一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶及其 編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] PPAR(過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體）分子包括α、目和YΗ型，分布在各不同 組織，其功能涵蓋范圍之廣是現(xiàn)今已知的其它生物醫(yī)藥分子所難W比擬的，具體包括糖尿 病、肥胖和高血壓等代謝癥候群，而送些疾病正是二十一世紀(jì)人類面臨的主要醫(yī)藥衛(wèi)生問(wèn) 題。
[0003]PPARΥ2主要表達(dá)于脂肪組織及免疫系統(tǒng)，與脂肪細(xì)胞分化、機(jī)體免疫及膜島素抵 抗關(guān)系密切，是膜島素增敏劑喔哇焼二麗類藥物（troglitazone，TZDs)作用的祀分子，成 為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。
[0004] 選取哺乳動(dòng)物小鼠3T3-L1細(xì)胞系（小鼠前脂肪細(xì)胞）的PPARY2基因進(jìn)行目標(biāo) 位點(diǎn)打祀，有著其特殊性。首先，PPARY2基因與人類肥胖、免疫疾病等密切相關(guān)；其次， 3T3-L1細(xì)胞在一定條件的誘導(dǎo)下，能分化成成熟脂肪細(xì)胞，即在分化后的細(xì)胞里能檢出脂 肪粒。送樣，可W無(wú)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的條件下觀察PPARY2基因的修飾效果。較少的花費(fèi)就能進(jìn) 行對(duì)人們關(guān)必的肥胖問(wèn)題進(jìn)行較為簡(jiǎn)單有效的研究，對(duì)人類解決送類問(wèn)題有極大的參考價(jià) 值。
[0005] -直W來(lái)，生物學(xué)家在不斷探索對(duì)目的基因進(jìn)行定向改造和修飾。早期使用同源 重組方法，但其效率較低，通常只有10 6~10S，該方法主要在小鼠中應(yīng)用，而無(wú)法在其它哺 乳動(dòng)物等模式動(dòng)物中得到廣泛推廣。
[0006] 近些年來(lái)發(fā)展很快的鋒指核酸酶狂FN)應(yīng)用于精確基因組修飾的方法得到了很 大發(fā)展。Ζ?^由一個(gè)DNA識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶（Fokl)構(gòu)成。DNA識(shí)別域一般 由3~4個(gè)切s2-His2鋒指蛋白（zinc-fingers)串聯(lián)組成。每個(gè)鋒指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè) 特異的Η聯(lián)體堿基。兩個(gè)ZFN分別用鋒指結(jié)構(gòu)域識(shí)別5' -3'方向和3' -5'方向的DNA鏈， 兩個(gè)化kl核酸酶的催化活性功能域可W切割祀位點(diǎn)，激活DNA自我修復(fù)機(jī)制，達(dá)到刪除該 段的目的，另一方面，切割祀位點(diǎn)制造出雙鏈斷裂后，細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制被激活，DNA的同源重 組機(jī)制會(huì)將外源的同源片段復(fù)制到斷裂缺口上，從而達(dá)到引入外源基因片段的目的。雖然 該方法使基因祀向修飾技術(shù)大大提高，但卻存在祀向不確定、相對(duì)低效和脫祀問(wèn)題。研究者 很難根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)特異且高效的ZFN，而商品化的ZFN價(jià)格極昂貴，因此，在一定 程度上制約著該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。
[0007] 近年來(lái)，另一種基因改造新技術(shù)--CRISPR-Cas系統(tǒng)也正在迅猛發(fā)展，Cong、Mali 和化0送H個(gè)課題組開(kāi)展的多項(xiàng)研究都表明送種RNA介導(dǎo)的化s9系統(tǒng)在人類細(xì)胞當(dāng)中同 樣能夠正常發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)化賊性鏈球菌（Str巧tococ州Spyogenes)編碼的化s9 內(nèi)切酶進(jìn)行改造之后也可W讓它們?cè)谌祟惣?xì)胞的細(xì)胞核中被活化，然后再搭配針對(duì)人體 DNA序列設(shè)計(jì)的大約20bp長(zhǎng)的雙RNA復(fù)合體或者sgRNA，就可W對(duì)人體基因組進(jìn)行定點(diǎn)切 割和改造。但是送種技術(shù)仍然存在嚴(yán)重的脫祀的問(wèn)題。
[0008]轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子TALE(TranscriptionActivator-UkeEffector)最早 發(fā)現(xiàn)于植物病原體黃單胞菌狂anthomonas)在感染植物的過(guò)程中能特異性結(jié)合到DM上， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)植物基因的相關(guān)調(diào)控。TALE送種基因定制化潛力給基因修飾帶來(lái)了新突破。 TALE與化41融合后形成轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（TranscriptionActivator-Uke EffectorNucleases,TALE化），TALE化與ZFN打祀原理相似。TALE由兩側(cè)的N-末端、C-末 端序列和中間十幾個(gè)串聯(lián)"蛋白模塊"組成，而送些蛋白模塊能特異性識(shí)別某段DM。每個(gè) "蛋白模塊"包含34個(gè)氨基酸，第12和第13位殘基被稱作重復(fù)可變的RVD(Repeat-Vari油le Di-resi化es)位點(diǎn)，每個(gè)RVDs僅能識(shí)別一個(gè)堿基，即NG識(shí)別T，皿識(shí)別C，NI識(shí)別A，順識(shí) 別G。
