背景技術(shù)：
：自從人源化的抗體出現(xiàn)以來，抗體例如(利妥昔單抗)、(曲妥單抗)和(貝伐單抗)的治療應(yīng)用，已在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，包括腫瘤學(xué)、炎性紊亂(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，和許多其它適應(yīng)癥)的治療方面掀起革命。在美國，超過30種人抗體或人源化的抗體已獲批用于臨床應(yīng)用，并且，有超過600種新抗體或抗體樣分子正處于開發(fā)的各種階段。一些抗體對于可溶性靶標(biāo)分子具有拮抗功能，所述可溶性靶標(biāo)分子例如血管內(nèi)皮生長因子(vegf)或腫瘤壞死因子(tnf)，它們的作用是疾病的病理過程的部分。或者，抗體能夠結(jié)合、阻斷和/或誘導(dǎo)某些疾病(例如癌癥)中的病理細(xì)胞的破壞。這些治療抗體的主要功能是通過fab區(qū)的結(jié)合，以及通過fc結(jié)構(gòu)域(其還介導(dǎo)抗體的長循環(huán)半衰期)招募效應(yīng)物功能。相較于小分子藥物，抗體的一個(gè)主要優(yōu)勢可能是它們的精準(zhǔn)的特異性?？贵w能夠十分準(zhǔn)確地靶向選定的蛋白質(zhì)抗原，例如致癌基因，以排除極其類似的同系物，這允許良性安全性的概況。因此，抗體的特異性單一靶向功能被充分表征。隨著該領(lǐng)域的進(jìn)展，抗體功能已通過如下方式而被增加：例如，蛋白質(zhì)工程改造的創(chuàng)新性手段，以提供更高的親和性、更長的半衰期，和/或更好的組織分布，以及用于增加通過毒性凈負(fù)荷遞送(例如抗體-藥物偶聯(lián)物)的細(xì)胞破壞的集中性小分子和大分子技術(shù)的組合。用于改善抗體功能的另一種方法利用了免疫球蛋白a(iga)或免疫球蛋白m(igm)結(jié)構(gòu)的多價(jià)結(jié)合能力，這允許一個(gè)iga或igm分子結(jié)合多重抗原。感興趣的重鏈和輕鏈可變區(qū)可被表達(dá)為iga或igm同種型抗體，由此產(chǎn)生與單體抗體，例如，igg抗體，具有相同的特異性的多聚結(jié)合分子。iga或igm分子的多價(jià)性質(zhì)呈現(xiàn)了用于其中必須同時(shí)結(jié)合多重組分以傳遞生物信號的特定生物系統(tǒng)的應(yīng)用的有用的工具。例如，真核細(xì)胞表面上的許多受體蛋白需要多重單體或亞基的同時(shí)活化，以實(shí)現(xiàn)跨過細(xì)胞膜的生物信號的活化和傳遞至該細(xì)胞的胞質(zhì)。在活化之前或與活化相應(yīng)地需要多聚化的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)受體的一個(gè)這樣的系統(tǒng)存在于受體蛋白的腫瘤壞死因子(tnf)超家族中。該受體蛋白的超家族中包括這樣的成員，它們在活化之后，將信號傳遞至造成凋亡的細(xì)胞的核。該超家族的其它家族成員造成nf-κb、凋亡途徑、胞外信號調(diào)節(jié)性激酶(erk)、p38分裂素活化的蛋白質(zhì)激酶(p38mapk)和c-junn末端激酶(jnk)的活化?；罨瘯r(shí)調(diào)節(jié)所述細(xì)胞的凋亡的tnf超家族受體成員的示例如下：tnfr1(dr1)、tnfr2、tnfr1/2、cd40(p50)、fas(cd95、apo1、dr2)、cd30、4-1bb(cd137、ila)、trailr1(dr4、apo2)、dr5(trailr2)、trailr3(dcr1)、trailr4(dcr2)、opg(ocif)、tweakr(fn14)、lightr(hvem)、dcr3、dr3、edar和xedar。(參見，aggarwal等，blood,119:651-665,2012)。更具體地，假設(shè)了上述的tnf超家族受體蛋白成員的活化需要，例如，通過配體，使至少三個(gè)非相互作用受體單體被交聯(lián)，以形成穩(wěn)定的受體三聚體，導(dǎo)致跨過細(xì)胞膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。已觀察到這些tnf超家族受體蛋白三聚體簇集成三聚體的“筏(raft)”，并且已假設(shè)其導(dǎo)致該tnf超家族受體蛋白依賴型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的更有效活化。(參見，valley等，j.biol.chem.,287(25):21265-21278,2012)。已討論了活化的其它模式。(參見，例如，lewis等，biophys.j.,106(6):l21-l24,2014)。通過如上所述的tnf超家族受體蛋白中的某些的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠?qū)е录?xì)胞凋亡。在癌癥治療中，一個(gè)治療策略是使癌細(xì)胞中的凋亡性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)活化，由此截停進(jìn)展。能夠完成該目的的一個(gè)方式是通過在癌細(xì)胞中表達(dá)的(或過表達(dá)的)tnf超家族受體蛋白與多價(jià)或多聚激動(dòng)劑結(jié)合分子的結(jié)合，這能夠促進(jìn)受體三聚化和活化，導(dǎo)致凋亡。在交聯(lián)后活化導(dǎo)致凋亡的一個(gè)tnf超家族受體蛋白是dr5(trailr2)。提高了對于dr5的興趣，這是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)其在多種癌中的表達(dá)水平高于正常組織，所述癌癥例如膀胱癌(y等，urology，79(4):968.e7-15,2012)、胃癌(lim等，carcinogen.,32(5):723-732,2011)、卵巢癌(jiang等，mol.med.rep.,6(2):316-320,2012)、胰腺導(dǎo)管腺癌(rajeshkumar等，mol.cancerther.,9(9):2583-92,2010)、口鱗狀細(xì)胞癌(chen等，oncotarget4:206-217,2013)和非小細(xì)胞肺癌(reck等，lungcanc.,82(3):441-448,2013)。其對于醫(yī)學(xué)界的另一個(gè)重要性是，觀察到該受體蛋白家族，尤其是家族成員dr5，在最難以檢測和治療癌癥的一些(例如胰腺癌和胃癌)中具有較高表達(dá)水平。盡管已發(fā)現(xiàn)某些單克隆抗體，例如替加珠單抗(cs-1008，第一三共株式會社(daiichisankyoco.ltd.)，公開于美國專利號7,244,429，vh和vl在本文中分別示為seqidno:7和seqidno:8)在體外和體內(nèi)是有效的，甚至不用添加其它交聯(lián)劑，但這些抗體不曾導(dǎo)致顯著臨床功效。(參見，reck等，2013)。所述抗dr5激動(dòng)性的單克隆igg抗體的示例是：可那木單抗(conatumumab)(amgen，描述于美國專利號7,521,048，vh和vl在本文中分別示為seqidno:5和seqidno:6)、多茲圖單抗(drozitumab)(genentech，描述于美國專利號8,029,783，vh和vl在本文中分別示為seqidno:3和seqidno:4)，和來沙木單抗(lexatumumab)(humangenomesciences，公開于美國專利申請公開號2006/0269555，vh和vl在本文中分別示為seqidno:1和seqidno:2)。需要更好的結(jié)合分子來實(shí)現(xiàn)進(jìn)行的基礎(chǔ)研究的益處，其提供關(guān)于tnf超家族受體蛋白的該子集的關(guān)鍵理解。本文中公開了其它結(jié)合分子，基于對受體蛋白tnf超家族的潛在的生化機(jī)制的理解，它們能夠滿足該需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供多聚結(jié)合分子，例如，二聚、五聚或六聚結(jié)合分子，其包括兩個(gè)、五個(gè)或六個(gè)二價(jià)結(jié)合單元或其變體或片段，其中各結(jié)合單元包括兩個(gè)iga或igm重鏈恒定區(qū)或其片段，各自與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)，其中，該結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少三個(gè)特異性且競爭性地結(jié)合至腫瘤壞死因子(tnf)超家族受體蛋白，其能夠誘導(dǎo)表達(dá)所述tnf超家族受體蛋白的細(xì)胞的凋亡，并且其中，所述結(jié)合分子能交聯(lián)在細(xì)胞表面上表達(dá)的至少三個(gè)相同的tnf超家族受體蛋白，由此誘導(dǎo)所述細(xì)胞的凋亡。在某些方面中，本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子能以高于等量的二價(jià)igg抗體或其片段的效能誘導(dǎo)表達(dá)tnf超家族受體的細(xì)胞中的tnf超家族受體介導(dǎo)的凋亡，其還特異性地結(jié)合至并激動(dòng)相同的tnf超家族受體蛋白。在某些方面中，特異性結(jié)合至并激動(dòng)tnf超家族受體蛋白的三個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域不與其它tnf超家族受體蛋白交叉反應(yīng)。在某些方面中，特異性結(jié)合至并激動(dòng)tnf超家族受體蛋白的三個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域能與其它tnf超家族受體蛋白交叉反應(yīng)。在某些方面中，本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子可包括至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)、至少十個(gè)、至少十一個(gè)，或十二個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性且競爭性地結(jié)合至在所述細(xì)胞的表面表達(dá)的tnf超家族受體蛋白，由此誘導(dǎo)所述細(xì)胞的凋亡。在某些方面中，所述至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)、至少十個(gè)、至少十一個(gè)，或十二個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合至在所述細(xì)胞的表面表達(dá)的單一類型的tnf超家族受體分子的相同的胞外表位。在某些方面中，至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)、至少十個(gè)、至少十一個(gè)，或十二個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域各自特異性結(jié)合在所述細(xì)胞的表面表達(dá)的單一類型的tnf超家族受體分子的兩個(gè)或更多個(gè)不同的胞外表位的組中的一種。本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子的結(jié)合單元可以是人、人源化或嵌合免疫球蛋白結(jié)合單元。在某些方面中，本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子能夠結(jié)合至，但不限于，tnfr1(dr1)、tnfr2、tnfr1/2、cd40(p50)、fas(cd95、apo1、dr2)、cd30、4-1bb(cd137、ila)、trailr1(dr4、apo2)、trailr2(dr5)、trailr3(dcr1)、trailr4(dcr2)、opg(ocif)、tweakr(fn14)、lightr(hvem)、dcr3、dr3、edar和xedar。在某些方面中，所述結(jié)合分子包括能夠特異性且競爭性地結(jié)合至dr5的至少三個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些方面中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域不結(jié)合至dr4、dcr1或dcr2。在某些方面中，所述結(jié)合分子包括還能特異性結(jié)合至dr4的至少三個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些方面中，dr5在癌細(xì)胞上表達(dá)。在某些方面中，提供二聚、五聚或六聚結(jié)合分子，其中至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)、至少十個(gè)、至少十一個(gè)，或十二個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)，其中，所述vh和vl包括六個(gè)免疫球蛋白互補(bǔ)決定區(qū)hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中，所述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3包括：分別包含vh和vl氨基酸序列seqidno:1和seqidno:2；seqidno:3和seqidno:4；seqidno:5和seqidno:6；seqidno:7和seqidno:8；seqidno:9和seqidno:10；seqidno:11和seqidno:12；seqidno:13和seqidno:14；seqidno:15和seqidno:16；seqidno:17和seqidno:18；seqidno:19和seqidno:20；seqidno:21和seqidno:22；seqidno:23和seqidno:24；seqidno:25和seqidno:26；seqidno:27和seqidno:28；seqidno:29和seqidno:30；seqidno:31和seqidno:32；seqidno:33和seqidno:34；seqidno:35和seqidno:36；seqidno:37和seqidno:38；seqidno:39和seqidno:40；seqidno:41和seqidno:42；seqidno:43和seqidno:44；seqidno:45和seqidno:46；seqidno:47和seqidno:48；seqidno:49和seqidno:50；seqidno:51和seqidno:52；seqidno:53和seqidno:54；seqidno:55和seqidno:56；seqidno:82和seqidno:83；seqidno:84和seqidno:85；seqidno:86和seqidno:87；或seqidno:88和seqidno:89的抗體的cdr；或者scfv序列seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:63、seqidno:64、seqidno:65、seqidno:66、seqidno:67、seqidno:68、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72或seqidno:73的cdr，或者所述六個(gè)cdr在所述cdr中的一個(gè)或多個(gè)中具有一個(gè)或兩個(gè)氨基酸取代。在某些方面中，提供二聚、五聚或六聚結(jié)合分子，其中至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)、至少十個(gè)、至少十一個(gè)，或十二個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體vh和vl，其中，所述vh和vl包括分別與seqidno:1和seqidno:2；seqidno:3和seqidno:4；seqidno:5和seqidno:6；seqidno:7和seqidno:8；seqidno:9和seqidno:10；seqidno:11和seqidno:12；seqidno:13和seqidno:14；seqidno:15和seqidno:16；seqidno:17和seqidno:18；seqidno:19和seqidno:20；seqidno:21和seqidno:22；seqidno:23和seqidno:24；seqidno:25和seqidno:26；seqidno:27和seqidno:28；seqidno:29和seqidno:30；seqidno:31和seqidno:32；seqidno:33和seqidno:34；seqidno:35和seqidno:36；seqidno:37和seqidno:38；seqidno:39和seqidno:40；seqidno:41和seqidno:42；seqidno:43和seqidno:44；seqidno:45和seqidno:46；seqidno:47和seqidno:48；seqidno:49和seqidno:50；seqidno:51和seqidno:52；seqidno:53和seqidno:54；seqidno:55和seqidno:56；seqidno:82和seqidno:83；seqidno:84和seqidno:85；seqidno:86和seqidno:87；或seqidno:88和seqidno:89至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列；或者其中，所述vh和vl包含在具有與seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:63、seqidno:64、seqidno:65、seqidno:66、seqidno:67、seqidno:68、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72或seqidno:73至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列的scfv中。在某些方面中，本文提供的結(jié)合分子是還包括j鏈的二聚iga分子形式。在某些方面中，本文提供的結(jié)合分子是還包括j鏈的五聚igm分子形式。在某些方面中，本文提供的結(jié)合分子是六聚igm分子。本發(fā)明還提供包括本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子的組合物。本發(fā)明還提供多核苷酸，所述多核苷酸包括編碼多肽亞基(例如，本文提供的結(jié)合分子的重鏈或輕鏈)的核酸序列。在某些方面中，所述多肽亞基包括融合至vh的c末端的人iga或igm恒定區(qū)或其片段，包括：(a)hcdr1、hcdr2和hcdr3區(qū)，其包括vh氨基酸序列seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33、seqidno:35、seqidno:37、seqidno:39、seqidno:41、seqidno:43、seqidno:45、seqidno:47、seqidno:49、seqidno:51、seqidno:53、seqidno:55、seqidno:82、seqidno:84、seqidno:86或seqidno:88中所包含的cdr，或者，scfv氨基酸序列seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:63、seqidno:64、seqidno:65、seqidno:66、seqidno:67、seqidno:68、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72或seqidno:73中所包含的cdr；或者，vh氨基酸序列seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33、seqidno:35、seqidno:37、seqidno:39、seqidno:41、seqidno:43、seqidno:45、seqidno:47、seqidno:49、seqidno:51、seqidno:53、seqidno:55、seqidno:82、seqidno:84、seqidno:86或seqidno:88中所包含的cdr，或者，scfv氨基酸序列seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:63、seqidno:64、seqidno:65、seqidno:66、seqidno:67、seqidno:68、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72或seqidno:73中所包含的cdr，其中，在所述hcdr的一個(gè)或多個(gè)中有一個(gè)或兩個(gè)單一氨基酸取代；或(b)與seqidno:seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33、seqidno:35、seqidno:37、seqidno:39、seqidno:41、seqidno:43、seqidno:45、seqidno:47、seqidno:49、seqidno:51、seqidno:53、seqidno:55、seqidno:82、seqidno:84、seqidno:86或seqidno:88至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列，或者，與具有氨基酸序列seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:63、seqidno:64、seqidno:65、seqidno:66、seqidno:67、seqidno:68、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72或seqidno:73的scfv的vh部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。在某些方面中，所述多肽亞基包括輕鏈恒定區(qū)或其片段，其融合至所述二聚、五聚或六聚結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體vl部分的多肽亞基的c末端。