一種大豆MYB類轉(zhuǎn)錄因子GmMYB29及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種大豆MYB類轉(zhuǎn)錄因子GmMYB29及其編碼基 因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 異黃酮是高等植物特有的次生代謝的產(chǎn)物，動物體內(nèi)不能合成。異黃酮對動植物 有著重要作用。在動物體內(nèi)具有雌激素、抗癌、抗氧化、抗溶血、治療心血管病、降低膽固醇、 預(yù)防骨質(zhì)疏松、促進(jìn)繁殖、泌乳和生長等多種生物功能。在植物體內(nèi)則可作為保護(hù)性物質(zhì)， 保護(hù)植物正常生長、抵制病原菌的侵害，同時也是根瘤菌與植物共生作用所必需的。異黃酮 主要分布在豆科的一些物種，近年來雖然也在其它高等植物中檢測到具有不同結(jié)構(gòu)類型的 異黃酮化合物，但大都以微量形式存在。豆科植物中大豆[Glycine Max(L. )Merr.]的異黃 酮含量較高，大約是許多其它豆科植物的100倍左右。異黃酮在食品、醫(yī)藥、美容、動物養(yǎng)殖 業(yè)和農(nóng)業(yè)中的巨大的應(yīng)用價值使國際市場對異黃酮的需求正在逐年增加。由于大豆是異黃 酮的主要來源，因此培育高異黃酮含量的專用型品種是大豆品質(zhì)育種的主要目標(biāo)之一。
[0003] 目前有研究通過對異黃酮途徑結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行修飾，利用基因工程的手段改良異黃 酮的合成，主要包括過表達(dá)異黃酮合成途徑的酶基因和降低其競爭途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)兩 方面。研究結(jié)果顯示過表達(dá)異黃酮合成途徑的個別酶基因雖然可以增加異黃酮的積累，但 增幅未達(dá)顯著水平。而抑制競爭途徑雖然能夠大幅度地提高異黃酮的含量，但是由于植株 中的黃酮、花青素及原花青素等重要代謝通路被阻斷，轉(zhuǎn)基因植株在非實驗室條件下難以 存活。對途徑單個基因的修飾難以達(dá)到理想的結(jié)果，因此目前研究又集中于對調(diào)控異黃酮 合成的轉(zhuǎn)錄因子的鑒定，利用轉(zhuǎn)錄因子激活或抑制異黃酮合成途徑中不同的結(jié)構(gòu)基因從而 定向控制異黃酮的產(chǎn)量是今后調(diào)控異黃酮合成的主要基因工程手段。大豆中目前僅鑒定出 兩個調(diào)控異黃酮的MYB類轉(zhuǎn)錄因子，仍有待深入的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種大豆MYB類轉(zhuǎn)錄因子GmMYB29。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供編碼該轉(zhuǎn)錄因子蛋白的基因。
[0006] 本發(fā)明的又一目的是提供該轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] 一種大豆]\^8類轉(zhuǎn)錄因子61111^829，具有3￡〇10從).2所示的氨基酸序列。
[0009] 編碼所述的大豆MYB類轉(zhuǎn)錄因子GmMYB29的基因GmMYB29。
[0010] 該基因GmMYB29的開放閱讀框具有如SEQ ID N0.1所示的DNA序列。
[0011] 含有所述的大豆MYB類轉(zhuǎn)錄因子GmMYB29編碼基因GmMYB29的重組質(zhì)粒。
[0012]本發(fā)明所述的重組質(zhì)粒，將編碼本發(fā)明大豆MYB類轉(zhuǎn)錄因子蛋白的基因GmMYB29插 入PBA002植物過量表達(dá)載體中得到的。該編碼所述的大豆MYB類轉(zhuǎn)錄因子蛋白的基因 GmMYB29具有SEQ ID N0.1所示的DNA序列。
[0013]本發(fā)明所述的大豆MYB類轉(zhuǎn)錄因子GmMYB29在培育高異黃酮大豆品種中的應(yīng)用。 [0014] 本發(fā)明所述的大豆MYB類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因GmMYB29在培育高異黃酮大豆品種中 的應(yīng)用。
[0015] 含本發(fā)明所述的大豆MYB類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因GmMYB29的重組質(zhì)粒在培育高異黃 酮大豆品種中的應(yīng)用。
[0016] 利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明GmMYB29基因?qū)?入植物細(xì)胞，可獲得異黃酮含量得到提高的轉(zhuǎn)基因植株。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá) 載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型的啟動子或誘導(dǎo)性啟動子。為了便 于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如可加入 植物中表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶 大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等）。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，也可不加入任何選擇性 標(biāo)記基因，直接以表型篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明的植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri 質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植 物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培養(yǎng)成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主是大豆、苜蓿、百脈根 等雙子葉豆科植物。
[0017] 有益效果：