[0009] 目前TALE化技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、果觸、動(dòng)物和人類細(xì)胞系、擬南芥、煙草和 水稻中。盡管已經(jīng)應(yīng)用于多種生物，但是由于選擇的識(shí)別位點(diǎn)的染色體結(jié)構(gòu)抑制，DNA修飾 或無(wú)效表達(dá)或者部分TALE化折疊等因素的影響，很多祀點(diǎn)仍然不能被檢測(cè)到基因修飾或 者效率很低。并且TALE化的打祀效率在細(xì)胞研究中，很大程度上與細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率有關(guān)， 常用細(xì)胞例如293T，外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率可達(dá)95%W上，而某些細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率非常低，例如 小鼠3T3-L1細(xì)胞系一般轉(zhuǎn)染只有30%，突變位點(diǎn)需要經(jīng)過(guò)多次酶切富集等手段才能檢測(cè) 出是否具有打祀活性，給TALE化打祀活性的檢測(cè)帶來(lái)了挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供一種對(duì)小鼠PPARY2基因具有準(zhǔn)確、高效識(shí)別功能的一對(duì)多膚，和W 該一對(duì)多膚為串聯(lián)"蛋白模塊"構(gòu)建的一對(duì)轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（TALES)，W及將TALES 與DM切割蛋白融合而形成的一對(duì)轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶燈ALE化），該TALE化能夠 準(zhǔn)確、高效地實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠PPARY2基因的祀向修飾。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一對(duì)多膚，該一對(duì)多膚分別具有如SEQID N0;1和SEQIDN0;2所示的氨基酸序列，或分別具有如SEQIDN0;3和SEQIDN0;4所示 的氨基酸序列。
[001引在第一方面中，一對(duì)多膚即TALES中的串聯(lián)"蛋白模塊"，分別識(shí)別并結(jié)合PPARY2 基因上兩個(gè)有一定間隔序列（Spacer)的祀序列。其識(shí)別規(guī)則即RVDs中的NG識(shí)別T，皿識(shí) 別C，NI識(shí)別A，順識(shí)別G。具體地，SEQIDNO;1所示的多膚序列識(shí)別祀序列SEQIDNO: 27,SEQIDNO; 2所示的多膚序列識(shí)別祀序列SEQIDNO;28,SEQIDNO; 3所示的多膚序 列識(shí)別祀序列SEQIDNO;29,SEQIDNO;4所示的多膚序列識(shí)別祀序列SEQIDNO; 30。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一對(duì)多核巧酸，該一對(duì)多核巧酸分別編碼如 第一方面中的一對(duì)多膚。
[0014] 在第二方面中，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，一對(duì)多核巧酸中的每一個(gè)的堿基序列并不 唯一，只要能夠編碼如第一方面中的一對(duì)多膚中的一個(gè)即可。
[0015] 作為本發(fā)明的優(yōu)選，在第二方面中的一對(duì)多核巧酸分別具有如SEQIDNO;5和SEQ IDN0;6所示的堿基序列，或分別具有如SEQIDN0;7和SEQIDN0;8所示的堿基序列。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的第Η方面，本發(fā)明提供一對(duì)蛋白質(zhì)，該一對(duì)蛋白質(zhì)由第一方面中的 一對(duì)多膚兩端分別加上轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架的天然或經(jīng)過(guò)人工改造的Ν 端和c端組成。
[0017]在第Η方面中，一對(duì)蛋白質(zhì)即一對(duì)轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（TALES)，它們分別由Η 部分構(gòu)成：Ν-末端序列、中間的串聯(lián)"蛋白模塊"（識(shí)別模塊）和C-末端序列，其中，中間的 串聯(lián)"蛋白模塊"即第一方面中的一對(duì)多膚中的一個(gè)，Ν-末端序列和C-末端序列即轉(zhuǎn)錄激 活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架Ν端和C端序列，它們可W是天然的或經(jīng)過(guò)人工改造的序 列，只要能保持其功能即可。
[0018] 作為本發(fā)明的優(yōu)選，在第Η方面中的一對(duì)蛋白質(zhì)分別具有如SEQIDNO;9和SEQ IDN0;10所示的氨基酸序列，或分別具有如SEQIDN0;11和SEQIDN0;12所示的氨基酸 序列。SEQIDNO;9~12所示的蛋白質(zhì)稱作轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子，其中SEQIDNO;9和 沈QIDNO;10 送對(duì)蛋白質(zhì)分別命名為PPARY2-TALE-L2 和PPARY2-TALE-R2,沈QIDNO: 11和沈QIDNO;12送對(duì)蛋白質(zhì)分別命名為PPARY2-TALE-L3和PPARY2-TALE-R3。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供一對(duì)多核巧酸，該一對(duì)多核巧酸分別編碼如 第Η方面中的一對(duì)蛋白質(zhì)。
[0020] 在第四方面中，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，一對(duì)多核巧酸中的每一個(gè)的堿基序列并不 唯一，只要能夠編碼如第Η方面中的一對(duì)蛋白質(zhì)中的一個(gè)即可。
[0021] 作為本發(fā)明的優(yōu)選，在第四方面中的一對(duì)多核巧酸分別具有如SEQIDNO;13和 SEQIDN0;14所示的堿基序列，或分別具有如SEQIDN0;15和SEQIDN0;16所示的堿基 序列。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供一對(duì)融合蛋白，該一對(duì)融合蛋白由第Η方面 中的一對(duì)蛋白質(zhì)分別與DNA切割蛋白融合而成。
[0023] 在第五方面中，一對(duì)融合蛋白即一對(duì)轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALE化），它 們分別由兩部分構(gòu)成：轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（TALES)和DNA切割蛋白，其中TALES的作用 在于識(shí)別并結(jié)合祀序列，DNA切割蛋白的作用在于切割DNA。
[0024] 作為本發(fā)明的優(yōu)選，在第五方面中的DNA切割蛋白為天然的或經(jīng)過(guò)人工改造的 Fok