在某些方面中，所述多肽亞基包括融合至vl的c末端的人κ或λ輕鏈恒定區(qū)或其片段，包括：(a)lcdr1，lcdr2和lcdr3區(qū)，其包括vl氨基酸序列seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8、seqidno:10、seqidno:12、seqidno:14、seqidno:16、seqidno:18、seqidno:20、seqidno:22、seqidno:24、seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:34、seqidno:36、seqidno:38、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46、seqidno:48、seqidno:50、seqidno:52、seqidno:54、seqidno:56、seqidno:83、seqidno:85、seqidno:87或seqidno:89中所含的cdr，或scfv氨基酸序列seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:63、seqidno:64、seqidno:65、seqidno:66、seqidno:67、seqidno:68、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72或seqidno:73中所含的cdr；或vl氨基酸序列seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8、seqidno:10、seqidno:12、seqidno:14、seqidno:16、seqidno:18、seqidno:20、seqidno:22、seqidno:24、seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:34、seqidno:36、seqidno:38、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46、seqidno:48、seqidno:50、seqidno:52、seqidno:54、seqidno:56、seqidno:83、seqidno:85、seqidno:87或seqidno:89中所含的cdr，或scfv氨基酸序列seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:63、seqidno:64、seqidno:65、seqidno:66、seqidno:67、seqidno:68、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72或seqidno:73中所含的cdr，其中，在所述lcdr中的一個(gè)或多個(gè)中有一個(gè)或兩個(gè)單一氨基酸取代；或(b)與seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8、seqidno:10、seqidno:12、seqidno:14、seqidno:16、seqidno:18、seqidno:20、seqidno:22、seqidno:24、seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:34、seqidno:36、seqidno:38、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46、seqidno:48、seqidno:50、seqidno:52、seqidno:54、seqidno:56、seqidno:83、seqidno:85、seqidno:87或seqidno:89至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列，或與具有氨基酸序列seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:63、seqidno:64、seqidno:65、seqidno:66、seqidno:67、seqidno:68、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72或seqidno:73的scfv的vl部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。本發(fā)明還提供包括本文提供的一種、兩種或更多種多核苷酸的組合物。在某些方面中，提供了一種組合物，其中，所述多核苷酸處于分開的載體上。提供所述載體。在某些方面中，提供了一種組合物，其中，所述多核苷酸處于單一載體上。提供所述載體。在某些方面中，所述組合物還包括一種多核苷酸，其包括編碼j鏈或其片段或其變體的核酸序列。本發(fā)明還提供宿主細(xì)胞，其包括本文提供的多核苷酸、本文提供的組合物，或本文提供的一種或多種載體，其中，所述宿主細(xì)胞能夠表達(dá)本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子。本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生本文提供的結(jié)合分子的方法，其中，所述方法包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞和回收結(jié)合分子。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)表達(dá)tnf超家族受體的細(xì)胞中的tnf超家族受體介導(dǎo)的凋亡的方法，其中，所述方法包括使表達(dá)tnf超家族受體的細(xì)胞與本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子接觸。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)表達(dá)tnf超家族受體的細(xì)胞中的tnf超家族受體脂質(zhì)筏形成的方法，所述方法包括使表達(dá)tnf超家族受體的細(xì)胞與本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子接觸。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，其中，所述方法包括給予有此需要的對象有效量的本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子，其中，所述癌細(xì)胞表達(dá)tnf超家族受體，其具有凋亡活性。在某些方面中，相較于非癌細(xì)胞(例如，正常肝細(xì)胞，例如，正常人肝細(xì)胞)，所述多聚結(jié)合分子能誘導(dǎo)癌細(xì)胞的更大的凋亡。在某些方面中，所述tnf超家族受體是dr5。在某些方面中，該對象是人。附圖簡述圖1a和圖1b：多個(gè)細(xì)胞系上的dr5表達(dá)概況。圖1a)colo205細(xì)胞上的人dr5的表面表達(dá)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測；圖1b)細(xì)胞系的組上的dr5表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(mfi)。圖2：抗dr5mab對dr5具有特異性?？谷薲r5mab特異性地結(jié)合至dr5，但非dr4或誘餌受體dcr1和dcr2，通過elisa檢測。圖3：抗dr5mab細(xì)胞結(jié)合?？谷薲r5mab或同種型對照與colo205細(xì)胞孵育15分鐘，經(jīng)清洗，并用別藻藍(lán)素偶聯(lián)的二抗染色。結(jié)合通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。圖4：抗dr5igg需要交聯(lián)劑來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒性。colo205細(xì)胞在不存在或存在交聯(lián)劑的情況下與抗dr5孵育。24小時(shí)后檢測細(xì)胞活力。同種型對照顯示，在采用或不采用交聯(lián)劑的情況下，均無細(xì)胞毒性(數(shù)據(jù)未顯示)。圖5：抗dr5igg需要交聯(lián)劑來實(shí)現(xiàn)凋亡。colo205細(xì)胞在不存在或存在交聯(lián)劑的情況下與5μg/ml抗dr5mab孵育。4小時(shí)處理之后，分別利用膜聯(lián)蛋白v和7-aad來檢測凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞。圖6：抗dr5igg需要交聯(lián)劑來實(shí)現(xiàn)胱天蛋白酶活化。colo205細(xì)胞在不存在或存在交聯(lián)劑的情況下與5μg/ml抗dr5mab孵育。胱天蛋白酶活化在處理1、2、4和24小時(shí)之后檢測。圖7a-d：多聚抗dr5mab的細(xì)胞毒性高于單體igg。圖7a：非還原性sds-page顯示優(yōu)勢性多聚化的一種抗dr5mab(泳道1)；泳道1對應(yīng)于r&d系統(tǒng)公司(r&dsystems)克隆71903，泳道2對應(yīng)于biolegend克隆djr2-4，泳道3對應(yīng)于acris抗體克隆b-k29，且泳道4對應(yīng)于acris抗體克隆b-d37。圖7b：細(xì)胞活力試驗(yàn)顯示，僅多聚抗dr5mab在不存在交聯(lián)劑的情況中造成colo205細(xì)胞毒性-r&d系統(tǒng)公司(r&dsystems)克隆71903(實(shí)心方形)、biolegend克隆djr2-4(空心圓形，虛線)、acris抗體克隆b-k29(實(shí)心菱形)、acris抗體克隆b-d37(空心三角形，虛線)。圖7c：facs試驗(yàn)結(jié)果顯示，在不存在交聯(lián)劑的情況中，多聚抗dr5mab誘導(dǎo)colo205細(xì)胞中的凋亡，但對于單體抗dr5mab或同種型對照未觀察到類似結(jié)果。圖7d：胱天蛋白酶活化發(fā)光試驗(yàn)顯示，在不存在交聯(lián)劑的情況中，多聚但非單體的抗dr5mab誘導(dǎo)colo205細(xì)胞中的胱天蛋白酶活化。圖8a-b：dr5mabigm對于dr5具有特異性。dr5mabigg(圖a)和igm(圖b)#2特異性地結(jié)合至人dr5，但非dr4或誘餌受體dcr1和dcr2，通過elisa檢測。dr5，實(shí)心圓形；dr4，實(shí)心三角形；dcr1，空心方形；dcr2，空心三角形。圖9：dr5mabigm靶細(xì)胞結(jié)合。dr5mabigm#1(實(shí)心圓形)或dr5mabigg#1(空心方形)與colo205細(xì)胞孵育15分鐘，經(jīng)清洗，并用抗人igm或抗人iggfcalexa647偶聯(lián)的二抗染色。結(jié)合(表示為細(xì)胞結(jié)合的％)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。圖10a-e：dr5mabigm超激動(dòng)劑的細(xì)胞毒性高于單體igg。多聚dr5mabigm#1(圖a)、igm#2(圖b)、igm#3(圖c)和igm#4(圖d)對于colo205細(xì)胞的細(xì)胞毒性高于igg等同形式。圖e顯示dr5mabigm#1的細(xì)胞毒性高于交聯(lián)的igg。dr5mabigm，實(shí)心圓形；dr5mabigg，空心方形；dr5mabigg+交聯(lián)劑，空心三角形。圖11a-d：dr5mabigm超激動(dòng)劑對于colo205腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性高于原代人肝細(xì)胞。多聚dr5mabigm#1(圖a)，dr5mabigm#2(圖b)，dr5mabigm#3(圖c)和dr5mabigm#4(圖d)與colo205腫瘤細(xì)胞或原代人肝細(xì)胞孵育，并且24小時(shí)后檢測細(xì)胞活力。dr5mabigm處理的colo205細(xì)胞，實(shí)心圓形；dr5mabigm處理的肝細(xì)胞，空心圓形。詳述定義應(yīng)注意，術(shù)語“一個(gè)”或“一種”實(shí)體指一種或多種該實(shí)體；例如，“一種結(jié)合分子”應(yīng)理解為代表一種或多種結(jié)合分子。如此，術(shù)語“一個(gè)”(或“一種”)、“一個(gè)或多個(gè)”和“至少一個(gè)”在本文中可互換使用。此外，本文使用“和/或”時(shí)應(yīng)視作具體公開了兩種特征或組分的每一種，有或沒有另一種。因此，本文短語“a和/或b”中使用的術(shù)語“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(單獨(dú))、和“b”(單獨(dú))。同樣，短語如“a、b、和/或c”中使用的術(shù)語“和/或”旨在包括各種以下實(shí)施方式：a、b、和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(單獨(dú))；b(單獨(dú))；和c(單獨(dú))。除非另有定義，本文使用的科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的通常含義相同。例如，《生物醫(yī)藥和分子生物學(xué)簡明詞典》(concisedictionaryofbiomedicineandmolecularbiology)，juo,pei-show，第2版，2002，crc出版社(crcpress)；《細(xì)胞和分子生物學(xué)詞典》(thedictionaryofcellandmolecularbiology)，第3版，1999，學(xué)術(shù)出版社(academicpress)；和《牛津生物化學(xué)和分子生物學(xué)辭典》(oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology)，修訂，2000，牛津大學(xué)出版社(oxforduniversitypress)，向技術(shù)人員提供了本發(fā)明使用的很多術(shù)語的常用詞典。單位、前綴和符號以它們的國際單位制(si)接受的形式表示。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)值。除非另外說明，氨基酸以氨基到羧基的取向從左到右書寫。本文提供的標(biāo)題不是本發(fā)明的各種方面的限制，可以參考說明書整體理解本發(fā)明的各種方面或?qū)嵤┓绞健Ｒ虼?，下面緊接著定義的術(shù)語完全參考說明書全文定義。本文所用的術(shù)語“多肽”意在包括單數(shù)形式“多肽”和復(fù)數(shù)形式“多肽”，指由酰胺鍵(也稱肽鍵)線性連接的多個(gè)單體(氨基酸)所組成的分子。術(shù)語"多肽"指的是兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的任何一條鏈或多條鏈，并且不表示特定長度的產(chǎn)物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或其它任何用于指兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的一條或多條鏈的術(shù)語均包含于“多肽”的定義內(nèi)，術(shù)語“多肽”可與任意這些術(shù)語替代或互換使用。術(shù)語“多肽”還指多肽表達(dá)后修飾的產(chǎn)物，所述修飾包括但不限于糖基化、乙酰基化、磷酸化、酰胺化，和通過已知保護(hù)/阻斷基團(tuán)衍生化、蛋白酶切割或非天然產(chǎn)生氨基酸修飾。多肽可由生物來源衍生或由重組技術(shù)產(chǎn)生，但不必定由指定核酸序列翻譯而來。其可以任何方式產(chǎn)生，包括通過化學(xué)合成。本文公開的多肽的大小可以是約3個(gè)或更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)、20個(gè)或更多個(gè)、25個(gè)或更多個(gè)、50個(gè)或更多個(gè)、75個(gè)或更多個(gè)、100個(gè)或更多個(gè)、200個(gè)或更多個(gè)、500個(gè)或更多個(gè)、1,000個(gè)或更多個(gè)或者2,000個(gè)或更多個(gè)氨基酸。多肽可具有確定的三維結(jié)構(gòu)，但它們不必定具有這種結(jié)構(gòu)。具有確定三維結(jié)構(gòu)的多肽被稱為折疊多肽，不具有確定三維結(jié)構(gòu)但能采用大量不同構(gòu)象的多肽被稱為非折疊多肽。本文所用的術(shù)語糖蛋白指偶聯(lián)于至少一個(gè)糖部分的蛋白質(zhì)，所述糖部分通過某一氨基酸如絲氨酸或天冬酰胺的含氧或含氮側(cè)鏈連接于蛋白質(zhì)?！胺蛛x的”多肽或其片段、變體或衍生物指不處于其天然環(huán)境中的多肽。沒有規(guī)定的具體純化水平。例如，可從其自然或天然環(huán)境中移出分離多肽。在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生多肽和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是如本文公開的分離的，通過任何合適技術(shù)分離、分級，或者部分或基本上純化的天然或重組多肽也如此。本文中所用的術(shù)語“非天然產(chǎn)生的多肽”或其任何語法變化形式，是條件性的限定，其明確地排除，但僅排除，被法官或管理部門或司法機(jī)關(guān)或可能會被法官或管理部門或司法機(jī)關(guān)確定或解釋為“天然產(chǎn)生的”那些多肽形式。本文公開的其它多肽是前述多肽的片段、衍生物、類似物或變體，及其任何組合。本文所述的術(shù)語"片段"、"變體"、"衍生物"和"類似物"包括保持對應(yīng)的原始抗體或多肽的至少一些性質(zhì)(例如，特異性結(jié)合至抗原)的任何多肽。除本文他處討論的具體抗體片段外，多肽的片段還包括，例如，蛋白酶水解片段以及缺失片段。例如，多肽的變體包括如上所述的片段，以及因氨基酸取代、缺失或插入而具有改變的氨基酸序列的多肽。在某些方面中，變體可以是非天然產(chǎn)生的?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的誘變技術(shù)生成非天然產(chǎn)生變體。變體多肽可包含保守或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是已經(jīng)改變從而顯示原始多肽上不存在的其它特征的多肽。例子包括融合蛋白。多肽變體在本文中也可稱作“多肽類似物”。本文所用的多肽的"衍生物"還可指：具有通過功能側(cè)基的反應(yīng)經(jīng)由化學(xué)方法衍生的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的對象多肽?！把苌铩边€包括含有20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)衍生形式的那些肽。例如，4-羥基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羥基賴氨酸可取代賴氨酸；3-甲基組氨酸可取代組氨酸；高絲氨酸可取代絲氨酸；且鳥氨酸可取代賴氨酸?！氨Ｊ匦园被崛〈笔瞧渲幸粋€(gè)氨基酸被具有相似側(cè)鏈的另一個(gè)氨基酸替代的情況。本領(lǐng)域中已定義了具有類似側(cè)鏈的氨基酸的家族，包括堿性側(cè)鏈(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽和抗體的序列中的保守取代不廢除包含所述氨基酸序列的多肽或抗體與所述結(jié)合分子結(jié)合的抗原的結(jié)合。鑒定不消除抗原結(jié)合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見，例如，brummell等，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等，proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等，proc.natl.acad.sci.usa94:.412-417(1997))。術(shù)語“多核苷酸”意在包括單個(gè)核酸和多個(gè)核酸，指分離的核酸分子或構(gòu)建物，例如信使rna(mrna)、cdna或質(zhì)粒dna(pdna)。多核苷酸可包含常規(guī)磷酸二酯鍵或非常規(guī)鍵(如酰胺鍵，如肽核酸(pna)中發(fā)現(xiàn)的酰胺鍵)。術(shù)語“核酸”或“核酸序列”指多核苷酸中存在的任何一種或多種核酸區(qū)段，如dna或rna片段。"分離的"核酸或多核苷酸意為與其原始環(huán)境分離的核酸或多核苷酸的任何形式。例如，凝膠純化的多核苷酸，或編碼載體中所含多肽的重組多核苷酸將被視作是“分離的”。并且，認(rèn)為已被工程改造以具有供于克隆的限制性位點(diǎn)的多核苷酸區(qū)段，例如，pcr產(chǎn)物，是“分離的”。分離的多核苷酸的其它示例包括在異源性宿主細(xì)胞中維持的重組多核苷酸或在非原始溶液(例如緩沖液或鹽水)中(部分地或基本上地)純化的重組多核苷酸。分離的rna分子包括多核苷酸的體內(nèi)或體外rna轉(zhuǎn)錄本，其中，所述轉(zhuǎn)錄本不是自然中存在的轉(zhuǎn)錄本。分離的多核苷酸或核酸還包括通過合成方式產(chǎn)生的這樣的分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括調(diào)節(jié)元件例如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)，或轉(zhuǎn)錄終止子。本文中所用的術(shù)語“非天然產(chǎn)生的多核苷酸”或其任何語法變化形式，是條件性的限定，其明確地排除，但僅排除，被判定機(jī)構(gòu)或管理部門或司法機(jī)關(guān)或可能會被被判定機(jī)構(gòu)或管理部門或司法機(jī)關(guān)確定或解釋為“天然產(chǎn)生的”那些核酸或多核苷酸形式。本文所用的術(shù)語“編碼區(qū)”指由翻譯成氨基酸的密碼子組成的核酸部分。雖然“終止密碼子”(tag、tga或taa)不翻譯成氨基酸，但它可被認(rèn)為是編碼區(qū)的一部分，而任何側(cè)接序列如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子等均不是編碼區(qū)的一部分。兩個(gè)或更多個(gè)編碼區(qū)可存在于單一多核苷酸構(gòu)建物中，例如在單一載體上，或者在分開的多核苷酸構(gòu)建物中，例如在單獨(dú)(不同)載體上。此外，任何載體均能包含單一編碼區(qū)，或可包含兩個(gè)或更多個(gè)編碼區(qū)，例如，單一載體可分開編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。此外，載體、多核苷酸或核酸可包括異源性的編碼區(qū)，其融合或未融合至另一個(gè)編碼區(qū)。異源性的編碼區(qū)包括不限于，編碼專有的元件或基序(例如分泌信號肽或異源性的功能結(jié)構(gòu)域)的那些。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸或核酸是dna。對dna而言，包含多肽編碼核酸的多核苷酸通常包含啟動(dòng)子和/或其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件，這些元件與一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)操作性連接。操作性連接指當(dāng)基因產(chǎn)物如多肽的編碼區(qū)與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列以此方式連接時(shí)，將該基因產(chǎn)物的表達(dá)置于該調(diào)控序列的影響或控制下。如果啟動(dòng)子功能的誘導(dǎo)使編碼所需基因產(chǎn)物的mrna轉(zhuǎn)錄，且如果兩個(gè)dna片段間連接的屬性不干擾表達(dá)調(diào)控序列指導(dǎo)基因產(chǎn)物表達(dá)或不干擾轉(zhuǎn)錄dna模板的能力，則兩個(gè)dna片段(如多肽編碼區(qū)及其相連的啟動(dòng)子)“操作性連接”。因此，如果啟動(dòng)子能夠影響核酸的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子區(qū)域與多肽編碼核酸操作性連接。啟動(dòng)子可以是在預(yù)定細(xì)胞中指導(dǎo)dna實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子以外的其它轉(zhuǎn)錄控制元件如增強(qiáng)子、操縱子、阻遏物和轉(zhuǎn)錄終止信號，能與多核苷酸可操作連接以指導(dǎo)細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄。多種轉(zhuǎn)錄控制區(qū)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。它們包括但不限于在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，例如但不限于，來自巨細(xì)胞病毒(立即早期啟動(dòng)子，與內(nèi)含子-a聯(lián)用)、猿病毒40(早期啟動(dòng)子)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(如勞氏肉瘤病毒)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)段。其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括源自脊椎動(dòng)物基因的那些，例如肌動(dòng)蛋白、熱激蛋白、牛生長激素和兔β-球蛋白，以及能夠控制真核細(xì)胞中的基因表達(dá)的其它序列。其它合適的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括組織特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子以及淋巴因子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如，通過干擾素或白介素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子)。類似地，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解各種翻譯控制元件。它們包括但不限于：核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始和終止密碼子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特別是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或ires，也稱為cite序列)。在其它實(shí)施方式中，多核苷酸可以是rna，例如，信使rna(mrna)、轉(zhuǎn)移rna或核糖體rna的形式。多核苷酸和核酸編碼區(qū)可與編碼分泌或信號肽的其它編碼區(qū)相關(guān)聯(lián)，所述編碼分泌或信號肽引導(dǎo)本文所述的多核苷酸編碼的多肽的分泌。根據(jù)信號假說，哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)具有信號肽或分泌前導(dǎo)序列，一旦生長的蛋白質(zhì)鏈跨粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的輸出啟動(dòng)，所述序列從成熟蛋白質(zhì)上切除。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解，脊椎動(dòng)物細(xì)胞分泌的多肽可具有融合于所述多肽n末端的信號肽，它們從完整或“全長”多肽上切割產(chǎn)生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些實(shí)施方式中，使用天然信號肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽，或者使用仍然能夠指導(dǎo)與其操作性相連多肽分泌的該序列的功能衍生物?；蛘?，可采用異源性的哺乳動(dòng)物信號肽，或其功能衍生物。例如，野生型前導(dǎo)序列可用小鼠β-葡萄糖醛酸酶或人組織纖溶酶原激活劑(tpa)的前導(dǎo)序列取代。本文中所用的術(shù)語“tnf受體蛋白超家族”、“tnf超家族”、“tnf受體家族”、“tnf受體”或此類短語的任何組合，指的是在多種細(xì)胞和組織的表面上表達(dá)的腫瘤壞死因子跨膜受體蛋白的家族。該超家族的家族成員包括，在通過配體結(jié)合活化之后觸發(fā)其中表達(dá)所述受體蛋白的細(xì)胞中的凋亡、增殖和/或形態(tài)發(fā)生的那些?；罨笥|發(fā)凋亡的tnf超家族受體蛋白成員包括，但不限于如下受體：tnfr1(dr1)、tnfr2、tnfr1/2、cd40(p50)、fas(cd95、apo1、dr2)、cd30、4-1bb(cd137、ila)、trailr1(dr4、apo2)、trailr2(dr5)、trailr3(dcr1)、trailr4(dcr2)、opg(ocif)、tweakr(fn14)、lightr(hvem)、dcr3、dr3、edar和xedar?；罨笥|發(fā)增殖的tnf超家族受體蛋白成員包括但不限于如下受體：tnfr1/2、gitr(aitr)、taci、bcma、tweakr(fn14)、rank(trancer)、cd27、cd40(p50)、ox40(cd134)、lt-βr、tnfr1(dr1)和tnfr2。據(jù)信活化后觸發(fā)形態(tài)發(fā)生的tnf超家族受體蛋白成員包括，但不限于如下受體：fas(cd95、apo1、dr2)、trailr1(dr4、apo2)、dr5(trailr2)、trailr3(dcr1)、trailr4(dcr2)、opg(ocif)、cd40(p50)、edar、xedar和tnfr1/2。本文公開了某些結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，其結(jié)合至某些tnf超家族受體蛋白，由此誘發(fā)細(xì)胞凋亡。除非特定地述及全尺寸抗體，否則術(shù)語"結(jié)合分子"涵蓋全尺寸抗體以及所述抗體的抗原結(jié)合亞基、片段、變體、類似物或衍生物，例如，以類似于抗體分子的方式結(jié)合抗原但采用不同的支架的工程改造的抗體分子或片段。本文中所用的術(shù)語“結(jié)合分子”以其最寬泛的含義指特異性結(jié)合至受體(例如，表位或抗原決定簇)的分子。如本文進(jìn)一步描述，結(jié)合分子可包含本文所述的多種“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”之一。結(jié)合分子的非限制性示例是抗體或其保持抗原-特異性結(jié)合的片段。本文中所用的術(shù)語“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指的是必需且足以特異性結(jié)合至表位的結(jié)合分子的區(qū)域。例如，“fv”，例如，抗體的可變重鏈和可變輕鏈，作為兩個(gè)分開多肽亞基或作為單一鏈，被視作是“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”。其它結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括，但不限于，源自駱駝科物種的抗體的可變重鏈(vhh)，或在纖連蛋白支架上表達(dá)的六個(gè)免疫球蛋白互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)。本文所述的“結(jié)合分子”可包括一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、十一個(gè)、十二個(gè)或更多個(gè)“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可互換使用?？贵w(或其片段、變體或衍生物，如本文所述)包括：至少重鏈的可變區(qū)(對于駱駝科物種而言)或至少重鏈和輕鏈的可變區(qū)。脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中的基本免疫球蛋白結(jié)構(gòu)是相對較好地了解的。參見例如，harlow等，《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊》(antibodies:alaboratorymanual)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，第2版，1988)。除非另有說明，術(shù)語“抗體”涵蓋從抗體的小抗原結(jié)合片段到全尺寸抗體的范圍內(nèi)的任何物質(zhì)，例如，igg抗體，其包括兩個(gè)完整重鏈和兩個(gè)完整輕鏈，iga抗體，其包括四個(gè)完整重鏈和四個(gè)完整輕鏈，并且任選地包括j鏈和/或分泌型組分，或igm抗體，其包括十個(gè)或十二個(gè)完整重鏈和十個(gè)或十二個(gè)完整輕鏈且任選地包括j鏈。正如下文中更詳細(xì)討論，術(shù)語“免疫球蛋白”包括可通過生化性質(zhì)區(qū)分的各種類型多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，重鏈分為gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中還有一些亞類(如γ1-γ4或α1-α2)。該鏈的特性決定抗體“同種型”分別為igg、igm、iga、igg或ige。免疫球蛋白亞類(亞型)如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2等已被充分表征，且已知賦予功能特化。根據(jù)本文公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地區(qū)分這些免疫球蛋白各自的經(jīng)修飾形式，從而，它們涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)。輕鏈分類為kappa或lambda(κ、λ)。各重鏈類別可與κ或λ輕鏈結(jié)合。通常，輕鏈和重鏈互相共價(jià)結(jié)合，并且當(dāng)由例如雜交瘤、b細(xì)胞或遺傳工程改造的宿主細(xì)胞表達(dá)免疫球蛋白時(shí)，兩條重鏈的“尾”部分通過共價(jià)二硫鍵或非共價(jià)連接結(jié)合在一起。在重鏈中，氨基酸從y構(gòu)型的分叉末端處的n-端到各條鏈的底部處的c-端。某些抗體(例如，igg抗體)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)重鏈亞基和兩個(gè)輕鏈亞基，其通過二硫鍵共價(jià)連接以形成“y”結(jié)構(gòu)，也在本文中稱為“h2l2”結(jié)構(gòu)，或“結(jié)合單元”。術(shù)語“結(jié)合單元”在本文中用于指結(jié)合分子，例如，抗體或其抗原結(jié)合片段，的部分，其對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)“h2l2”免疫球蛋白結(jié)構(gòu)，即，兩個(gè)重鏈或其片段和兩個(gè)輕鏈或其片段。在例如其中所述結(jié)合分子是二價(jià)igg抗體或其抗原結(jié)合片段的某些方面中，術(shù)語“結(jié)合分子”和“結(jié)合單元”是等同的。在例如其中所述結(jié)合分子是iga二聚體、igm五聚體或igm六聚體的其它方面中，所述結(jié)合分子包含兩個(gè)或更多個(gè)“結(jié)合單元”。分別地，在iga二聚體的情況中是兩個(gè)，或在igm五聚體或六聚體的情況中是五個(gè)或六個(gè)。結(jié)合單元不必包括全長抗體重鏈和輕鏈，但通常將是二價(jià)的，即，將包括兩個(gè)“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”，如下定義。本發(fā)明提供的某些結(jié)合分子是二聚的，并且包括兩個(gè)二價(jià)結(jié)合單元，其包括iga恒定區(qū)或其片段。本發(fā)明提供的某些結(jié)合分子是五聚或六聚的，并且包括五個(gè)或六個(gè)二價(jià)結(jié)合單元，其包括igm恒定區(qū)或其片段。包含兩個(gè)或更多個(gè)，例如，兩個(gè)、五個(gè)或六個(gè)結(jié)合單元的結(jié)合分子，在本文中稱為“多聚的”。術(shù)語“價(jià)”、“二價(jià)”、“多價(jià)”和語法等同形式，指的是給定的結(jié)合分子或結(jié)合單元中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的數(shù)量。如此，述及給定的結(jié)合分子，例如，igm抗體或其片段，術(shù)語“二價(jià)”、“四價(jià)”和“六價(jià)”分別表示存在兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、四個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和六個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在其中各結(jié)合單元是二價(jià)的典型的igm源性的結(jié)合分子中，該結(jié)合分子本身可具有10或12價(jià)。二價(jià)或多價(jià)結(jié)合分子可以是單特異性的，即，所有的結(jié)合結(jié)構(gòu)域均是相同的，或可以是雙特異性的或多特異性的，例如，其中兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域是不同的，例如，結(jié)合至相同的抗原上的不同的表位，或結(jié)合至完全不同的抗原。術(shù)語“表位”包括能夠特異性結(jié)合至抗體的任何分子決定簇。在某些方面中，表位可包括分子的化學(xué)活性的表面基團(tuán)(例如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷酰基或磺?；鶊F(tuán))，而在某些方面中，表位可具有一定的三維結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和/或特定的電荷特點(diǎn)。表位是由抗體結(jié)合的靶標(biāo)的區(qū)域。術(shù)語“靶標(biāo)”以最廣泛的含義使用以包括可由結(jié)合分子結(jié)合的物質(zhì)。靶標(biāo)可以是，例如，多肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)或其它分子。此外，例如，“靶標(biāo)”可以是包含可被結(jié)合分子結(jié)合的表位的細(xì)胞、器官或生物體。輕鏈和重鏈都劃分成結(jié)構(gòu)和功能同源性的區(qū)域。從功能角度使用術(shù)語“恒定”和“可變”。在這方面，應(yīng)理解可變輕(vl)鏈或可變重(vk)鏈部分的可變區(qū)決定抗原識別和特異性。相反，輕鏈的恒定區(qū)(cl)和重鏈的恒定區(qū)(例如，ch1、ch2或ch3)提供生物學(xué)特性，例如分泌、跨胎盤移動(dòng)、fc受體結(jié)合、補(bǔ)體結(jié)合等。按照習(xí)慣，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的編號隨著遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點(diǎn)或抗體的氨基端而增加。n末端部分是可變區(qū)，并且c末端部分是恒定區(qū)；ch3(或者，在igm的情況中，ch4)和cl結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上分別包括重鏈和輕鏈的羧基端?！叭Ligm抗體重鏈”是這樣的多肽，其以n末端向c末端的方向包括，抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)、抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域1(cm1或cμ1)、抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2(cm2或cμ2)、抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(cm3或cμ3)，和抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域4(cm4或cμ4)，其可包括尾片段?！叭Liga抗體重鏈”是這樣的多肽，其以n末端向c末端的方向包括，抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)、抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域1(ca1或cα1)、抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2(ca2或cα2)，和抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(ca3或cα3)，其可包括尾片段。如上所述，一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)允許結(jié)合分子選擇性地識別抗原上的表位并特異性地結(jié)合該表位。即，vl結(jié)構(gòu)域和vh結(jié)構(gòu)域或結(jié)合分子(例如，抗體)的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的子集組合，以形成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。更具體地，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可由各vh和vl鏈上的三個(gè)cdr確定。某些抗體形成較大結(jié)構(gòu)。例如，iga可形成這樣的分子，該分子包括兩個(gè)h2l2結(jié)合單元和通過二硫鍵共價(jià)連接的j鏈，其還可與分泌型組分相關(guān)聯(lián)，并且，igm可形成這樣的五聚或六聚分子，該分子包括五個(gè)或六個(gè)h2l2結(jié)合單元和任選的通過二硫鍵共價(jià)連接的j鏈?？贵w抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中存在的六個(gè)“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”是氨基酸的非連續(xù)短序列，其特異性地定位，以隨著抗體在水性環(huán)境中采用其三維構(gòu)型而形成結(jié)合結(jié)構(gòu)域。結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的其余氨基酸稱為“構(gòu)架”區(qū)，顯示較小的分子間差異。構(gòu)架區(qū)主要采用β-片層構(gòu)象，并且cdr形成連接β-片層結(jié)構(gòu)且在某些情況下形成β-片層結(jié)構(gòu)的部分的環(huán)。因此，構(gòu)架區(qū)用于通過鏈間非共價(jià)相互作用形成為cdr提供正確方向位置的支架。由定位的cdr形成的結(jié)合結(jié)構(gòu)域確定了與免疫反應(yīng)性抗原上的表位互補(bǔ)的表面。這種互補(bǔ)表面促進(jìn)了抗體與其互補(bǔ)表位的非共價(jià)結(jié)合。分別組成cdr和構(gòu)架區(qū)域的氨基酸，可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過任何給定的重或輕鏈可變區(qū)而容易地鑒定，因?yàn)樗鼈円岩远喾N不同的方式被定義(參見，"免疫學(xué)熱門蛋白質(zhì)序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)"，kabat,e.等，美國衛(wèi)生及公共服務(wù)部(u.s.departmentofhealthandhumanservices)，(1983)；和chothia和lesk，j.mol.biol.,196:901-917(1987)，其通過引用其全文納入本文)。除非明確表述為相反的含義，否則在本領(lǐng)域內(nèi)所使用和/或接受的某一術(shù)語有兩種或多種定義的情況下，本文所用的術(shù)語定義應(yīng)包括所有這些含義。具體示例是使用術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)”(“cdr”)描述在重鏈和輕鏈多肽的可變區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的非毗連抗原結(jié)合位點(diǎn)。這些具體的區(qū)域已被描述，例如，由kabat等，美國衛(wèi)生及公共服務(wù)部，"免疫學(xué)熱門蛋白質(zhì)序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)"(1983)，和由chothia等，j.mol.biol.196:901-917(1987)，其通過引用納入本文。kabat和chothia定義包括氨基酸在彼此比較時(shí)的重疊或子集。不過，除非另有說明，述及抗體或其變體的cdr的定義(或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它定義)意圖落在本文定義或所用的術(shù)語范圍之內(nèi)。合適的氨基酸殘基包括上文引用的各參考文獻(xiàn)中定義的cdr，如下表1所示以作對比。涵蓋具體cdr的確切氨基酸編號將根據(jù)cdr的序列和大小而變化。鑒于抗體的可變區(qū)氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠常規(guī)地確定哪些氨基酸包含具體cdr。表1cdr定義*kabatchothiavhcdr131-3526-32vhcdr250-6552-58vhcdr395-10295-102vlcdr124-3426-32vlcdr250-5650-52vlcdr389-9791-96*表1中所有cdr定義的編號均按照kabat等所述的編號規(guī)則(見下文)。kabat等也定義了適用于任何抗體的可變區(qū)序列的編號系統(tǒng)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能明確地將所述“kabat編號系統(tǒng)”應(yīng)用于任何可變區(qū)序列，而不依賴序列本身外的任何實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本文所用的“kabat編號”指kabat等(1983)美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部，“免疫學(xué)熱門蛋白質(zhì)序列(sequenceofproteinsofimmunologicalinterest)”(1983)中所述的編號系統(tǒng)。除非明確注明采用kabat編號系統(tǒng)，否則，對本發(fā)明的全部氨基酸序列采用連貫的編號。結(jié)合分子，例如，抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，包括但不限于，多克隆、單克隆、人、人源化的或嵌合抗體、單一鏈抗體、表位-結(jié)合片段，例如，fab、fab'和f(ab')2、fd、fvs、單鏈fvs(scfv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的fvs(sdfv)、包含vl或vh結(jié)構(gòu)域的片段，通過fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段。scfv分子是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如美國專利號5,892,019。"