一種水線草中雞矢藤苷甲酯的提取分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥提取分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水線草中雞矢藤苷甲酯的提取 分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命的的重大疾病。據(jù)統(tǒng)計，惡性腫瘤已成為城鄉(xiāng)居民的首 要死因，而且呈現(xiàn)年輕化合逐年上升趨勢，全國癌癥的平均5年存活率僅為25 %左右，可見 腫瘤的預(yù)防和治療十分迫切。藥物治療是腫瘤的主要治療手段，雖然目前已經(jīng)開發(fā)了數(shù)十 種抗腫瘤藥物，有效延長了患者生命或者提高了患者生存質(zhì)量，但是腫瘤的藥物研究還是 面臨著巨大挑戰(zhàn)，抗癌藥物多有細(xì)胞毒藥物，副作用多；而中藥有幾千年的人體毒性實驗的 基礎(chǔ)，從天然產(chǎn)物中尋找高效低毒的抗腫瘤活性化合物一直是研究熱點。
[0003] 水線草，又名傘房花耳草，為茜草科一年生草本植物，耳草屬植物水線草Hedyotis corymbosa(L.)的干燥全草。苦、寒，入肺、大腸二經(jīng);具有清熱解毒之功效，常用于燙傷，與 常山、馬鞭草混合煎服能治瘧疾。目前臨床上，水線草的主要用途是與白花蛇舌草混用治療 癌癥(南京新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典.上海.上海科學(xué)技術(shù)出版社，1977: 535 .)，但其抗腫瘤物 質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。
[0004] 水線草中主含的化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜及其苷類和三萜酸類化合物。雞矢藤苷甲酯 (又稱雞屎藤苷甲酯)為環(huán)烯醚萜類化合物，是從水線草中分離得到的。早在1988年，就有研 究表明雞矢藤苷甲酯及其相關(guān)衍生物具有抗腫瘤和抗氧化活性。（Ishig Ur〇，Ky〇k〇; Yamaki，Masae;Takagi，Shuzo;Ikeda，Yoshiaki;Kawakami，Kiyotaka;Ito，Keizo;Nose， TakashiStudies on iridoid-related compounds.V.Anti tumor activity of iridoid derivatives periodate oxidation products.Journal of Pharmacobio-Dynamics (1988)，ll(2)，131-6.)。
[0005] 目前尚未檢索到水線草中雞矢藤苷甲酯提取分離方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種水線草中雞矢藤苷甲酯的提取分離方法。
[0007] 為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] -種水線草中雞矢藤苷甲酯的提取分離方法，包括以下步驟：
[0009] 1)將水線草用醇溶劑進(jìn)行提取，得到水線草醇提物；
[0010] 2)將所得水線草醇提物分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取;取正丁醇萃取 部位，濃縮得精提浸膏；
[0011] 3)將所述精提浸膏用甲醇超聲溶解，過濾，濾液硅膠拌樣后經(jīng)正相硅膠柱層析，用 洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液;所述洗脫劑為氯仿-甲醇洗脫劑，和/或二氯甲烷-甲醇 洗脫劑；
[0012] 4)將步驟3)所述洗脫液采用柱層析分離法或制備液相分離法進(jìn)一步純化，制得雞 矢藤苷甲酯；
[0013] 所述柱層析分離法包括將步驟3)所得洗脫液采用葡聚糖凝膠柱層析，以氯仿-甲 醇作為洗脫劑;收集洗脫液后經(jīng)0DS反相柱層析，以甲醇溶液等度洗脫或者梯度洗脫，收集 洗脫液，制得雞矢藤苷甲酯；
[0014] 所述制備液相分離法包括將步驟3)所得洗脫液進(jìn)制備液相，以甲醇水為流動相進(jìn) 行洗脫，制得雞矢藤苷甲酯;所述制備液相采用LC-3000高效液相Thermo C18(250*21.2mm) 制備柱。
