抑制作用不 顯著。
[0040] 實(shí)施例3 :
[0041] 重組蛋白CgCLec-3對金黃色葡萄球菌細(xì)胞的破壞作用的測定
[0042] 將上述實(shí)施例2中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌離心收集后用TBS清洗重 懸（IO4CFU)。同時將上述獲得50yL的長牡蠣重組蛋白CgCLec-3 (4mgml/1)與等體積金黃 色葡萄球菌重懸液在CaCl2終濃度IOmM的條件下室溫孵育2h。設(shè)立TBS空白對照和rTrx 陰性對照。將孵育后的菌徹底清洗后離心收集。用2. 5%戊二醛于4°C固定24h后，將菌 用TBS徹底清洗并重懸于TBS中，滴于24X24mm蓋玻片上。在2. 5%戊二醛中固定Ih后， 將蓋玻片在TBS中漂洗lOmin，再用乙酸戊酯清洗30min。梯度酒精脫水后，烘干樣品并鍍 金。該樣品在KYKY-2800B掃描電鏡下觀察拍照（KYKY，Beijing，China)。實(shí)驗結(jié)果表明重 組CgCLec-3蛋白能夠破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞（參見圖3)。
【主權(quán)項】
1. 一種長牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于：長牡蠣C型凝 集素-3(CgCLec-3)重組蛋白用于制備抑菌劑。2. 按權(quán)利要求1所述的長牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用，其特征在 于：所述長牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用制備抑制抗大腸桿菌或金黃色葡 萄球菌的抑菌劑。3. 按權(quán)利要求1所述的長牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用，其特征在 于：所述長牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用制備破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞的 制劑。4. 按權(quán)利要求1、2或3所述的長牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用，其特 征在于：所述長牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白是在CgCLec-3開放閱讀框的兩端 分別設(shè)計含有限制性酶切位點(diǎn)的引物，而后通過PCR擴(kuò)增獲得編碼區(qū)基因，并將其克隆到 pET-32a表達(dá)載體中，隨后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大腸桿菌Transetta (DE3)中實(shí)現(xiàn)原核體外重組表 達(dá)。5. 按權(quán)利要求4所述的長牡蠣C型凝集素-3 (CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用，其特征在 于：所述重組產(chǎn)物經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠柱純化，透析復(fù)性。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種長牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白的應(yīng)用。長牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)重組蛋白用于制備抑菌劑。本發(fā)明利用體外重組表達(dá)技術(shù)獲得了長牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)蛋白，所得長牡蠣C型凝集素-3(CgCLec-3)，具有非典型CRD，只包含四個β片層組成，且只有一個二硫鍵。本發(fā)明重組蛋白對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌有抑制生長作用且對金黃色葡萄球菌的細(xì)胞有破壞作用，在開發(fā)抗菌類藥物、新型免疫制劑以及飼料添加劑等方面具有潛在應(yīng)用價值。
【IPC分類】A61K38/57, A61P31/04
【公開號】CN104888205
【申請?zhí)枴緾N201510333344
【發(fā)明人】宋林生, 李慧, 張峘, 劉瑞, 賈志浩, 王玲玲
【申請人】中國科學(xué)院海洋研究所
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年6月16日