特異性結(jié)合"一般表示，結(jié)合分子，例如，抗體或其片段、變體或衍生物通過其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合至表位，并且所述結(jié)合需要所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述表位之間的一些互補(bǔ)性。按照這一定義，當(dāng)結(jié)合分子通過其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與表位結(jié)合比與隨機(jī)無關(guān)的表位結(jié)合更容易時(shí)，稱該結(jié)合分子“特異性結(jié)合”該表位。本文中使用術(shù)語“特異性”定性分析某一抗體與某一表位結(jié)合的相對親和性。例如，可認(rèn)為結(jié)合分子“a”比結(jié)合分子“b”對給定表位具有更高特異性，或者可以說結(jié)合分子“a”以比對相關(guān)表位“d”的特異性更高的特異性或親和性結(jié)合表位“c”。可以說結(jié)合分子，例如，本文公開的抗體或其片段、變體或衍生物，以小于或等于5x10-2秒-1、10-2秒-1、5x10-3秒-1、10-3秒-1、5x10-4秒-1、10-4秒-1、5x10-5秒-1或10-5秒-15x10-6秒-1、10-6秒-1、5x10-7秒-1或10-7秒-1的解離速率(k(off))結(jié)合靶標(biāo)抗原?？梢哉f本文公開的結(jié)合分子，例如，抗體或抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，以大于或等于103m-1秒-1、5x103m-1秒-1、104m-1秒-1、5x104m-1秒-1、105m-1秒-1、5x105m-1秒-1、106m-1秒-1或5x106m-1秒-1或107m-1秒-1的結(jié)合速率(k(on))結(jié)合靶標(biāo)抗原。如果結(jié)合分子，例如，抗體或其片段、變體或衍生物，以一定程度上阻斷參比抗體或抗原結(jié)合片段與該表位的結(jié)合的程度優(yōu)先結(jié)合至該表位，則可以說，該結(jié)合分子，例如，抗體或其片段、變體或衍生物競爭性地抑制參比抗體或抗原結(jié)合片段與給定的表位的結(jié)合?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任意方法確定競爭性抑制，例如，競爭elisa試驗(yàn)?？梢哉f，結(jié)合分子競爭性地抑制參比抗體或抗原結(jié)合片段與給定表位的至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％的結(jié)合。本文所用的術(shù)語“親和性”指單獨(dú)表位與例如免疫球蛋白分子的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的強(qiáng)度量度。參見例如，harlow等，《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊》(antibodies:alaboratorymanual)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，第2版，1988)，第27-28頁。本文中所用的術(shù)語"親和力(avidity)"指的是結(jié)合結(jié)構(gòu)域的群和抗體之間的復(fù)合物的總體穩(wěn)定性。參見，例如，harlow，第29-34頁。親合力既與群體中單獨(dú)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與特定表位的親和性相關(guān)，也與免疫球蛋白分子和抗原的價(jià)態(tài)相關(guān)。例如，二價(jià)單克隆抗體和具有高度重復(fù)表位結(jié)構(gòu)的抗原例如多聚體之間的相互作用是具有高親合力的一個(gè)例子。二價(jià)單克隆抗體與以高密度存在于細(xì)胞表面上的受體之間的相互作用也將具有高親和力。本文公開的結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物也可就其交叉反應(yīng)性進(jìn)行描述或說明。本文所用的術(shù)語“交叉反應(yīng)性”指，結(jié)合分子(例如抗體或其片段、變體或衍生物)對某一種抗原具有特異性、與第二種抗原發(fā)生反應(yīng)的能力；它是兩種不同抗原性物質(zhì)之間關(guān)聯(lián)性的量度。因此，如果結(jié)合分子與誘導(dǎo)其形成的表位以外的其他表位結(jié)合，則具有交叉反應(yīng)性。交叉反應(yīng)性表位通常含有許多與誘導(dǎo)表位相同的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)特征，在某些情況下甚至比原始表位更匹配。結(jié)合分子，例如，抗體或其片段、變體或衍生物還可就它們與抗原的結(jié)合親和性來描述或說明。例如，結(jié)合分子可以不超過5x10-2m、10-2m、5x10-3m、10-3m、5x10-4m、10-4m、5x10-5m、10-5m、5x10-6m、10-6m、5x10-7m、10-7m、5x10-8m、10-8m、5x10-9m、10-9m、5x10-10m、10-10m、5x10-11m、10-11m、5x10-12m、10-12m、5x10-13m、10-13m、5x10-14m、10-14m、5x10-15m或10-15m的解離常數(shù)或kd結(jié)合至抗原。包括單鏈抗體或其它結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體片段可單獨(dú)存在或以如下一種或多種的組合的形式存在：鉸鏈區(qū)、ch1、ch2、ch3或ch4結(jié)構(gòu)域、j鏈，或分泌型組分。還包括抗原結(jié)合片段，其可包括一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)與鉸鏈區(qū)、ch1、ch2、ch3或ch4結(jié)構(gòu)域、j鏈或分泌型組分中的一個(gè)或多個(gè)的任何組合。結(jié)合分子，例如，抗體或其抗原結(jié)合片段，可來自任何動(dòng)物來源，包括鳥類和哺乳動(dòng)物。所述抗體可以是人、鼠、驢、兔、山羊、豚鼠、駱駝、美洲鴕、馬或雞抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述可變區(qū)可以是軟骨魚(condricthoid)來源(例如，來自鯊魚)。本文中所用的"人"抗體包括，具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，且包括從人免疫球蛋白文庫分離或來自一種或多種人免疫球蛋白的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的抗體，并且其可在一些示例中表達(dá)內(nèi)源性免疫球蛋白，但一些則不是，如下文所述，例如，描述于kucherlapati等的美國專利號5,939,598。本文中所用的術(shù)語“重鏈亞基”包括這樣的氨基酸序列，其源自免疫球蛋白重鏈、結(jié)合分子，例如，包含重鏈亞基的抗體，可包括如下至少一項(xiàng)：vh結(jié)構(gòu)域、ch1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈(例如，上部、中部和/或下部鉸鏈區(qū))結(jié)構(gòu)域、ch2結(jié)構(gòu)域、ch3結(jié)構(gòu)域、ch4結(jié)構(gòu)域，或其變體或片段。例如，結(jié)合分子，例如，抗體或其片段、變體或衍生物，除了vh結(jié)構(gòu)域以外，還可包括但不限于：ch1結(jié)構(gòu)域；ch1結(jié)構(gòu)域，鉸鏈和ch2結(jié)構(gòu)域；ch1結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域；ch1結(jié)構(gòu)域，鉸鏈和ch3結(jié)構(gòu)域；或ch1結(jié)構(gòu)域，鉸鏈結(jié)構(gòu)域，ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域。在某些方面中，結(jié)合分子，例如，抗體或其片段、變體或衍生物，除vh結(jié)構(gòu)域以外，還可包括，ch3結(jié)構(gòu)域和ch4結(jié)構(gòu)域；或ch3結(jié)構(gòu)域，ch4結(jié)構(gòu)域和j鏈。此外，用于本發(fā)明的結(jié)合分子可缺乏某些恒定區(qū)部分，例如，ch2結(jié)構(gòu)域的全部或部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，可修飾這些結(jié)構(gòu)域(例如重鏈亞基)，從而其氨基酸序列不同于原始免疫球蛋白分子。本文所用的術(shù)語“輕鏈亞基”包括衍生自免疫球蛋白輕鏈的氨基酸序列。輕鏈亞基包括至少vl，并且還可包括cl(例如，cκ或cλ)結(jié)構(gòu)域。結(jié)合分子，例如，抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可就它們識別或特異性結(jié)合的表位或抗原部分進(jìn)行描述或說明。靶抗原與抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性相互作用的部分是“表位”或“抗原決定簇”。靶抗原可包含單個(gè)表位，或至少兩個(gè)表位，并可包括任意數(shù)量的表位，這取決于抗原的大小、構(gòu)象和類型。如前所述，各種免疫球蛋白類別的恒定區(qū)的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。本文所用的術(shù)語“vh結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白重鏈的氨基末端可變區(qū)，術(shù)語“ch1結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白重鏈的第一(最靠氨基末端)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。ch1結(jié)構(gòu)域鄰近vh結(jié)構(gòu)域，并且位于典型igg重鏈分子的鉸鏈區(qū)的氨基末端。本文所用的術(shù)語“ch2結(jié)構(gòu)域”包括這樣的重鏈分子部分，其例如從igg抗體的約氨基酸244延伸到氨基酸360，采用常規(guī)的編號方案(氨基酸244至360，kabat編號系統(tǒng)；和氨基酸231-340，eu編號系統(tǒng)；參見kabatea等，同前)。ch3結(jié)構(gòu)域從ch2結(jié)構(gòu)域延伸至igg分子的c末端并且包含約108個(gè)氨基酸。某些免疫球蛋白類別，例如，igm，還包括ch4區(qū)。本文中所用的術(shù)語“鉸鏈區(qū)”包括在igg、iga和igd重鏈中將ch1結(jié)構(gòu)域接合至ch2結(jié)構(gòu)域的重鏈分子的部分。該鉸鏈區(qū)包含約25個(gè)氨基酸并且是柔性的，因此允許兩個(gè)n末端抗原結(jié)合區(qū)域獨(dú)立地移動(dòng)。本文所用的術(shù)語“二硫鍵”包括兩個(gè)硫原子之間形成的共價(jià)鍵。氨基酸半胱氨酸包含可形成二硫鍵或橋接第二巰基基團(tuán)的巰基基團(tuán)。本文所用的術(shù)語“嵌合抗體”指這樣的抗體，其中免疫反應(yīng)性區(qū)域或位點(diǎn)獲自或衍生自第一物種，而恒定區(qū)(其可能是完整、一部分或修飾的)獲自第二物種。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)結(jié)合區(qū)或位點(diǎn)將來自非人來源(例如，小鼠或靈長類)并且恒定區(qū)是人的。術(shù)語“多特異性抗體”或“雙特異性抗體”指的是在單一抗體分子中具有針對兩個(gè)或更多個(gè)不同的表位的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體?？蓸?gòu)建除了標(biāo)準(zhǔn)抗體結(jié)構(gòu)以外的具有兩種結(jié)合特異性的其它結(jié)合分子。由雙特異性抗體或多特異性抗體進(jìn)行的表位結(jié)合可以是同時(shí)或相繼的。三元雜交瘤(trioma)和雜合雜交瘤是可分泌雙特異性抗體的細(xì)胞系的兩個(gè)示例。雙特異性抗體還可通過重組手段構(gòu)建。(和heiss,futureoncol.6:1387-94(2010)；mabry和snavely,idrugs.13:543-9(2010))。雙特異性抗體也可以是雙特異抗體(diabody)。本文中所用的術(shù)語"工程改造的抗體"指的是這樣的抗體，其中重鏈和輕鏈之一或兩者中的可變結(jié)構(gòu)域通過在cdr或構(gòu)架區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的至少部分替代而被改變。在某些方面中，來自具有已知特異性的抗體整個(gè)cdr可被移接到異源性抗體的構(gòu)架區(qū)域中。雖然替代性的cdr可衍生自與產(chǎn)生構(gòu)架區(qū)的抗體屬于同一類或甚至亞類的抗體，但cdr仍可衍生自不同類別的抗體，例如，不同物種的抗體。將來自具有已知特異性的非人抗體的一個(gè)或多個(gè)“供體”cdr移植到人重鏈或輕鏈構(gòu)架區(qū)內(nèi)形成的工程改造的抗體在本文中稱為“人源化抗體”。在某些方面中，并非全部cdr由來自供體可變區(qū)的完整cdr替代，而所述供體的抗原結(jié)合能力仍可被轉(zhuǎn)移至受者可變結(jié)構(gòu)域。鑒于例如美國專利號5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370中給出的解釋，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全有能力通過進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)法或通過試驗(yàn)和誤差檢定來獲得功能工程改造的或人源化的抗體。本文所用的術(shù)語“工程改造的”包括通過合成手段(例如通過重組技術(shù)、體外肽合成，通過酶或化學(xué)偶聯(lián)肽，或這些技術(shù)的一些組合)進(jìn)行的核酸或多肽分子的操作。本文中所用的術(shù)語"連接的"、"融合的"或"融合"或其它語法等同形式可互換使用。這些術(shù)語指通過包括化學(xué)偶聯(lián)或重組在內(nèi)的方式將兩個(gè)或更多元件或組件連接在一起?！翱騼?nèi)融合”指以維持原始o(jì)rf翻譯讀框的方式，將兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸開放閱讀框(orf)連接形成連續(xù)的較長orf。因此，重組融合蛋白是包含兩個(gè)或多個(gè)片段的單一蛋白質(zhì)，所述片段對應(yīng)原始o(jì)rf編碼的多肽(這些片段在自然條件下通常不如此連接)。盡管因此閱讀框在融合片段中是連續(xù)的，但片段仍可被物理或空間分隔，如框內(nèi)接頭序列。例如，編碼免疫球蛋白可變區(qū)cdr的多核苷酸可框內(nèi)融合，但用編碼至少一個(gè)免疫球蛋白構(gòu)架區(qū)或額外cdr區(qū)的多核苷酸間隔開，前提是“融合的”cdr作為連續(xù)多肽的一部分共同翻譯。本文中所用的術(shù)語“交聯(lián)的”指的是兩個(gè)或更多個(gè)分子通過第三分子接合在一起。例如，具有特異性結(jié)合至相同的抗原的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的二價(jià)抗體可“交聯(lián)”該抗原的兩個(gè)拷貝，例如，當(dāng)它們表達(dá)在細(xì)胞上時(shí)。許多tnf超家族受體蛋白需要細(xì)胞表面上的三個(gè)或更多個(gè)受體的交聯(lián)以供活化。tnf超家族受體蛋白的交聯(lián)表示，例如，本文所述的結(jié)合分子與在細(xì)胞表面上表達(dá)的tnf超家族受體的接觸，從而至少三個(gè)所述家族成員同時(shí)由一個(gè)或多個(gè)結(jié)合分子結(jié)合在一起，由此活化所述受體。對于多肽而言，“線性序列”或“序列”是多肽中從氨基到羧基末端方向上氨基酸的順序，在序列中彼此相鄰的氨基酸是多肽一級結(jié)構(gòu)中的毗連殘基。多肽的部分處于在連續(xù)的多肽鏈中出現(xiàn)得較早的多肽的另一個(gè)部分的“氨基末端”或“n末端”。類似地，多肽的部分處于在連續(xù)的多肽鏈中出現(xiàn)得較晚的多肽的另一個(gè)部分的“羧基末端”或“c末端”。例如，在典型的抗體中，可變區(qū)位于恒定區(qū)的“n末端”，并且恒定區(qū)位于可變區(qū)的“c末端”。本文所用的術(shù)語“表達(dá)”指基因生成生化物質(zhì)如多肽的過程。該過程包括在細(xì)胞內(nèi)基因功能存在的任何表現(xiàn)，包括但不限于，基因敲除以及瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。它包括但不限于，基因轉(zhuǎn)錄成rna，例如信使rna(mrna)，和將這類mrna翻譯成多肽。如果所需的最終產(chǎn)物是生化物質(zhì)(biochemical)，則表達(dá)包括產(chǎn)生該生化物質(zhì)和任何前體?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)生"基因產(chǎn)物"。本文中所用的基因產(chǎn)物可以是核酸，例如，通過基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的信使rna，或由轉(zhuǎn)錄本翻譯的多肽。本文所述的基因產(chǎn)物還包括具有轉(zhuǎn)錄后修飾的核酸，例如聚腺苷酸化，或具有翻譯后修飾的多肽，如甲基化、糖基化、加入脂質(zhì)、連接其它蛋白質(zhì)亞基、經(jīng)蛋白酶水解切割等。術(shù)語例如"治療(treating)"或"治療(treatment)"或"以治療(totreat)"或"緩解(alleviating)"或"以緩解(toalleviate)"指的是治愈、減緩、減少現(xiàn)存的已經(jīng)診斷的病理病癥或紊亂的癥狀，和/或截?；驕p緩現(xiàn)存的已經(jīng)診斷的病理病癥或紊亂的進(jìn)展的治療性措施。術(shù)語例如“預(yù)防(prevent)”、“預(yù)防(prevention)”、“避免”、“遏制(deterrence)”等指的是預(yù)防未經(jīng)診斷的目標(biāo)病理病癥或紊亂的進(jìn)展的預(yù)防性的或預(yù)防用的措施。因此，需要治療的那些(對象)可包括已經(jīng)患有疾病的那些(對象)；易于患有疾病的那些(對象)；和需要預(yù)防疾病的那些(對象)?！皩ο蟆被颉皞€(gè)體”或“動(dòng)物”或“患者”或“哺乳動(dòng)物”指需要診斷、預(yù)防或治療的任何對象，特別是哺乳動(dòng)物對象。哺乳動(dòng)物對象包括人、家養(yǎng)動(dòng)物、家畜和動(dòng)物園動(dòng)物、競技動(dòng)物或?qū)櫸铮缛?、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、豬、奶牛、熊等。本文中所用的短語例如“將受益于治療的對象”和“有治療需求的動(dòng)物”包括這樣的對象，例如哺乳動(dòng)物對象，其將受益于結(jié)合分子例如包含一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體的給予。所述結(jié)合分子，例如，抗體，可用于，例如，診斷性操作方法和/或用于疾病的治療或預(yù)防。igm結(jié)合分子igm是通過b細(xì)胞響應(yīng)抗原刺激產(chǎn)生的第一種免疫球蛋白，并且以約1.5mg/ml在血清中以5天的半衰期存在。igm是五聚或六聚分子。igm結(jié)合單元包括兩個(gè)輕和兩個(gè)重鏈。盡管igg包含三個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(ch1、ch2和ch3)，igm的重(μ)鏈還包含第四恒定結(jié)構(gòu)域(ch4)，其包括c末端“尾片段”。人igm恒定區(qū)通常包含氨基酸序列seqidno:74。人cμ1區(qū)的范圍是seqidno:74的約氨基酸5-約氨基酸102；人cμ2區(qū)的范圍是seqidno:74的約氨基酸114-約氨基酸205，人cμ3區(qū)的范圍是seqidno:74的約氨基酸224-約氨基酸319，cμ4區(qū)的范圍是seqidno:74的約氨基酸329-約氨基酸430，并且所述尾片段的范圍是seqidno:74的約氨基酸431-約氨基酸453。seqidno:74如下所示：gsasaptlfplvscenspsdtssvavgclaqdflpdsitlswkyknnsdisstrgfpsvlrggkyaatsqvllpskdvmqgtdehvvckvqhpngnkeknvplpviaelppkvsvfvpprdgffgnprksklicqatgfsprqiqvswlregkqvgsgvttdqvqaeakesgpttykvtstltikesdwlgqsmftcrvdhrgltfqqnassmcvpdqdtairvfaippsfasifltkstkltclvtdlttydsvtiswtrqngeavkthtniseshpnatfsavgeasiceddwnsgerftctvthtdlpsplkqtisrpkgvalhrpdvyllppareqlnlresatitclvtgfspadvfvqwmqrgqplspekyvtsapmpepqapgryfahsiltvseeewntgetytcvahealpnrvtertvdkstgkptlynvslvmsdtagtcy五個(gè)igm結(jié)合單元可與另一個(gè)小多肽鏈(j鏈)形成復(fù)合物，以形成igm抗體。人j鏈包含氨基酸序列seqidno:76。在沒有j鏈的情況下，igm結(jié)合單元通常組裝成六聚體。盡管不希望受理論限制，認(rèn)為igm結(jié)合單元組裝成五聚或六聚結(jié)合分子涉及cμ3和cμ4結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明提供的五聚或六聚結(jié)合分子通常包括igm恒定區(qū)，其包括至少cμ3和cμ4結(jié)構(gòu)域。seqidno:76如下所示：mknhllfwgvlavfikavhvkaqederivlvdnkckcaritsriirssedpnediverniriivplnnrenisdptsplrtrfvyhlsdlckkcdpteveldnqivtatqsnicdedsatetcytydrnkcytavvplvyggetkmvetaltpdacypdigm重鏈恒定區(qū)還可包括cμ2結(jié)構(gòu)域或其片段、cμ1結(jié)構(gòu)域或其片段，和/或其它igm重鏈結(jié)構(gòu)域。在某些方面中，本文提供的結(jié)合分子可包括完整igm重(μ)鏈恒定結(jié)構(gòu)域，例如，seqidno:74或其變體、衍生物或類似物。五聚或六聚tnf超家族結(jié)合分子本發(fā)明提供五聚或六聚結(jié)合分子，即，具有如本文定義的五個(gè)或六個(gè)“結(jié)合單元”的結(jié)合分子，其可特異性結(jié)合至一個(gè)或多個(gè)tnf超家族受體蛋白，例如，dr5。相較于由單一結(jié)合單元組成的結(jié)合分子，例如，二價(jià)igg抗體，本文提供的結(jié)合分子可具有改善的結(jié)合特點(diǎn)或生物活性。