[0015] 上述水線草中雞矢藤苷甲酯的提取分離方法，其中：
[0016] 步驟1)中優(yōu)選先將水線草粉碎再進(jìn)行提取，優(yōu)選為60-80目；所述提取溫度優(yōu)選為 60-80°C;所述醇溶劑為乙醇或甲醇溶劑，優(yōu)選為甲醇溶劑;所述醇溶劑的濃度為50%_70% (質(zhì)量濃度），優(yōu)選70 % (質(zhì)量濃度）；更優(yōu)選為70 %的甲醇（質(zhì)量濃度）；所述提取方法為回流 提取、超聲提取、浸漬提取等方法中的一種或幾種;優(yōu)選為回流提取;所述醇溶劑的用量為 水仙草重量的8-15倍，優(yōu)選為10倍。
[0017] 為盡量將水仙草中雞矢藤甲酯提取出來，步驟1)優(yōu)選包括將水線草粉碎至60-80 目，加入8-15倍重量的70 %甲醇（質(zhì)量濃度），攪勻，先超聲提取0.5-lh，然后回流提取l-3h， 提取溫度為60_8(TC ;過濾;濾渣按上述方法再次進(jìn)行超聲提取、回流提取;共提取三次，合 并濾液，減壓濃縮得到水線草醇提物(即粗提浸膏）。
[0018] 步驟2)所述石油醚萃取優(yōu)選為將步驟1)所得水線草醇提物用石油醚萃取3-5次， 所述與石油醚的用量(重量)比例為1-3:4-6;萃取后保留水部位。
[0019]步驟2)所述乙酸乙酯萃取優(yōu)選為將石油醚萃取后所述水部位用乙酸乙酯萃取3-5 次，石油醚萃取后所述水部位與乙酸乙酯的用量（重量）比例為1-3:4-6;萃取后保留水部 位。
[0020] 步驟2)所述正丁醇萃取優(yōu)選為將乙酸乙酯萃取后所述水部位用正丁醇萃取3-5 次，乙酸乙酯萃取后所述水部位與正丁醇的重量比例為1-3:4-6;萃取后保留正丁醇萃取部 位。
[0021] 取正丁醇萃取部位，濃縮(例如減壓濃縮)得精提浸膏。
[0022]按上述方法萃取處理后，最大限度地去除了所述水線草醇提物中雜質(zhì)。
[0023] 步驟3)優(yōu)選將所述精提浸膏用3-5倍重量的甲醇超聲溶解，再進(jìn)行過濾。
[0024] 步驟3)所述梯度洗脫包括以氯仿-甲醇為洗脫劑，分別以氯仿：甲醇(體積比）為7: 1，5:1，3:1進(jìn)行第一次梯度洗脫，收集氯仿：甲醇為7:1的洗脫液;再以氯仿-甲醇為洗脫劑， 分別以氯仿：甲醇(體積比）為12:1，9 :1，7:1，5:1，3:1進(jìn)行第二次梯度洗脫，收集氯仿：甲醇 為7:1的洗脫液;或者以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑，分別以二氯甲烷：甲醇(體積比）為12:1， 9:1，7:1，5:1，3:1進(jìn)行第二次梯度洗脫，收集二氯甲烷：甲醇為7:1的洗脫液。
[0025]本發(fā)明所述第二次梯度洗脫是指收集第一次洗脫液，硅膠拌樣經(jīng)正相硅膠柱層 析，進(jìn)行第二次洗脫。
[0026]步驟3)優(yōu)選采用100-200目的正相硅膠柱層析。
[0027]步驟4)所述葡聚糖凝膠柱層析，以氯仿：甲醇(體積比）60 :40為洗脫劑進(jìn)行洗脫； 所述0DS反相柱層析，以30%甲醇溶液（質(zhì)量濃度）進(jìn)行等度洗脫或者以20-50%甲醇溶液 (質(zhì)量濃度)進(jìn)行梯度洗脫。
[0028] 所述0DS反相柱是指十八烷基硅烷反相柱。
[0029] 具體地，步驟4)所述柱層析分離法包括將步驟3)所得洗脫液采用葡聚糖凝膠柱層 析，用氯仿：甲醇體積比為60:40的洗脫劑進(jìn)行洗脫；收集洗脫液后經(jīng)DMS0反相柱層析，用 30%甲醇溶液等度洗脫或者20-50%甲醇溶液梯度洗脫，收集洗脫液，制得雞矢藤苷甲酯。
[0030] 步驟4)所述制備液相分離法先將步驟3)所得洗脫液經(jīng)0.22M1微孔濾膜過濾，再取 濾液進(jìn)制備液相。
[0031] 所述洗脫劑為25%甲醇水。
[0032] 所述制備液相使用LC-3000高效液相Thermo C18(250*21.2mm)制備柱。
[0033] 具體地，步驟4)所述制備液相分離法包括將步驟3)所得洗脫液經(jīng)0.22M1微孔濾膜 過濾，取濾液進(jìn)制備液相，以25 %甲醇水為洗脫劑等度洗脫，收集洗脫液，制得雞矢藤苷甲 酯;所述制備液相使用LC-3000高效液相Thermo C18，（250*21.2mm)制備柱。