[0018] GmMYB29的mRNA表達(dá)分析表明其組織表達(dá)模式與異黃酮合成關(guān)鍵酶基因IFS2 - 致，并與異黃酮類化合物的積累密切相關(guān)。雙熒光素酶報告系統(tǒng)的瞬時表達(dá)分析結(jié)果表明 GmMYB29能夠顯著促進(jìn)異黃酮合成關(guān)鍵酶基因IFS2和CHS8的啟動子表達(dá)活性提高。利用發(fā) 根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將攜帶有本發(fā)明GmMYB29的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大豆毛狀根，與對 照相比過表達(dá)GmMYB29的大豆毛狀根的異黃酮含量顯著提高了 1.6-3.3倍，說明61^￥829基 因在調(diào)控異黃酮生物合成方面起著重要作用，本發(fā)明的GmMYB29對培育高異黃酮含量的大 ii品種具有重要意義。
【附圖說明】
[0019] 圖1大豆不同組織中GmMYB29和IFS2基因的相對表達(dá)量及總異黃酮的含量。A: GmMYB29基因的組織表達(dá)分析;B: IFS2基因的組織表達(dá)分析;C:大豆異黃酮的組織積累模 式。圖中橫坐標(biāo)的1~12分別代表根、莖、葉、花，花蕾、開花后10天的莢皮、開花后10天種子， 開花后20天種子、開花后25天種子、開花后30天種子、開花后40天種子、開花后50天種子和 完全成熟的種子
[0020] 圖2 GmMYB29調(diào)控異黃酮合成關(guān)鍵基因IFS2和CHS8啟動子的瞬時表達(dá)活性分析。 A:GmMYB29調(diào)控IFS2啟動子的瞬時表達(dá)活性分析;B:GmMYB29調(diào)控CHS8啟動子的瞬時表達(dá)活 性分析。注:對照加入報告基因載體質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒;MYB29加入報告基因載體質(zhì)粒，內(nèi)參質(zhì) 粒及表達(dá)GmMYB29蛋白的效應(yīng)載體質(zhì)粒
[0021] 圖3為含有GmMYB29的植物表達(dá)載體示意圖
[0022] 圖4過表達(dá)GmMYB29的大豆毛狀根的GmMYB29的相對轉(zhuǎn)錄水平。注:GmMYB290El-4代 表4個不同的GmMYB29過表達(dá)毛狀根株系;**，P < 0.01; ***，P < 0.001。
[0023] 圖5過表達(dá)GmMYB29的大豆毛狀根的相對異黃酮含量。注:GmMYB290El-4代表4個不 同的GmMYB29過表達(dá)毛狀根株系；#，P < 0.01; *#，P < 0.001。
【具體實施方式】
[0024] 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。
[0025] 下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā) 明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0026] 在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同引物，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
[0027] 下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0028] 實施例1、大豆GmMYB29及其編碼基因GmMYB29的cDNA克隆與鑒定 [0029]用植物總RNA提取試劑盒(購自天根公司）提取大豆品種Wi 11 iams 82葉片總RNA， 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。cDNA的合成參照TaKaRa Primer Script ?RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒說明操作。設(shè)計引物：
[0030] GmMYB29-F:'5-CGGGTCTTTGGAAACGAA-3'（SEQ ID N0.3)
[0031 ] GmMYB29-R:'5-CGCATTACTCTGGCTGGT-3'（SEQ ID N0.4);
[0032] 按照以下組份順序配制PCR反應(yīng)液（50yl體系）：25yl 10XPCR Buffer、9yl (1(1112〇、1(^1(1階？、1.5沿引物（5￡〇10勵.3和5￡〇10勵.4)、241。0嫩和1411(00卩父酶。反 應(yīng)在BIO-RAD PTC-200型PCR儀上進(jìn)行，其程序為94°C變性2min;再98°C 10sec，53°C 30sec，68°C 2min，共33個循環(huán);然后68°C延伸7min;4°C保存。PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)連接PMD19-T載體(TaKaRa)、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a、藍(lán)白斑篩選、搖菌、測序，序列如SEQ ID NO. 1所示。 [0033] 實施例2、GmMYB29在大豆不同組織的表達(dá)分析
[0034]大豆品種監(jiān)利牛毛黃在正常田間生長條件下，盛花期取根、莖、葉、花，開花后10天 (10DAF)取莢皮和種子，取20DAF、25DAF、30DAF、40DAF、50DAF和完全成熟的種子，采集的所 有樣品液氮速凍并于-80 °C保存?？俁NA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)同實施例1。以大豆組成型表達(dá) 的Tubulin基因作為內(nèi)參基因，特異性引物及Taq Man-MGB探針序列如下：
[0035] 擴(kuò)增GmMYB29的特異性引物及探針：
[0036] 上游引物：5，-GCCAGGAAGAACTGACAATGAGA-3，（SEQ ID N0.5)
[0037] 下游引物：5，-TGGAATTGGAATCAGAACGITTAAT-3，（SEQ ID N0.6)
[0038] MGB探針：5，-AGTCCAAGCCAAGTTCCAAAAGAGCCAC-3，（SEQ ID N0.7)
[0039] 擴(kuò)增GmIFS2的特異性引物：
[0040] 上游引物：5'-ATGAAGTATATAAGCCCTTC-3'（SEQ ID N0.8)
[0041] 下游引物：5，-TTGGGATAAATGATGTGGCAACT-3，（SEQ ID N0.9)
[0042] 擴(kuò)增Tublin的特異性引物：
[0043] 上游引物：5，-GGAGITCACAGAGGCAGAG-3，（SEQ ID N0.10)
[0044] 下游引物：5'-CACTTACGCATCACATAGCA-3'（SEQ ID N0.11)
[0045]以不同組織的cDNA為模板，進(jìn)行實時熒光定量PCR分析。結(jié)果表明，G