例如，五聚或六聚結(jié)合分子可更高效地交聯(lián)細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞)表面上的三個(gè)或更多個(gè)tnf超家族受體分子，由此促進(jìn)所述細(xì)胞的凋亡。本文提供的結(jié)合分子可同樣地具有與由合成或嵌合結(jié)構(gòu)組成的多價(jià)結(jié)合分子不同的特點(diǎn)。例如，相對于包含嵌合恒定區(qū)或合成結(jié)構(gòu)的結(jié)合分子，人igm恒定區(qū)的應(yīng)用可提供減少的免疫原性，和由此增加的安全性。此外，基于igm的結(jié)合分子可一致地形成六聚或五聚寡聚體，導(dǎo)致同源性更高的表達(dá)產(chǎn)物。更優(yōu)的補(bǔ)體結(jié)合也可以是基于igm的結(jié)合分子的有利的效應(yīng)物功能。在某些方面中，本發(fā)明提供五聚或六聚結(jié)合分子，其分別包含五個(gè)或六個(gè)二價(jià)結(jié)合單元，其中各結(jié)合單元包括兩個(gè)igm重鏈恒定區(qū)或其片段。在某些方面中，所述兩個(gè)igm重鏈恒定區(qū)是人重鏈恒定區(qū)。如果所述本文提供的結(jié)合分子是五聚的，則該結(jié)合分子還可包含j鏈，或其片段，或其變體。igm重鏈恒定區(qū)可包括cμ1結(jié)構(gòu)域、cμ2結(jié)構(gòu)域、cμ3結(jié)構(gòu)域和/或cμ4結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)，限制條件是，所述恒定區(qū)可在該結(jié)合分子中提供所需功能，例如，與第二igm恒定區(qū)相關(guān)聯(lián)以形成結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或與其它結(jié)合單元相關(guān)聯(lián)以形成六聚體或五聚體。在某些方面中，個(gè)體結(jié)合單元中的兩個(gè)igm重鏈恒定區(qū)或其片段各包含cμ3結(jié)構(gòu)域或其片段、cμ4結(jié)構(gòu)域或其片段、尾片段(tp)或其片段，或cμ3結(jié)構(gòu)域cμ結(jié)構(gòu)域，和tp或其片段的任何組合。在某些方面中，個(gè)體結(jié)合單元中的兩個(gè)igm重鏈恒定區(qū)或其片段還各自包含cμ2結(jié)構(gòu)域或其片段、cμ1結(jié)構(gòu)域或其片段，或cμ1結(jié)構(gòu)域或其片段和cμ2結(jié)構(gòu)域或其片段。在某些方面中，給定的結(jié)合單元中的兩個(gè)igm重鏈恒定區(qū)各自與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如抗體的fv部分，例如，人或鼠抗體的vh和vl相關(guān)聯(lián)，其中，所述vl可以與輕鏈恒定區(qū)相關(guān)聯(lián)。本文提供的結(jié)合分子中，所述結(jié)合分子的至少一個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是tnf超家族受體蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即，可特異性結(jié)合至tnf受體蛋白超家族的成員(例如，人dr5)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。iga結(jié)合分子iga在粘膜免疫中起關(guān)鍵作用，并且占產(chǎn)生的總免疫球蛋白的約15％。iga是單體或二聚分子。iga結(jié)合單元包括兩個(gè)輕和兩個(gè)重鏈。iga包含三個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(cα1、cα2和cα3)，并且包括c末端“尾片段”。人iga具有兩個(gè)亞型，iga1和iga2。人iga1恒定區(qū)通常包含氨基酸序列seqidno:78。人cα1區(qū)的范圍是seqidno:78的約氨基酸6-約氨基酸98；人cα2區(qū)的范圍是seqidno:78的約氨基酸125-約氨基酸220，人cα3區(qū)的范圍是seqidno:78的約氨基酸228-約氨基酸330，并且所述尾片段的范圍是seqidno:78的約氨基酸331-約氨基酸352。人iga2恒定區(qū)通常包含氨基酸序列seqidno:79。人cα1區(qū)的范圍是seqidno:79的約氨基酸6-約氨基酸98；人cα2區(qū)的范圍是seqidno:79的約氨基酸112-約氨基酸207，人cα3區(qū)的范圍是seqidno:79的約氨基酸215-約氨基酸317，并且所述尾片段的范圍是seqidno:79的約氨基酸318-約氨基酸340。seqidno:78和79如下所示：seqidno:78asptspkvfplslcstqpdgnvviaclvqgffpqeplsvtwsesgqgvtarnfppsqdasgdlyttssqltlpatqclagksvtchvkhytnpsqdvtvpcpvpstpptpspstpptpspscchprlslhrpaledlllgseanltctltglrdasgvtftwtpssgksavqgpperdlcgcysvssvlpgcaepwnhgktftctaaypesktpltatlsksgntfrpevhllpppseelalnelvtltclargfspkdvlvrwlqgsqelprekyltwasrqepsqgtttfavtsilrvaaedwkkgdtfscmvghealplaftqktidrlagkpthvnvsvvmaevdgtcyseqidno:79asptspkvfplsldstpqdgnvvvaclvqgffpqeplsvtwsesgqnvtarnfppsqdasgdlyttssqltlpatqcpdgksvtchvkhytnpsqdvtvpcpvpppppcchprlslhrpaledlllgseanltctltglrdasgatftwtpssgksavqgpperdlcgcysvssvlpgcaqpwnhgetftctaahpelktpltanitksgntfrpevhllpppseelalnelvtltclargfspkdvlvrwlqgsqelprekyltwasrqepsqgtttfavtsilrvaaedwkkgdtfscmvghealplaftqktidrmagkpthvnvsvvmaevdgtcy兩個(gè)iga結(jié)合單元可與兩個(gè)其它多肽鏈，j鏈(seqidno:76)和分泌型組分(前體，seqidno:80，成熟，seqidno:81)形成復(fù)合物，以形成分泌iga(siga)抗體。盡管不希望受理論限制，認(rèn)為iga結(jié)合單元組裝成二聚siga結(jié)合分子涉及cα3和尾片段結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明提供的二聚siga結(jié)合分子通常包括iga恒定區(qū)，其包括至少cα3和尾片段結(jié)構(gòu)域。seqidno:80和seqidno:81如下所示：seqidno:80:mllfvltcllavfpaistkspifgpeevnsvegnsvsitcyypptsvnrhtrkywcrqgarggcitlissegyvsskyagranltnfpengtfvvniaqlsqddsgrykcglginsrglsfdvslevsqgpgllndtkvytvdlgrtvtincpfktenaqkrkslykqiglypvlvidssgyvnpnytgrirldiqgtgqllfsvvinqlrlsdagqylcqagddsnsnkknadlqvlkpepelvyedlrgsvtfhcalgpevanvakflcrqssgencdvvvntlgkrapafegrillnpqdkdgsfsvvitglrkedagrylcgahsdgqlqegspiqawqlfvneestiprsptvvkgvaggsvavlcpynrkesksikywclwegaqngrcpllvdsegwvkaqyegrlslleepgngtftvilnqltsrdagfywcltngdtlwrttveikiiegepnlkvpgnvtavlgetlkvpchfpckfssyekywckwnntgcqalpsqdegpskafvncdensrlvsltlnlvtradegwywcgvkqghfygetaavyvaveerkaagsrdvslakadaapdekvldsgfreienkaiqdprlfaeekavadtrdqadgsrasvdsgsseeqggssralvstlvplglvlavgavavgvararhrknvdrvsirsyrtdismsdfensrefgandnmgassitqetslggkeefvattesttetkepkkakrsskeeaemaykdfllqsstvaaeaqdgpqeaseqidno:81:kspifgpeevnsvegnsvsitcyypptsvnrhtrkywcrqgarggcitlissegyvsskyagranltnfpengtfvvniaqlsqddsgrykcglginsrglsfdvslevsqgpgllndtkvytvdlgrtvtincpfktenaqkrkslykqiglypvlvidssgyvnpnytgrirldiqgtgqllfsvvinqlrlsdagqylcqagddsnsnkknadlqvlkpepelvyedlrgsvtfhcalgpevanvakflcrqssgencdvvvntlgkrapafegrillnpqdkdgsfsvvitglrkedagrylcgahsdgqlqegspiqawqlfvneestiprsptvvkgvaggsvavlcpynrkesksikywclwegaqngrcpllvdsegwvkaqyegrlslleepgngtftvilnqltsrdagfywcltngdtlwrttveikiiegepnlkvpgnvtavlgetlkvpchfpckfssyekywckwnntgcqalpsqdegpskafvncdensrlvsltlnlvtradegwywcgvkqghfygetaavyvaveerkaagsrdvslakadaapdekvldsgfreienkaiqdpriga重鏈恒定區(qū)還可包括cα2結(jié)構(gòu)域或其片段、cα1結(jié)構(gòu)域或其片段，和/或其它iga重鏈結(jié)構(gòu)域。在某些方面中，本文提供的結(jié)合分子可包括完整iga重(α)鏈恒定結(jié)構(gòu)域(例如，seqidno:78或seqidno:79)或其變體、衍生物或類似物。二聚tnf超家族受體結(jié)合分子本發(fā)明提供二聚結(jié)合分子，例如，具有本文定義的兩個(gè)iga“結(jié)合單元”的結(jié)合分子，其可特異性結(jié)合至一個(gè)或多個(gè)tnf超家族受體蛋白，例如，dr5。相較于由單一結(jié)合單元組成的結(jié)合分子，例如，二價(jià)igg抗體，本文提供的結(jié)合分子可具有改善的結(jié)合特點(diǎn)或生物活性。例如，iga結(jié)合分子可更高效地交聯(lián)細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞)表面上的三個(gè)或更多個(gè)tnf超家族受體，由此促進(jìn)所述細(xì)胞的凋亡。此外，iga結(jié)合分子可到達(dá)粘膜位點(diǎn)，提供本文提供的結(jié)合分子的更大的組織分布?；趇ga的結(jié)合分子的應(yīng)用可允許，例如，本文提供的結(jié)合分子的更大的組織分布。粘膜分布可有益于某些癌癥，例如，肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌，或鱗狀細(xì)胞癌。同樣地，本文提供的二聚結(jié)合分子可具有可與包含五個(gè)或六個(gè)結(jié)合單元的結(jié)合分子(例如，六聚或五聚igm抗體)區(qū)分開的結(jié)合特點(diǎn)或生物活性。例如，二聚結(jié)合分子將更小，從而能夠，例如，實(shí)現(xiàn)實(shí)體腫瘤中更好的組織穿透。在某些方面中，本發(fā)明提供二聚結(jié)合分子，其包含兩個(gè)二價(jià)結(jié)合單元，其中各結(jié)合單元包括兩個(gè)iga重鏈恒定區(qū)或其片段。在某些方面中，所述兩個(gè)iga重鏈恒定區(qū)是人重鏈恒定區(qū)。本文提供的二聚iga結(jié)合分子還可包含j鏈，或其片段，或其變體。本文提供的二聚iga結(jié)合分子還可包含分泌型組分，或其片段，或其變體。iga重鏈恒定區(qū)可包括cα1結(jié)構(gòu)域、cα2結(jié)構(gòu)域和/或cα3結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)，限制條件是，所述恒定區(qū)可在該結(jié)合分子中發(fā)揮所需功能，例如，與輕鏈恒定區(qū)相關(guān)聯(lián)以促進(jìn)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的形成，或與另一個(gè)iga結(jié)合單元相關(guān)聯(lián)以形成二聚結(jié)合分子。在某些方面中，個(gè)體結(jié)合單元中的兩個(gè)iga重鏈恒定區(qū)或其片段各自包含cα3結(jié)構(gòu)域或其片段、尾片段(tp)或其片段，或cα3結(jié)構(gòu)域、tp或其片段的任何組合。在某些方面中，個(gè)體結(jié)合單元中的兩個(gè)iga重鏈恒定區(qū)或其片段還各自包含cα2結(jié)構(gòu)域或其片段、cα1結(jié)構(gòu)域或其片段，或cα1結(jié)構(gòu)域或其片段和cα2結(jié)構(gòu)域或其片段。在某些方面中，給定的結(jié)合單元中的兩個(gè)iga重鏈恒定區(qū)各自與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如抗體的fv部分，例如，人或鼠抗體的vh和vl相關(guān)聯(lián)，其中，所述vl可以與輕鏈恒定區(qū)相關(guān)聯(lián)。本文提供的結(jié)合分子中，所述結(jié)合分子的至少一個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是tnf超家族受體蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即，可特異性結(jié)合至tnf受體蛋白超家族的成員(例如，人dr5)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。tnf超家族受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域本文提供的tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子可以是二聚、五聚或六聚的，其分別包含兩個(gè)、五個(gè)或六個(gè)二價(jià)結(jié)合單元。所述結(jié)合單元可以是全長的或其保持結(jié)合功能的變體或片段。各結(jié)合單元包含兩個(gè)iga或igm重鏈恒定區(qū)或其片段，其各自與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)。如上所述，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是必需的且足以特異性結(jié)合至表位的結(jié)合分子的區(qū)域。本文所述的“結(jié)合分子”可包括一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、十一個(gè)、十二個(gè)或更多個(gè)“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”。本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子可包括至少三個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其特異性且競爭性地結(jié)合至腫瘤壞死因子(tnf)超家族受體蛋白。如上所述，這些tnf超家族受體蛋白中的一些，在活化后，能誘導(dǎo)表達(dá)其結(jié)合的tnf超家族受體蛋白的細(xì)胞的凋亡。如目前所理解的，當(dāng)多個(gè)受體蛋白結(jié)合到一起時(shí)，造成受體分子的交聯(lián)，由此信號被傳遞跨過細(xì)胞膜進(jìn)入表達(dá)tnf超家族受體蛋白的細(xì)胞的胞質(zhì)，從而將發(fā)生凋亡。本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子可交聯(lián)在細(xì)胞表面上表達(dá)的至少三個(gè)相同的tnf超家族受體蛋白。歸因于tnf超家族受體蛋白的二聚、五聚或六聚性質(zhì)，本文提供的結(jié)合分子可交聯(lián)多達(dá)三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、十一個(gè)或十二個(gè)tnf超家族受體蛋白，所述受體蛋白必須空間上彼此接近，由此促進(jìn)它們的交聯(lián)和活化。當(dāng)本文提供的二價(jià)結(jié)合單元tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子的全部五個(gè)或全部六個(gè)分別結(jié)合至單一細(xì)胞上的至多十個(gè)或十二個(gè)tnf超家族受體蛋白時(shí)，可發(fā)生受體的交聯(lián)和活化。因?yàn)樗鼋Y(jié)合單元各自是二價(jià)的，所以各結(jié)合分子可結(jié)合至多達(dá)10個(gè)(對于五聚結(jié)合分子而言)或12個(gè)(對于六聚結(jié)合分子而言)tnf超家族受體蛋白。在經(jīng)本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子的結(jié)合所致的受體活化之后，細(xì)胞可經(jīng)歷凋亡、活化或形態(tài)發(fā)生，如上所述，這取決于結(jié)合了該超家族的哪種受體。在某些方面中，本文公開的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子能以高于等同量的二價(jià)igg抗體或其片段的效能誘導(dǎo)表達(dá)tnf超家族受體的細(xì)胞中的tnf超家族受體介導(dǎo)的凋亡，其還特異性地結(jié)合至并激動(dòng)相同的tnf超家族受體蛋白。不希望受理論限制，因?yàn)樘峁┙Y(jié)合分子是二聚、五聚或六聚的，并且因?yàn)楦鹘Y(jié)合單元是二價(jià)的，所以所述結(jié)合分子能以更高效能誘導(dǎo)受體介導(dǎo)的先前關(guān)于該受體蛋白超家族所表征的功能，相較于任何單獨(dú)的單一結(jié)合單元，例如等同的igg結(jié)合單元而言。igg結(jié)合單元是二價(jià)的，包含兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，但如先前的臨床研究所示，該超家族的兩個(gè)受體與單一igg分子的結(jié)合在不添加其它組分(例如交聯(lián)劑等)的情況下可能是無效的?！靶堋被颉案纳频慕Y(jié)合特點(diǎn)”是指，實(shí)現(xiàn)給定的生物結(jié)果，例如，給定的試驗(yàn)，例如，基于elisa或western印跡的胱天蛋白酶試驗(yàn)、通過facs分析所見的膜聯(lián)蛋白-v染色，或在下文實(shí)例中提供的其它試驗(yàn)中，20％、50％或90％的tnf超家族受體蛋白的活化所需的給定的結(jié)合分子的最小的量。例如，當(dāng)tnf超家族受體蛋白是在活化時(shí)造成其中它被活化的細(xì)胞的凋亡的受體蛋白時(shí)，效能可被表示為曲線，其中％細(xì)胞存活處于y軸，而結(jié)合分子濃度(例如，以μg/ml或μm計(jì))處于x軸。因?yàn)楸疚奶峁┑慕Y(jié)合分子是二聚、五聚或六聚的，所以其可分別具有多達(dá)4、10或12個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。各抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可特異性結(jié)合至并激動(dòng)tnf超家族受體。此外，各抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可對tnf超家族受體蛋白的一個(gè)具體的表位具有特異性。在某些方面中，所述結(jié)合分子不與其它tnf超家族受體蛋白交叉反應(yīng)。然而，在其它方面中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)或更多個(gè)可對不同的表位和/或不同的tnf超家族受體蛋白具有特異性。因此，單個(gè)的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子可：a)同時(shí)結(jié)合許多相同的受體蛋白上的單一表位，b)結(jié)合同一相同的受體蛋白上的許多不同的表位，或c)可結(jié)合不同的tnf超家族受體蛋白上的不同的表位。在實(shí)施方式a)中，本文提供的tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子可結(jié)合相同的tnf超家族受體的多重拷貝，對于各相同的拷貝在相同位置處結(jié)合，由此形成所述受體蛋白在單一位置處的筏，并且可能增加受體蛋白被活化的可能性。在其它實(shí)施方式中，例如實(shí)施方式c)，本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子可用于接觸多重不同的tnf超家族受體蛋白，由此通過多種被靶標(biāo)的受體活化多于一個(gè)途徑，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中的所需生物響應(yīng)。當(dāng)然，在這些實(shí)施方式中，本文提供的tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子可接觸并激動(dòng)全部處于一種單一細(xì)胞上或處于多重細(xì)胞間的此類受體。因此，本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子可包含三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)，或在六聚結(jié)合分子的情況中，包含多達(dá)十一個(gè)，或十二個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其特異性且競爭性地結(jié)合至在一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的表面上表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)tnf超家族受體蛋白，由此誘導(dǎo)該一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中的意圖的或所需的生物響應(yīng)。本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子的結(jié)合單元可以是人、人源化或嵌合免疫球蛋白結(jié)合單元。人源化免疫球蛋白序列的方法是本領(lǐng)域已知的。因此，編碼二聚、五聚或六聚結(jié)合分子多肽的核苷酸序列可直接來自人序列，或可以是人源化的或嵌合的，即，由來自多種不同的物種的序列編碼。