[0034] 較佳地，本發(fā)明所述水線草中雞矢藤苷甲酯的提取分離方法，包括以下步驟：
[0035] 1)將水線草粉碎至60-80目，加入8-15倍重量的70%甲醇，攪勻，先超聲提取0.5- lh，然后回流提取l-3h，提取溫度為60-80°C ;過濾;濾渣按上述方法再次進(jìn)行超聲提取、回 流提取;共提取三次，合并濾液，減壓濃縮得到水線草醇提物；
[0036] 2)將所得水線草醇提物分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取;取正丁醇萃取 部位，濃縮得精提浸膏；
[0037]所述石油醚萃取為將步驟1)所得水線草醇提物用石油醚萃取3-5次，所述水線草 醇提物與石油醚的用量(重量)比例為1-3:4-6;萃取后保留水部位；
[0038] 所述乙酸乙酯萃取為將石油醚萃取后所述水部位用乙酸乙酯萃取3-5次，石油醚 萃取后所述水部位與乙酸乙酯的用量(重量)比例為1-3:4-6;萃取后保留水部位；
[0039]所述正丁醇萃取優(yōu)選為將乙酸乙酯萃取后所述水部位用正丁醇萃取3-5次，乙酸 乙酯萃取后所述水部位與正丁醇的用量(重量）比例為1-3:4-6;萃取后保留正丁醇萃取部 位；
[0040] 3)將所述精提浸膏用3-5倍重量的甲醇超聲溶解，過濾，濾液硅膠拌樣后經(jīng)100- 200目正相硅膠柱層析，用洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液；
[0041 ]具體地，所述梯度洗脫以氯仿-甲醇為洗脫劑，分別以氯仿：甲醇體積比為7 :1，5: 1，3:1進(jìn)行第一次梯度洗脫，收集氯仿：甲醇為7:1的洗脫液;再以氯仿-甲醇為洗脫劑，分別 以氯仿：甲醇體積比為12:1，9:1，7:1，5:1，3:1進(jìn)行第二次梯度洗脫，收集氯仿：甲醇為7:1 的洗脫液;或者以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑，分別以二氯甲烷：甲醇體積比為12:1，9:1，7:1， 5:1，3:1進(jìn)行第二次梯度洗脫，收集二氯甲烷：甲醇為7:1的洗脫液；
[0042] 4)將所述第二次梯度洗脫液采用柱層析分離法或制備液相分離法進(jìn)行進(jìn)一步純 化，得到雞矢藤苷甲酯；
[0043] 所述柱層析分離法包括將步驟3)所得第二次梯度洗脫液采用葡聚糖凝膠柱層析， 用氯仿：甲醇體積比為60:40的洗脫劑進(jìn)行洗脫;收集洗脫液后經(jīng)0DS反相柱層析，用30 %甲 醇溶液等度洗脫或者20-50%甲醇溶液梯度洗脫，收集洗脫液，制得雞矢藤苷甲酯；
[0044] 所述制備液相分離法包括將步驟3)所得第二次梯度洗脫液經(jīng)0.22wii微孔濾膜過 濾，取濾液進(jìn)制備液相，以25%甲醇水為洗脫劑等度洗脫，收集洗脫液，制得雞矢藤苷甲酯； 所述制備液相使用LC-3000高效液相Thermo C18(250*21.2mm)制備柱。
[0045]本發(fā)明所述雞矢藤苷甲酯結(jié)構(gòu)如下式(I)所示：
⑴
[0047]本發(fā)明所述水線草，又名傘房花耳草，為茜草科一年生草本植物，耳草屬植物水線 草Hedyotis corymbosa(L.)的干燥全草。
[0048]本發(fā)明有益效果
[0049] 本發(fā)明方法分離水線草中雞矢藤苷甲酯成分的產(chǎn)率高，方法簡便快捷，純度高;所 得雞矢藤苷甲酯可用于制成抗腫瘤的輔助藥物，為研發(fā)抗癌藥物提供一定的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0050] 圖1為雞矢藤苷甲酯紫外吸收圖。
[0051] 圖2為雞矢藤苷甲酯質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0052]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用 試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購買得到的常規(guī)產(chǎn)品。
[0053] 實施例1
[0054]本實施例提供一種水線草中雞矢藤苷甲酯的提取分離方法，包括以下步驟：
[0055] 1)稱取粉碎至60目的水線草10kg，加入100L體積的70 %甲醇(質(zhì)量濃度），攪勻，先 超聲提取30min，然后80°C下