本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子可特異性結(jié)合已知tnf超家族受體蛋白中的任何一種。這些受體蛋白可基于觸發(fā)形態(tài)發(fā)生、凋亡或增殖的特定功能而被分組。因此，本文提供的tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子可以，例如，特異性結(jié)合至如下受體中的任何一個(gè)或多個(gè)：tnfr1(dr1)、tnfr2、tnfr1/2、cd40(p50)、fas(cd95、apo1、dr2)、cd30、4-1bb(cd137、ila)、dr4(trailr1、apo2)、dr5(trailr2)、dcr1(trailr3)、dcr2(trailr4)、opg(ocif)、tweakr(fn14)、lightr(hvem)、dcr3、dr3、edar和xedar。在一個(gè)實(shí)施方式中，本文提供的tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子特異性且競爭性地結(jié)合至dr5但不特異性結(jié)合至其它受體，例如，dr4(trailr1、apo2)、誘餌受體dcr1(trailr3)或誘餌受體dcr2(trailr4)。在某些方面中，本文提供的tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子可特異性且競爭性地結(jié)合至dr5，并且還可特異性結(jié)合至dr4。表達(dá)tnf超家族受體蛋白的細(xì)胞可以是任何動(dòng)物細(xì)胞。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。例如，所述細(xì)胞可以是靈長類、嚙齒類、犬、馬等的任何一種或多種的細(xì)胞。此外，表達(dá)所述tnf超家族受體蛋白的細(xì)胞可以是癌細(xì)胞。即，所述細(xì)胞可以是惡性或良性腫瘤中的細(xì)胞。本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子可經(jīng)遺傳工程改造，從而其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域由已知特異性結(jié)合tnf超家族受體蛋白的序列編碼。許多團(tuán)隊(duì)已經(jīng)公開了單克隆抗體、經(jīng)表征且已知特異性結(jié)合至tnf超家族受體(例如，dr5)的大多數(shù)igg同種型的可變區(qū)的序列。已知特異性結(jié)合至dr5的非限制性免疫球蛋白可變區(qū)序列提供于表2和3。對于tnf受體蛋白超家族的其它成員具有特異性的其它單克隆抗體序列已被公開。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)⑦@些公開的序列工程改造成免疫球蛋白結(jié)構(gòu)，例如igg、iga、igm結(jié)構(gòu)，或其生物活性或功能片段(例如scfv片段等，如上所述)。用于將克隆的可變區(qū)遺傳工程改造成為免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，并且表達(dá)和純化所述構(gòu)建體的方法是公開的并且處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。因此，在某些方面中，本文提供的tnf超家族受體蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗dr5mab的六個(gè)免疫球蛋白互補(bǔ)決定區(qū)hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，或所述六個(gè)免疫球蛋白互補(bǔ)決定區(qū)在一個(gè)或多個(gè)cdr中具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)單氨基酸取代，其包含：分別如下的vh和vl氨基酸序列seqidno:1和seqidno:2；seqidno:3和seqidno:4；seqidno:5和seqidno:6；seqidno:7和seqidno:8；seqidno:9和seqidno:10；seqidno:11和seqidno:12；seqidno:13和seqidno:14；seqidno:15和seqidno:16；seqidno:17和seqidno:18；seqidno:19和seqidno:20；seqidno:21和seqidno:22；seqidno:23和seqidno:24；seqidno:25和seqidno:26；seqidno:27和seqidno:28；seqidno:29和seqidno:30；seqidno:31和seqidno:32；seqidno:33和seqidno:34；seqidno:35和seqidno:36；seqidno:37和seqidno:38；seqidno:39和seqidno:40；seqidno:41和seqidno:42；seqidno:43和seqidno:44；seqidno:45和seqidno:46；seqidno:47和seqidno:48；seqidno:49和seqidno:50；seqidno:51和seqidno:52；seqidno:53和seqidno:54；seqidno:55和seqidno:56；seqidno:82和seqidno:83；seqidno:84和seqidno:85；seqidno:86和seqidno:87；或seqidno:88和seqidno:89；或scfv氨基酸序列seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:63、seqidno:64、seqidno:65、seqidno:66、seqidno:67、seqidno:68、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72，或seqidno:73。表2抗dr5抗體vh和vl序列表3：抗dr5scfv序列在某些方面中，dr5結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含vh和vl，其中，所述vh和vl包含分別與seqidno:1和seqidno:2；seqidno:3和seqidno:4；seqidno:5和seqidno:6；seqidno:7和seqidno:8；seqidno:9和seqidno:10；seqidno:11和seqidno:12；seqidno:13和seqidno:14；seqidno:15和seqidno:16；seqidno:17和seqidno:18；seqidno:19和seqidno:20；seqidno:21和seqidno:22；seqidno:23和seqidno:24；seqidno:25和seqidno:26；seqidno:27和seqidno:28；seqidno:29和seqidno:30；seqidno:31和seqidno:32；seqidno:33和seqidno:34；seqidno:35和seqidno:36；seqidno:37和seqidno:38；seqidno:39和seqidno:40；seqidno:41和seqidno:42；seqidno:43和seqidno:44；seqidno:45和seqidno:46；seqidno:47和seqidno:48；seqidno:49和seqidno:50；seqidno:51和seqidno:52；seqidno:53和seqidno:54；seqidno:55和seqidno:56；seqidno:82和seqidno:83；seqidno:84和seqidno:85；seqidno:86和seqidno:87；或seqidno:88和seqidno:89至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列；或者其中，所述vh和vl位于scfv中，該scfv包含與seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:63、seqidno:64、seqidno:65、seqidno:66、seqidno:67、seqidno:68、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72，或seqidno:73至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。盡管本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于本發(fā)明可設(shè)想多種不同的二聚、五聚和六聚結(jié)合分子，并因而包括在本發(fā)明中，但在某些方面中，提供如上所述的結(jié)合分子，其中各結(jié)合單元包含兩個(gè)iga或igm重鏈，其各包含位于iga或igm恒定區(qū)或其片段的氨基末端的vh，和兩個(gè)免疫球蛋白輕鏈，其各包含位于免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)的氨基末端的vl。此外，在某些方面中，所述結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合單元，或所述結(jié)合分子的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)或至少六個(gè)結(jié)合單元，包含或包括如上所述的dr5結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)。在某些方面中，所述結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合單元中的，或所述結(jié)合分子的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)結(jié)合單元中的兩個(gè)dr5結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以彼此不同，或它們可以是相同的。在某些方面中，所述結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合單元，或所述結(jié)合分子的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)結(jié)合單元中的所述兩個(gè)iga或igm重鏈，是相同的。在某些方面中，所述結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合單元，或至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)結(jié)合單元中的兩個(gè)相同的iga或igm重鏈包含公開于表2和3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。在某些方面中，所述結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合單元，或所述結(jié)合分子的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)結(jié)合單元中的兩個(gè)輕鏈?zhǔn)窍嗤?。在某些方面中，所述結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合單元，或所述結(jié)合分子的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)結(jié)合單元內(nèi)的兩個(gè)相同的輕鏈?zhǔn)铅瘦p鏈，例如，人κ輕鏈，或λ輕鏈，例如，人λ輕鏈。在某些方面中，所述結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合單元，或所述結(jié)合分子的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)結(jié)合單元內(nèi)的兩個(gè)相同的輕鏈各自包含公開于表2和3的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。在某些方面中，本發(fā)明提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)結(jié)合單元包含或各包含兩個(gè)相同的iga或igm重鏈恒定區(qū)，其各自包含相同的公開于表2和3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，和兩個(gè)相同的輕鏈，其各自包含相同的公開于表2和3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。根據(jù)該方面，所述結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合單元，或所述結(jié)合分子的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)結(jié)合單元中的dr5結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是相同的。此外根據(jù)該方面，本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子可包含如上所述的dr5結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)、至少十個(gè)、至少十一個(gè)，或至少十二個(gè)拷貝。在某些方面中，所述結(jié)合單元中至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)可以是相同的，并且，在某些方面中，所述結(jié)合單元可包含相同的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如，至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)、至少十個(gè)、至少十一個(gè)，或至少十二個(gè)dr5結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是相同的。在某些方面中，相較于其它結(jié)合分子，本文提供的二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子可具有有利的結(jié)構(gòu)或功能性質(zhì)。例如，相對于對應(yīng)的具有相同的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的二價(jià)結(jié)合分子，所述二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合。生物試驗(yàn)包括，但不限于elisa和western印跡胱天蛋白酶試驗(yàn)，和facs分析，其利用指示凋亡細(xì)胞死亡的染色，例如膜聯(lián)蛋白-v。在某些方面中，本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子觸發(fā)表達(dá)tnf超家族受體蛋白的細(xì)胞的凋亡的效能高于等同量的特異性結(jié)合至與該tnf超家族受體蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域相同的tnf超家族受體蛋白表位的單特異性的、二價(jià)igg1抗體或其片段。在某些方面中，本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子觸發(fā)表達(dá)dr5的細(xì)胞的凋亡的效能可高于等同量的單特異性的、二價(jià)抗dr5單克隆抗體或其片段，其中，所述抗體是或包含與提供于表2和3的抗體相同的vh和vl區(qū)域，例如，可那木單抗(amgen)、多茲圖單抗(genentech)或來沙木單抗(hgs/glaxosmithkline)。多核苷酸、載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明還提供多核苷酸，例如，分離的、重組和/或非天然產(chǎn)生的多核苷酸，其包含編碼本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子的多肽亞基的核酸序列?！岸嚯膩喕北硎究杀华?dú)立地翻譯的結(jié)合分子、結(jié)合單元或結(jié)合結(jié)構(gòu)域的部分。示例包括但不限于，抗體vh、抗體vl、單鏈fv、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈恒定區(qū)、抗體輕鏈恒定區(qū)，和/或其任何片段。本發(fā)明還提供一種組合物，其包含兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸，其中，所述兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸可共同地編碼如上所述的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子。在某些方面中，所述組合物可包括編碼iga或igm重鏈或其片段，例如，如上所述的人iga或igm重鏈的多核苷酸，其中，所述iga或igm重鏈包含tnf超家族受體蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少vh，和，編碼輕鏈或其片段，例如，人κ或λ輕鏈的多核苷酸，所述輕鏈包含tnf超家族受體蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少vl。提供的多核苷酸組合物還可包括編碼j鏈(例如，人j鏈)或其片段或其變體的多核苷酸。在某些方面中，本文提供的組合物所含的多核苷酸可位于兩個(gè)或三個(gè)分開載體(例如，表達(dá)載體)上。本發(fā)明提供所述載體。在某些方面中，本文提供的組合物所含的多核苷酸中的兩種或更多種可位于單一載體(例如，表達(dá)載體)上。本發(fā)明提供所述載體。本發(fā)明還提供宿主細(xì)胞，例如，原核或真核宿主細(xì)胞，其包含編碼本文提供的二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子或其任何亞基的多核苷酸或兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸，本文提供的多核苷酸組合物，或載體或兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)載體，其共同地編碼本文提供的二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子，或其任何亞基。在某些方面中，本發(fā)明提供的宿主細(xì)胞可表達(dá)本發(fā)明提供的二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子，或其亞基。在一個(gè)相關(guān)方面中，本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明提供的二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子的方法，其中，所述方法包括培養(yǎng)如上所述的宿主細(xì)胞，和，回收結(jié)合分子。使用方法本發(fā)明提供用于觸發(fā)表達(dá)tnf超家族受體蛋白的細(xì)胞(例如，惡性或永生化的細(xì)胞)的凋亡的改進(jìn)方法，該方法利用本文提供的二聚、五聚或六聚的基于iga或基于igm的tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子。下述方法可利用結(jié)合分子，所述結(jié)合分子包含源自任何現(xiàn)存的抗tnf超家族受體蛋白抗體(包括但不限于提供于表2和3的抗體，或其變體、衍生物或類似物)的tnf超家族受體蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，相較于等同的二價(jià)抗體、片段、變體、衍生物或類似物，所述二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子可提供表達(dá)tnf超家族受體蛋白的細(xì)胞的改善的凋亡介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。基于本發(fā)明，包含任何感興趣的tnf超家族受體蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的二聚、五聚或六聚的基于iga或基于igm的tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子的構(gòu)建完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。改善的活性可以，例如，允許使用減少的劑量，或可導(dǎo)致對于耐受原始抗體的殺傷的細(xì)胞的更有效殺傷。“耐受”表示抗tnf超家族受體蛋白抗體對于表達(dá)tnf超家族受體蛋白的細(xì)胞的任何程度的活性減少。在某些方面中，本發(fā)明提供觸發(fā)表達(dá)tnf超家族受體蛋白的細(xì)胞的凋亡、形態(tài)發(fā)生或增殖的方法，其中，所述方法包括，使表達(dá)tnf超家族受體蛋白的細(xì)胞與本文所述的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子接觸，其中，所述結(jié)合分子對于表達(dá)tnf超家族受體蛋白的細(xì)胞的凋亡、形態(tài)發(fā)生或增殖的觸發(fā)的效能高于特異性結(jié)合至與該tnf超家族受體蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域相同的tnf超家族受體蛋白表位的等同量的單特異性的、二價(jià)igg1抗體或其片段。而在另一個(gè)方面，當(dāng)以有效劑量給予有癌癥治療需求的對象時(shí)，本文提供的tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子可促進(jìn)癌治療，例如，通過減緩腫瘤生長、停止腫瘤生長，或減小現(xiàn)存腫瘤的尺寸來介導(dǎo)。本發(fā)明提供治療癌癥的方法，所述方法包括：給予有治療需求的對象有效劑量的本文提供的tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子，例如，本文提供的dr5結(jié)合分子。在某些方面中，所述表達(dá)tnf超家族受體蛋白的細(xì)胞是永生化的細(xì)胞系，即癌細(xì)胞。術(shù)語“癌癥”、“腫瘤”、“癌性”和“惡性”指或描述哺乳動(dòng)物的生理病癥，其典型特征是細(xì)胞生長失控。癌癥的示例包括但不限于，癌，包括腺癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病。所述癌癥的更具體的示例包括，鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腸癌、霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌例如肝細(xì)胞癌和肝細(xì)胞瘤、膀胱癌、乳腺癌(包括激素介導(dǎo)的乳腺癌，參見，例如，innes等(2006)br.j.cancer94:1057-1065)、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、骨髓瘤(例如多發(fā)性骨髓瘤)、涎腺癌、腎癌例如腎細(xì)胞癌和維爾姆斯瘤、基底細(xì)胞癌、黑素瘤、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、睪丸癌、食管癌、多種類型的頭頸癌，包括但不限于，鱗狀細(xì)胞癌，和粘蛋白來源的癌，例如，粘蛋白卵巢癌、膽管癌(肝)和乳頭狀腎細(xì)胞癌。粘膜分布，例如由本文提供的基于iga的結(jié)合分子提供的粘膜分布，對于某些癌癥，例如，肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌或鱗狀細(xì)胞癌而言是有益的。本發(fā)明還提供一種預(yù)防或治療有此需要的對象的癌癥的方法，包括，給予該對象有效量的本文提供的二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段、包含所述結(jié)合分子的組合物或制劑，或本文所述的多核苷酸、載體或宿主細(xì)胞。用于治療癌癥的組合物的有效劑量可根據(jù)許多不同的因素變化，包括給藥方式、目標(biāo)位點(diǎn)、患者的生理狀態(tài)、患者是人還是動(dòng)物、給予的其他藥物和治療是預(yù)防性還是治療性。在某些方面中，本文提供的治療方法可提供增加的安全性，其中，相較于非癌細(xì)胞(例如，正常人肝細(xì)胞)，所述組合物對癌細(xì)胞顯示更大的細(xì)胞毒性(例如，更大程度上地誘導(dǎo)凋亡)。通常，患者是人，但也可治療非人哺乳動(dòng)物(包括轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物)?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法對治療劑量進(jìn)行滴定以優(yōu)化安全性和功效。本發(fā)明的組合物可以任何合適的方法給予，例如，腸胃外、心室內(nèi)、經(jīng)口、通過吸入噴霧、局部、直腸、鼻、口腔、陰道或通過植入型儲器。本文所用術(shù)語“胃腸外”包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、腦內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。待治療的對象可以是有治療需要的任何動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物，在某些方面中，對象是人對象。以其最簡形式，待給予對象的制劑是本文提供的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子，或其抗原結(jié)合片段，其以常規(guī)的劑型給予，其可與本文他處所述的藥物賦形劑、運(yùn)載體或稀釋劑聯(lián)合給予。本文提供的tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段可通過本文他處所述的任何合適的方法給予，例如，通過iv輸注。在某些方面中，本文提供的tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段可被引入腫瘤，或腫瘤細(xì)胞附近。全部類型的腫瘤均能受通過該方法的治療，其包括但不限于，乳腺、肺、胰腺、卵巢、腎、結(jié)腸和膀胱的癌，以及黑素瘤、肉瘤和淋巴瘤。粘膜分布對于某些癌癥，例如，肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌或鱗狀細(xì)胞癌可能是有益的。用于本文提供的方法的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子，是具有如本文定義的兩個(gè)、五個(gè)或六個(gè)“結(jié)合單元”的結(jié)合分子，其可特異性結(jié)合至tnf超家族受體蛋白，例如，人dr5。在某些方面中，用于本文提供的方法的二聚、五聚或六聚結(jié)合分子分別包含兩個(gè)、五個(gè)或六個(gè)二價(jià)結(jié)合單元，其中各結(jié)合單元包括兩個(gè)iga或igm重鏈恒定區(qū)或其片段。在某些方面中，所述兩個(gè)iga或igm重鏈恒定區(qū)是人重鏈恒定區(qū)。其中，用于本文提供的方法的結(jié)合分子是基于二聚iga的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子還可包含j鏈，或其片段，或其變體，并且還可包含分泌型組分，或其片段，或其變體。其中，用于本文提供的方法的結(jié)合分子是基于五聚igm的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子還可包含j鏈，或其片段，或其變體。用于本文提供的方法的結(jié)合分子的iga重鏈恒定區(qū)可包括cα1結(jié)構(gòu)域、cα2結(jié)構(gòu)域和/或cα3結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)，限制條件是，所述恒定區(qū)能夠在該結(jié)合分子中發(fā)揮所需功能，例如，與輕鏈恒定區(qū)相關(guān)聯(lián)以促進(jìn)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的形成，或與另一個(gè)結(jié)合單元相關(guān)聯(lián)以形成二聚體。在某些方面中，個(gè)體結(jié)合單元中的兩個(gè)iga重鏈恒定區(qū)或其片段各包含cα3結(jié)構(gòu)域或其片段、尾片段(tp)或其片段，或cα3結(jié)構(gòu)域和tp或其片段的任何組合。在某些方面中，個(gè)體結(jié)合單元中的兩個(gè)iga重鏈恒定區(qū)或其片段還各自包含cα2結(jié)構(gòu)域或其片段、cα1結(jié)構(gòu)域或其片段，或cα1結(jié)構(gòu)域或其片段和cα2結(jié)構(gòu)域或其片段。用于本文提供的方法的結(jié)合分子的igm重鏈恒定區(qū)可包括cμ1結(jié)構(gòu)域、cμ2結(jié)構(gòu)域、cμ3結(jié)構(gòu)域和/或cμ4結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)，限制條件是，恒定區(qū)可在該結(jié)合分子中發(fā)揮所需功能，例如，與輕鏈恒定區(qū)相關(guān)聯(lián)以促進(jìn)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的形成，或與其它結(jié)合單元相關(guān)聯(lián)以形成六聚體或五聚體。在某些方面中，個(gè)體結(jié)合單元中的兩個(gè)igm重鏈恒定區(qū)或其片段各包含cμ3結(jié)構(gòu)域或其片段、cμ4結(jié)構(gòu)域或其片段、尾片段(tp)或其片段，或cμ3結(jié)構(gòu)域cμ4結(jié)構(gòu)域，和tp或其片段的任何組合。在某些方面中，個(gè)體結(jié)合單元中的兩個(gè)igm重鏈恒定區(qū)或其片段還各自包含cμ2結(jié)構(gòu)域或其片段、cμ1結(jié)構(gòu)域或其片段，或cμ1結(jié)構(gòu)域或其片段和cμ2結(jié)構(gòu)域或其片段。盡管本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于本發(fā)明可設(shè)想多種用于本文提供的方法的不同的二聚、五聚和六聚結(jié)合分子，并因而包括在本發(fā)明中，但在某些方面中，提供用于本文提供的方法的結(jié)合分子，其中各結(jié)合單元包含兩個(gè)iga或igm重鏈，其各包含位于iga或igm恒定區(qū)或其片段的氨基末端的vh，和兩個(gè)免疫球蛋白輕鏈，其各包含位于免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)的氨基末端的vl。此外在某些方面中，用于本文提供的方法的結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合單元，或用于本文提供的方法的結(jié)合分子的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)結(jié)合單元，包含或含有如上所述的兩個(gè)tnf超家族受體蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些方面中，用于本文提供的方法的所述結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合單元，或所述結(jié)合分子的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)結(jié)合單元中的兩個(gè)tnf超家族受體蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以彼此不同，或它們可以相同。在某些方面中，用于本文提供的方法的結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合單元，或所述結(jié)合分子的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)結(jié)合單元中的所述兩個(gè)iga或igm重鏈，是相同的。在某些方面中，用于本文提供的方法的所述結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合單元，或所述結(jié)合分子的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)結(jié)合單元中的所述兩個(gè)輕鏈?zhǔn)窍嗤?。在某些方面中，用于本文提供的方法的結(jié)合分子的至少一個(gè)結(jié)合單元，或所述結(jié)合分子的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)，或至少六個(gè)結(jié)合單元內(nèi)的兩個(gè)相同的輕鏈?zhǔn)铅瘦p鏈，例如，人κ輕鏈，或λ輕鏈，例如，人λ輕鏈。相較于其它結(jié)合分子，用于本文提供的方法的二聚、五聚或六聚tnf受體結(jié)合分子可具有有利的結(jié)構(gòu)或功能性質(zhì)。例如，相較于對應(yīng)的結(jié)合分子(例如，來沙木單抗或其變體、類似物，或衍生物)，用于本文提供的方法的二聚、五聚或六聚tnf受體結(jié)合分子可在生物試驗(yàn)(體外或體內(nèi))中具有改善的活性。生物試驗(yàn)包括但不限于elisa或western印跡胱天蛋白酶試驗(yàn)和facs分析，其采用指示凋亡的細(xì)胞死亡的染色，例如膜聯(lián)蛋白-v。藥物組合物和給藥方法制備和給予本文提供的二聚、五聚或六聚tnf受體結(jié)合分子至有此需要的對象的方法是本領(lǐng)域人員熟知且能根據(jù)本發(fā)明容易地確定的。tnf受體結(jié)合分子的給予途徑可以是，例如，經(jīng)口、胃腸外、通過吸入或局部給予。本文所用的術(shù)語胃腸外包括例如，靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、直腸或陰道給藥。盡管這些給予形式設(shè)想為合適的形式，但給予形式的其它示例將是注射用溶液，具體地是用于靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)注射或滴注的溶液。合適的藥物組合物可包含緩沖劑(如乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖劑)、表面活性劑(如聚山梨酯)，以及任選的穩(wěn)定劑(如人白蛋白)等。如本文所述，本文提供的二聚、五聚或六聚tnf受體結(jié)合分子可以藥學(xué)上有效的量給予供于表達(dá)tnf超家族受體蛋白的癌的體內(nèi)治療。在這方面，應(yīng)理解，將配制本發(fā)明公開的結(jié)合分子以利于給藥并提高活性物質(zhì)的穩(wěn)定性。藥物組合物因此可包含藥學(xué)上可接受的、非毒性無菌運(yùn)載體，例如生理鹽水、非毒性緩沖液、防腐劑等。本文提供的二聚、五聚或六聚tnf受體結(jié)合分子的藥學(xué)有效的量表示足以實(shí)現(xiàn)有效結(jié)合至靶標(biāo)并實(shí)現(xiàn)治療益處的量。合適的制劑描述于《雷明頓藥物科學(xué)》(remington'spharmaceuticalsciences)馬克出版公司(mackpublishingco.)第16版.(1980)。本文提供的某些藥物組合物可以可接受的劑型口服給予，包括例如，膠囊、片劑、水性懸液或溶液。也可通過鼻氣溶膠或吸入來給予某些藥物組合物。這類組合物可采用苯甲醇或其他合適的防腐劑，吸收促經(jīng)濟(jì)以增強(qiáng)生物可及性，和/或其他常規(guī)增溶劑或分散劑制備成鹽水溶液。可與運(yùn)載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子的量將根據(jù)，例如，處理的對象和具體的給予模式而變化?？梢詥蝿┬?、多劑型或在確立的時(shí)間段內(nèi)的輸注中給予組合物。也可調(diào)整給藥方案，以提供最優(yōu)所需響應(yīng)(例如，治療或預(yù)防性響應(yīng))。保持在本發(fā)明范圍內(nèi)，本文提供的二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子可以足夠的量給予有治療需求的對象以產(chǎn)生治療作用。本文提供的二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子可以常規(guī)的劑型給予該對象，該常規(guī)的劑型通過根據(jù)已知技術(shù)，將本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物與常規(guī)的藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑相組合來制備。藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑的形式和性質(zhì)可根據(jù)其將要組合的活性成分的量、給予途徑和其它熟知變量來描述。"治療有效劑量或量"或"有效量"意在表示，當(dāng)給予時(shí)，就患有表達(dá)tnf超家族受體蛋白的癌的患者的治療而言，獲得積極治療響應(yīng)的二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子的量。本文公開的組合物的治療有效劑量將根據(jù)許多不同的因素變化，包括給藥方式、目標(biāo)位點(diǎn)、患者的生理狀態(tài)、患者是人還是動(dòng)物、給予的其他藥物和治療是預(yù)防性還是治療性。在某些方面中，對象或患者是人，但也可治療非人哺乳動(dòng)物，包括轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法對治療劑量進(jìn)行滴定以優(yōu)化安全性和功效。待給予的二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子的量是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明而容易地確定的，無需過度實(shí)驗(yàn)。影響給予模式和二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子的相應(yīng)量的因素影響包括但不限于，經(jīng)歷治療個(gè)體的疾病嚴(yán)重性、病史、年齡、身高、體重、健康和身體狀況。類似地，待給予的二聚、五聚或六聚tnf受體結(jié)合分子的量將取決于給予模式，以及對象將經(jīng)歷該試劑的單一劑量還是多重劑量。本發(fā)明還提供二聚、五聚或六聚tnf超家族受體蛋白結(jié)合分子在制備用于治療、預(yù)防，或控制癌的藥物中的應(yīng)用，其中，所述癌表達(dá)tnf超家族受體蛋白。除非另有說明，本發(fā)明將采用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組dna和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，它們均在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有充分描述。參見例如，sambrook等編(1989)molecularcloningalaboratorymanual(《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊》)(第2版；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(coldspringharborlaboratorypress))；sambrook等編(1992)molecularcloning:alaboratorymanual(《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊》)，(紐約州的冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(coldspringsharborlaboratory，ny))；d.n.glover編，(1985)dnacloning(《dna克隆》)，第i和ii卷；gait編(1984)oligonucleotidesynthesis(《寡核苷酸合成》)；mullis等，美國專利號4,683,195；hames和higgins編(1984)nucleicacidhybridization(《核酸雜交》)；hames和higgins編(1984)transcriptionandtranslation(《轉(zhuǎn)錄和翻譯》)；freshney(1987)cultureofanimalcells(《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》)(arl公司(alanr.liss，inc.))；immobilizedcellsandenzymes(《固定的細(xì)胞和酶》)(irl出版社)(1986)；perbal(1984)apracticalguidetomolecularcloning(《分子克隆實(shí)踐指南》)；論文，methodsinenzymology(《酶學(xué)方法》)(學(xué)術(shù)出版社公司(academicpress，inc.)，紐約州)；miller和calos編(1987)genetransfervectorsformammaliancells(《哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因載體》)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(coldspringharborlaboratory))；wu等編，methodsinenzymology(《酶學(xué)方法》)，第154和155卷；mayer和walker編(1987)immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(《細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》)(學(xué)術(shù)出版社(academicpress)，倫敦)；weir和blackwell編(1986)handbookofexperimentalimmunology(《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊》)，第i-iv卷；manipulatingthemouseembryo(《小鼠胚胎操作》)，紐約州冷泉港的冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，n.y.)，(1986)；和ausubel等(1989)currentprotocolsinmolecularbiology(《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)(馬里蘭州巴爾的摩的約翰韋利父子公司(johnwiley&sons，baltimore，md.))?？贵w工程的一般原理可參見borrebaeck編(1995)antibodyengineering(《抗體工程》)(第2版；牛津大學(xué)出版社(oxforduniv.press))。蛋白質(zhì)工程的一般原理可參見rickwood等編(1995)proteinengineering，apracticalapproach(《蛋白質(zhì)工程，實(shí)踐方法》)，(英國牛津的牛津大學(xué)出版社的irl出版公司(irlpressatoxforduniv.press，oxford，eng.))。抗體和抗體-半抗原結(jié)合的一般原理可參見：nisonoff(1984)molecularimmunology(《分子免疫學(xué)》)(第2版；馬薩諸塞州桑德蘭的辛奧爾聯(lián)合公司(sinauerassociates，sunderland，mass.))；和steward(1984)antibodies,theirstructureandfunction(《抗體的結(jié)構(gòu)和功能》)(chapman和hall，紐約州紐約市)。此外，本領(lǐng)域已知且沒有具體描述的免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法可按照下述文獻(xiàn)所述進(jìn)行：currentprotocolsinimmunology(《新編免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)，紐約州的約翰韋利父子公司(johnwiley&sons)；stites等編(1994)basicandclinicalimmunology(《基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)》)(第8版；appleton和lange，康涅狄格州的諾沃克(norwalk，conn.))和mishell和shiigi(編)(1980)selectedmethodsincellularimmunology(《細(xì)胞免疫學(xué)的選用方法》)(w.h.弗里曼公司(w.h.freemanandco)，紐約州)。列出免疫學(xué)通用原理的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括：currentprotocolsinimmunology(《新編免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)，約翰韋利父子公司(johnwiley&sons)，紐約州；klein(1982)j.，immunology:thescienceofself-nonselfdiscrimination(《免疫學(xué)：自身-非自身區(qū)別的科學(xué)》)(約翰韋利父子公司，紐約州)；kennett等編(1980)monoclonalantibodies,hybridoma:anewdimensioninbiologicalanalyses(《單克隆抗體，雜交瘤：生物學(xué)分析的新領(lǐng)域》)(普萊努公司(plenumpress)，紐約州)；campbell(1984)"monoclonalantibodytechnology"inlaboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology"(《生化和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》中的“單克隆抗體技術(shù)”)，burden等編(的埃爾斯威爾公司(elsevere)，阿姆斯特丹)；goldsby等編(2000)kubyimmunnology(《庫比免疫學(xué)》)(第4版；h.弗里曼公司(h.freemand&co.))；roitt等(2001)immunology(《免疫學(xué)》)(第6版；倫敦：摩茲比公司(mosby))；abbas等(2005)cellularandmolecularimmunology(《細(xì)胞和分子免疫學(xué)》)(第5版；埃爾斯威爾健康科學(xué)分公司(elsevierhealthsciencesdivision))；kontermann和dubel(2001)antibodyengineering(《抗體工程》)(施普林格公司(springerverlag))；sambrook和russell(2001)molecularcloning:alaboratorymanual(《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊》)(冷泉港出版社(coldspringharborpress))；lewin(2003)geneviii(《基因viii》)(普倫蒂斯霍爾出版社(prenticehall)2003)；harlow和lane(1988)antibodies:alaboratorymanual(《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊》)(冷泉港出版社)；dieffenbach和dveksler(2003)pcrprimer(《pcr引物》)(冷泉港出版社)。將上文中引用的所有參考文獻(xiàn)以及其中引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用全文納入本文。通過說明的方式，而非限制性方式提供以下實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1：dr5表達(dá)概況dr5細(xì)胞表面表達(dá)通過熒光活化的細(xì)胞分選(facs)分析定量。簡言之，facs染色緩沖液(bdpharmigen，目錄號#554656)用于染色和清洗步驟。腫瘤細(xì)胞(1x105-5x105)用0.25μg的抗人dr5-pe(ebioscience，目錄號#12-9908-42)或同種型-pe對照(ebioscience，目錄號#12-4714-42)4℃染色15分鐘，避光。細(xì)胞清洗兩次，重懸于facs染色緩沖液，并通過流式細(xì)胞術(shù)采集結(jié)果。圖1a顯示抗人dr5抗體的峰遷移(下圖)，與同種型對照(上圖)不同。圖1b顯示dr5表達(dá)在細(xì)胞系之間不同，其中在這組細(xì)胞系中，293f細(xì)胞表達(dá)最多的dr5。實(shí)施例2：抗dr5mab特異性特異性elisa該試驗(yàn)的目的是證明抗dr5mab結(jié)合至dr5，但非dr4或誘餌受體dcr1和dcr2。可溶性dr5、dr4、dcr1或dcr2蛋白(r&dsystems，目錄號分別為#631-t2-100/cf，347-dr-100/cf，630-tr-100/cf，633-tr-100)以100mmnahco3(ph9.5)中的2μg/ml被覆在elisa板上，4℃過夜。pbs中的2％bsa溶液用于封閉和抗體孵育步驟。板室溫封閉1小時(shí)，然后用小鼠抗人dr5mab(acris，抗體目錄號#am31206af-n)室溫孵育1小時(shí)。抗dr5mab3倍連續(xù)稀釋至濃度1-200ng/ml。用pbs加0.05％吐溫20清洗3次之后，板用大鼠抗小鼠κ-hrp(southernbiotech，目錄號#1180-05)室溫孵育1小時(shí)，避光。用pbs加0.05％吐溫20清洗3次之后，板用tmb基質(zhì)(bdbiosciences，目錄號#555214)室溫孵育20分鐘。反應(yīng)用1mh2so4終止，并采用微滴定酶標(biāo)儀測定450nm的吸光度。圖2顯示，小鼠抗人dr5mab結(jié)合至dr5，但非dr4、dcr1或dcr2。對于人抗dr5mabelisa，1:2000小鼠抗人λ-hrp(southernbiotech，目錄號#9180-05)或1:6000小鼠抗人κ-hrp(southernbiotech，目錄號#9230-05)用于檢測。細(xì)胞結(jié)合該實(shí)施例用于證實(shí)抗dr5mab結(jié)合至細(xì)胞。facs染色緩沖液(bdpharmigen，目錄號#554656)用于染色和清洗步驟。colo205細(xì)胞(2x105細(xì)胞，來自atcc編號#ccl-222)用10μg/ml的小鼠抗人dr5mab(acris，抗體目錄號#am31206af-n)或同種型對照(invivogen，目錄號#hcd20-mab9)4℃染色15分鐘，避光。細(xì)胞清洗兩次，然后以終稀釋度1:200用山羊抗小鼠igg-apc(jacksonimmunoresearch，目錄號#115-136-071)4℃染色15分鐘，避光。細(xì)胞清洗兩次，然后重懸于facs染色緩沖液，并通過流式細(xì)胞術(shù)采集結(jié)果。結(jié)果示于圖3，下圖顯示對于抗dr5mab觀察到的峰遷移。對于人抗dr5mab結(jié)合，山羊抗人iggfc-alexa647(southernbiotech，目錄號#2014-31)或兔抗人igm-alexa647(abcam，目錄號#ab150191)用于檢測。實(shí)施例3：抗dr5mab功能活性和細(xì)胞毒性試驗(yàn)該實(shí)施例證明需要交聯(lián)以實(shí)現(xiàn)dr5mab細(xì)胞毒性。colo205細(xì)胞(atcc目錄號#ccl-222)以1x104細(xì)胞/孔接種于96孔板并允許連接過夜。第二天，細(xì)胞用連續(xù)稀釋的小鼠抗人dr5mab(acris，抗體目錄號#am31206af-n，r&dsystems，目錄號#mab631，biolegend，目錄號#307402，或acris，抗體目錄號#am31205af-n)處理，并37℃孵育24小時(shí)。比色讀出：收獲前三個(gè)小時(shí)，cck-8細(xì)胞活力試劑(dojindock04-13)以總反應(yīng)體積的10％添加，并且板在37℃孵育剩下的3小時(shí)。在酶標(biāo)儀評價(jià)450nm的吸光度。結(jié)果示于圖4(空心圓形)，顯示在不存在交聯(lián)劑時(shí)，沒有或幾乎沒有細(xì)胞毒性。然后，試驗(yàn)如上所述進(jìn)行，不同之處在于在用連續(xù)稀釋的小鼠抗人dr5mab在室溫預(yù)孵育細(xì)胞20分鐘之后，以抗dr5mab的最高劑量的濃度的3倍添加山羊抗小鼠igg1fc(jacksonimmunoresearch，目錄號#115-005-205)交聯(lián)劑。結(jié)果示于圖4(實(shí)心圓形)，顯示采用交聯(lián)劑的100％細(xì)胞毒性。對于人抗dr5mab誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，抗人iggfc(biolegend，目錄號#409302)用作交聯(lián)劑?；蛘?，山羊抗人igg加igm(h+l)fab2(jacksonimmunoresearch，目錄號#109-006-127)可用作交聯(lián)劑。發(fā)光讀出：收獲時(shí)，細(xì)胞效價(jià)glo活力試劑(promegag7572)以與孔中的培養(yǎng)基相等的體積添加。細(xì)胞裂解10分鐘并在酶標(biāo)儀上讀取發(fā)光。實(shí)施例4：凋亡試驗(yàn)在存在或不存在交聯(lián)劑的情況下的抗dr5-誘導(dǎo)的凋亡采用如下方法檢測。colo205細(xì)胞(1x105細(xì)胞，來自atcc，編號#ccl-222)用5μg/ml小鼠抗人dr5mab(acris，抗體目錄號#am31206af-n或r&dsystems，目錄號#mab631)或同種型對照(invivogen，目錄號#hcd20-mab9)37℃處理至多4小時(shí)。細(xì)胞用冷pbs清洗兩次，然后用供應(yīng)的結(jié)合緩沖液(bdpharmigen，目錄號#559763)中的膜聯(lián)蛋白v-pe和7-aad(各1μl/樣品)4℃染色15分鐘，避光。膜聯(lián)蛋白v和7-aad分別用以檢測凋亡的(x軸)和死細(xì)胞(y軸)，采用流式細(xì)胞術(shù)。未處理的細(xì)胞獲得的結(jié)果示于圖5的最左側(cè)圖(未處理的)，而采用抗人dr5mab在不存在交聯(lián)劑的情況下獲得的結(jié)果示于圖5中從左計(jì)起的第二張圖(僅抗dr5igg)。圖中觀察到?jīng)]有或幾乎沒有變化。然后，試驗(yàn)如上所述進(jìn)行，不同之處在于在用連續(xù)稀釋的小鼠抗人dr5mab在室溫預(yù)孵育細(xì)胞20分鐘之后，以比抗dr5mab的最高劑量增加3倍的濃度添加山羊抗小鼠igg1fc(jacksonimmunoresearch，目錄號#115-005-205)交聯(lián)劑。圖5中從左計(jì)起第三張圖顯示采用僅交聯(lián)劑的結(jié)果(無凋亡)。圖5的最右側(cè)圖顯示顯著膜聯(lián)蛋白v染色的細(xì)胞，指示在交聯(lián)劑存在的情況下(抗dr5igg+交聯(lián)劑)發(fā)生凋亡。對于人抗dr5mab誘導(dǎo)的凋亡，抗人iggfc(biolegend，目錄號#409302)用作交聯(lián)劑。或者，山羊抗人igg加igm(h+l)fab2(jacksonimmunoresearch，目錄號#109-006-127)可用作交聯(lián)劑。實(shí)施例5：胱天蛋白酶活化試驗(yàn)該實(shí)施例顯示通過胱天蛋白酶活化證明的抗dr5誘導(dǎo)的凋亡。colo205細(xì)胞(atcc目錄號#ccl-222)以1x104細(xì)胞/孔接種于96孔板并允許連接過夜。第二天，細(xì)胞用5μg/ml小鼠抗人dr5mab(acris，抗體目錄號#am31206af-n或r&dsystems，目錄號#mab631)37℃處理至多24小時(shí)。收獲時(shí)，以與各孔中的總培養(yǎng)基相等的體積添加胱天蛋白酶glo3/7試劑(promega目錄號#g8090)。反應(yīng)室溫振蕩孵育30分鐘，并在酶標(biāo)儀上評價(jià)發(fā)光。在不存在交聯(lián)的情況中沒有或幾乎沒有觀察到胱天蛋白酶活性(圖6，交叉陰影短線)。然后，試驗(yàn)如上所述進(jìn)行，不同之處在于在用連續(xù)稀釋的小鼠抗人dr5mab在室溫預(yù)孵育細(xì)胞20分鐘之后，以比抗dr5mab的最高劑量高3倍的濃度添加山羊抗小鼠igg1fc(jacksonimmunoresearch，目錄號#115-005-205)交聯(lián)劑。結(jié)果以短實(shí)線示于圖6。在存在交聯(lián)的情況中，觀察到顯著胱天蛋白酶活性。對于人抗dr5mab誘導(dǎo)的胱天蛋白酶活化，抗人iggfc(biolegend，目錄號#409302)用作交聯(lián)劑?；蛘撸窖蚩谷薸gg加igm(h+l)fab2(jacksonimmunoresearch，目錄號#109-006-127)可用作交聯(lián)劑。實(shí)施例6：多聚抗dr5抗體具有更優(yōu)的活性該實(shí)施例顯示多聚抗dr5抗體的更優(yōu)的體外活性。圖7a，是非還原性sds-page的照片，其顯示優(yōu)勢性的多聚的一種抗dr5mab(泳道1，r&dsystems，克隆71903)，泳道2對應(yīng)于biolegend克隆djr2-4，泳道3對應(yīng)于acris抗體克隆b-k29，且泳道4對應(yīng)于acris抗體克隆b-d37。抗dr5mab功能活性和細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用與實(shí)施例3類似的方法，顯示，僅多聚抗dr5mab在不存在交聯(lián)劑的情況中造成colo205細(xì)胞毒性。(參見，圖7b；r&dsystems克隆71903，實(shí)心方形；biolegend克隆djr2-4，空心圓形，虛線；acris抗體克隆b-k29，實(shí)心菱形；acris抗體克隆b-d37，空心三角形，虛線)。凋亡試驗(yàn)采用與實(shí)施例4類似的方法，顯示，在不存在交聯(lián)劑的情況中，多聚抗dr5mab誘導(dǎo)colo205細(xì)胞隨時(shí)間推移的凋亡，但單體抗dr5mab或同種型對照并非如此。(參見，圖7c；所示的1小時(shí)、2小時(shí)和4小時(shí)時(shí)間點(diǎn))。胱天蛋白酶活化試驗(yàn)采用方法類似于實(shí)施例5中提供的那些，顯示，在不存在交聯(lián)劑的情況中，多聚抗dr5mab，但非單體抗dr5mab，誘導(dǎo)colo205細(xì)胞中的胱天蛋白酶活化。(參見，圖7d)。實(shí)施例7：igm抗dr5抗體的構(gòu)建dna構(gòu)建體的產(chǎn)生根據(jù)seqidno:1和seqidno:2(抗dr5mab#1)的vh和vl序列、根據(jù)seqidno:5和seqidno:6(抗dr5mab#2)的vh和vl序列、根據(jù)seqidno:84和seqidno:85(抗dr5mab#3)的vh和vl序列，和根據(jù)seqidno:88和seqidno:89(抗dr5mab#4)的vh和vl序列通過標(biāo)準(zhǔn)克隆方法插入aragenbioscience公司和lakepharma公司的專有igg和igm載體。轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞用等摩爾比的不同的表達(dá)載體通過標(biāo)準(zhǔn)操作方法共轉(zhuǎn)染。人抗dr5igg的純化人抗dr5igg采用mabselectsure親和性基質(zhì)(gelifesciences，目錄號#17-5438-01)按照生產(chǎn)商推薦純化。人抗dr5igm的純化。具有或不具有j鏈的人抗dr5igm采用captureselectigm親和性基質(zhì)(bac，thermofisher，目錄號#2890.05)按照生產(chǎn)商推薦純化。實(shí)施例8：igm抗dr5mab#2對于dr5具有特異性通過如實(shí)施例2描述的elisa，測試了抗dr5mab#2的igg形式和五聚igm-j鏈形式的結(jié)合特異性。如圖8a(igg)和圖8b(igm)中所示，這些抗體結(jié)合至人dr5但非人dr4或誘餌受體dcr1或dcr2中的任一種。通過如實(shí)施例2所描述的方法測試了抗dr5mab#1的igg和igm形式與靶標(biāo)細(xì)胞colo205的結(jié)合。結(jié)果示于圖9。實(shí)施例9：igm抗dr5mab的細(xì)胞毒性高于對應(yīng)的igg形式采用實(shí)施例3中描述的生物發(fā)光試驗(yàn)，測試了抗dr5mab#1、#2、#3和#4的igg形式和五聚igm-j鏈形式對于colo205細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如圖10a-d中所示，抗dr5igm的細(xì)胞毒性高于igg對應(yīng)物。在圖10e中，在采用和不采用交聯(lián)劑的情況下，將抗dr5mab#1的igm形式與對應(yīng)的igg形式做比較。甚至采用交聯(lián)劑時(shí)，igm形式更具細(xì)胞毒性。肝毒性試驗(yàn)此外，dr5mabigm超激動(dòng)劑對于colo205腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性高于對于原代人肝細(xì)胞的細(xì)胞毒性。colo205細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用實(shí)施例3中描述的生物發(fā)光試驗(yàn)進(jìn)行。約3.5x104原代人肝細(xì)胞(bioreclamation，目錄號#x008001-p)接種于膠原被覆的96孔板并允許連接過夜。第二天，colo205細(xì)胞和肝細(xì)胞用連續(xù)稀釋的igm抗dr5mab#1-#4處理，并37℃孵育24小時(shí)。收獲時(shí)，細(xì)胞效價(jià)glo活力試劑(promegag7572)以與孔中的培養(yǎng)基相等的體積添加。細(xì)胞裂解10分鐘并在酶標(biāo)儀上讀取發(fā)光。如圖11a-d中所示，四種igm抗dr5mab對于colo205腫瘤細(xì)胞(實(shí)心圓形)的細(xì)胞毒性一致地高于對于原代人肝細(xì)胞(空心圓形)的細(xì)胞毒性。序列表<110>b·t-y·王(wang,beatricetien-yi)m·a·施瓦澤(schwarzer,maxallen)b·a·基特(keyt,brucealan)<120>腫瘤壞死因子(tnf)超家族受體結(jié)合分子及其應(yīng)用<130>57912-149854<140><141><150>62/105,323<151>2015-01-20<160>89<170>patentinversion3.5<210>1<211>121<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成多肽<400>1gluvalglnleuvalglnserglyglyglyvalgluargproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspasptyr202530glymetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045serglyileasntrpasnglyglyserthrglytyralaaspserval505560lysglyargvalthrileserargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alalysileleuglyalaglyargglytrptyrpheaspleutrpgly100105110lysglythrthrvalthrvalserser115120<210>2<211>108<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成多肽<400>2sersergluleuthrglnaspproalavalservalalaleuglygln151015thrvalargilethrcysglnglyaspserleuargsertyrtyrala202530sertrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalleuvaliletyr354045glylysasnasnargproserglyileproaspargpheserglyser505560serserglyasnthralaserleuthrilethrglyalaglnalaglu65707580aspglualaasptyrtyrcysasnserargaspserserglyasnhis859095valvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu100105<210>3<211>121<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成多肽<400>3gluvalglnleuvalglnserglyglyglyvalgluargproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspasptyr202530alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045serglyileasntrpglnglyglyserthrglytyralaaspserval505560lysglyargvalthrileserargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alalysileleuglyalaglyargglytrptyrpheasptyrtrpgly100105110lysglythrthrvalthrvalserser115120<210>4<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成多肽<400>4sergluleuthrglnaspproalavalservalalaleuglyglnthr151015valargilethrcysserglyaspserleuargsertyrtyralaser202530trptyrglnglnlysproglyglnalaprovalleuvaliletyrgly354045alaasnasnargproserglyileproaspargpheserglyserser505560serglyasnthralaserleuthrilethrglyalaglnalagluasp65707580glualaasptyrtyrcysasnseralaaspserserglyasnhisval859095valpheglyglyglythrlysleuthrvalleu100105<210>5<211>122<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成多肽<400>5glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysprosergln151015thrleuserleuthrcysthrvalserglyglyserilesersergly202530asptyrphetrpsertrpileargglnleuproglylysglyleuglu354045cysileglyhisilehisasnserglythrthrtyrtyrasnproser505560leulysserargvalthrileservalaspthrserlyslysglnphe65707580serleuargleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyr859095cysalaargaspargglyglyasptyrtyrtyrglymetaspvaltrp100105110glyglnglythrthrvalthrvalserser115120<210>6<211>108<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成多肽<400>6gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnglyileserargser202530tyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproserleuleu354045iletyrglyalaserserargalathrglyileproaspargpheser505560glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu65707580progluaspphealavaltyrtyrcysglnglnpheglyserserpro859095trpthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>7<211>449<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成多肽<400>7gluvalglnleuvalgluserglyg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